酶法制备右旋糖酐硒聚物的方法与流程

本发明属于硒化多糖制备技术领域，尤其涉及一种酶法制备右旋糖酐硒聚物的方法。

背景技术：

硒是维持人体和动物正常生理功能所必须的微量元素之一，它在提高机体免疫力、保护神经系统、抗氧化、抗肿瘤等方面都发挥着重要作用。无机硒主要存在土壤、水、大气等自然环境中，一般指单体硒以及亚硒酸、亚硒酸盐等无机化合物。其在体内停留时间相对较短，多余的硒会随着尿液很快排泄出体外，生物相容性较低，毒副作用较强。有机硒主要存在于动植物体内，主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白质等有机化合物。人体缺硒会导致多种疾病，硒多糖作为一种理想的补硒剂，可以根据人体的缺硒情况来进行动态储存和缓释释放，以满足机体补硒的目的。

硒多糖既保持了多糖较高的生物利用率和参与机体生理代谢的特点，又具有硒的生物功能，且毒性和副作用大大降低，生物活性普遍高于硒和多糖。自然界中只有少数植物和微生物能够低含量合成天然硒多糖，由于植物和微生物的硒富集作用是有限的，从而导致天然硒多糖含量较少，甚至富硒地区的天然硒多糖的含量也没有达到理想程度。

目前，人工合成硒多糖的方法主要包括化学合成法、植物转化法和微生物转化法。然而，硒多糖的合成方法各有其限制条件，如化学合成的反应条件较为剧烈，反应步骤多；植物转化法生产周期较长，得率较低，但产物的活性较高；微生物转化法生成的产物难以进行分离纯化，但得到的硒多糖较为稳定，不易分解。所以，目前人工合成硒多糖的方法还有待进一步的深入研究，探索出更加绿色的硒多糖合成方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种反应条件温和、硒化效率高、硒聚物得率较高的酶法制备右旋糖酐硒聚物的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

酶法合成右旋糖酐硒聚物的方法，以右旋糖酐蔗糖酶为催化剂，以蔗糖和亚硒酸钠为底物，经酶催化反应合成右旋糖酐硒聚物。

上述酶法合成右旋糖酐硒聚物的方法，包括以下步骤：

(1)用肠膜明串珠菌发酵产右旋糖酐蔗糖酶制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液；

(2)将步骤(1)所得的粗酶液加入聚乙二醇构建peg/dextran双水相体系，低温下静置分层后进行高速冷冻离心，下层即为分离纯化后的右旋糖酐蔗糖酶；

(3)将步骤(2)所得的右旋糖酐蔗糖酶与蔗糖、亚硒酸钠混合；

(4)将步骤(3)所得的产物依次进行醇沉、真空冷冻干燥，即得固体右旋糖酐硒聚物。

步骤3)按以下操作进行：以20mmol/l醋酸钠溶液为溶剂，配制蔗糖溶液，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温后，加入na2seo3于配制好的蔗糖底物溶液中，震荡使其充分溶解，加入右旋糖酐蔗糖酶；将该反应体系置于恒温摇床中进行反应，反应条件温度为25℃，转速150r/min，时间30h，即得所需发酵液。将纯化后的酶液加入适量去离子水稀释混合均匀，采用dns法测定酶活。

所述蔗糖溶液浓度为0.2-0.6mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.2-0.6u/ml，na2seo3的浓度为0.5-2.0mg/l。

步骤1)按以下操作进行：将肠膜明串珠菌在固体培养基斜面试管中25℃培养24-26h后进行复活，接种至固体培养基划线；挑取2环长势良好的单菌落接种至种子培养基；在25℃，摇床转速为150r/min的条件下培养至菌体生长对数期，以2％的接种量接种于产酶培养基中，培养10-12h；然后将培养液在转速为12000r/min，4℃低温的条件下离心20min去除菌体，收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。

步骤2)按以下操作进行：按质量比粗酶液:聚乙二醇6000:去离子水＝4:3:1混合，充分震荡后静置于4℃下12h，再于4℃，12000r/min条件下离心20min，除去上清液，下相即为纯化后的酶液。

步骤4)按以下操作进行：将得到发酵液与3倍体积体积分数为95％的乙醇溶液混合，搅拌0.5h后，倒出剩余液体，上述醇沉步骤重复进行三次，再加入1倍体积的丙酮，搅拌15min后，取出固体样品，自然风干，放入真空冷冻干燥机干燥48h，研磨即得右旋糖酐硒聚物粉末。

酶法是糖苷化的有效方法且具有较高的选择性，通常只有单一底物或结构类似的一类底物可参与反应，副反应极少或者没有，被广泛誉为高端生物制品工业化生产的首选技术。据此，针对目前硒化多糖制备研究中存在的问题，发明人建立了一种酶法合成右旋糖酐硒聚物的方法，以右旋糖酐蔗糖酶为催化剂，以蔗糖和亚硒酸钠为底物，经酶催化反应合成右旋糖酐硒聚物。该法通过右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖和亚硒酸钠，一步合成右旋糖酐硒聚物，它利用右旋糖酐聚合过程不断产生的新生态葡萄糖苷键对硒原子进行糖苷化，实现硒多糖高产率和高立体选择性、开发高效的糖苷化反应的有益探索，为多糖修饰提供新思路和参考。试验表明，本发明克服了化学合成反应步骤多、反应条件剧烈、副产物较多等问题，具有应体系简单、原料来源广泛、反应条件温和、硒化效率和硒聚物得率较高等特点；同时，本发明减少了有毒化学试剂作为反应介质的使用，副产物较少且利于分离纯化，不会对环境造成污染。

附图说明

图1是使用hpgfc色谱检测乙醇和丙酮对产物体系纯化的效果图，图中：上为纯化前，下为纯化后。

图2是本发明所得右旋糖酐硒聚物的红外光谱图。

图3是右旋糖酐蔗糖酶酶活力的测定流程图。

具体实施方式

本发明的酶法合成右旋糖酐硒聚物的方法，包括以下步骤：

(1)用肠膜明串珠菌发酵产右旋糖酐蔗糖酶制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液：将肠膜明串珠菌(leuconostocmesenterorides，cicc-21724)在固体培养基斜面试管中25℃培养24-26h后进行复活，接种至固体培养基划线；挑取2环长势良好的单菌落接种至种子培养基；在25℃，摇床转速为150r/min的条件下培养至菌体生长对数期(20-24h)，以2％的接种量接种于产酶培养基中，培养10-12h；然后将培养液在转速为12000r/min，4℃低温的条件下离心20min去除菌体，收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。

其中，培养基和溶剂的配制方法如下：

固体培养基：蔗糖13g、kh2po40.03g，na2hpo40.14g，琼脂2g，蛋白胨0.2g，蒸馏水100ml，ph7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

种子培养基：蔗糖5g、kh2po40.03g，na2hpo40.14g，蛋白胨0.2g，酵母膏1g，蒸馏水100ml，ph6.8，121℃高压蒸汽灭菌20min。

产酶培养基：蔗糖5g、kh2po40.1g，na2hpo40.36g，酵母膏1.25g，牛肉膏2g，蒸馏水100ml，ph7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)将所得的粗酶液加入聚乙二醇构建peg/dextran双水相体系，按质量比粗酶液:聚乙二醇6000:去离子水＝4:3:1混合，充分震荡后静置于4℃下12h，再于4℃，12000r/min条件下高速冷冻离心20min，除去上清液，下相即为分离纯化后的右旋糖酐蔗糖酶的酶液。

(3)构建右旋糖酐硒聚物的酶法合成体系：以20mmol/l醋酸钠溶液(冰醋酸调节ph至5.4)为溶剂，配制蔗糖溶液，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温后，加入na2seo3于配制好的蔗糖底物溶液中，震荡使其充分溶解，加入右旋糖酐蔗糖酶；将该反应体系置于恒温摇床中进行反应，反应条件温度为25℃，转速150r/min，时间30h，即得所需发酵液。将纯化后的酶液加入适量去离子水稀释混合均匀，采用dns法测定酶活。

蔗糖溶液浓度为0.2-0.6mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.2-0.6u/ml，na2seo3的浓度为0.5-2.0mg/l。

其中，右旋糖酐蔗糖酶酶活力的测定方法如下(见图3)：

利用dns还原糖法测定右旋糖酐蔗糖酶单位时间内催化蔗糖分解生成果糖的量，并定义在25℃条件下，1min内催化底物蔗糖生成1μmol果糖所需要的酶量为一个酶活单位(u)。

式中：

m----果糖质量(mg)；m----果糖摩尔质量180.16(g/mol)；t----反应时间(min)。

dns试剂：溶液a：127.5g酒石酸钾钠、440ml1％的3，5-二硝基水杨酸溶液、150ml10％naoh；溶液b：3.45g苯酚溶于7.6ml10％naoh中，加27ml蒸馏水，3.45g亚硫酸氢钠。溶液a、b混合后即得dns，贮于棕色瓶中，室温保藏7天后使用。

(4)去除小分子物质：将得到发酵液与3倍体积体积分数为95％的乙醇溶液混合，搅拌0.5h后，倒出剩余液体，上述醇沉步骤重复进行三次，再加入1倍体积的丙酮，搅拌15min后，取出固体样品，自然风干，放入真空冷冻干燥机干燥48h，研磨即得右旋糖酐硒聚物粉末。

使用hpgfc色谱检测乙醇和丙酮对产物体系纯化的效果，具体如下：采用“柱串连(ks-guard+ks-805+ks-801)hpgfc法”，其中，rid和柱温箱温度分别设定为33℃和65℃；流动相(超纯水)的流速为1.0ml/min；进样量为20μl。

以下实施例参照以上方法制备合成右旋糖酐硒聚物。

实施例1

操作步骤、条件、参数基本同上法，其中，蔗糖溶液浓度为0.4mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.4u/ml，na2seo3的浓度为0.5g/l。

实施例2

操作步骤、条件、参数基本同上法，其中，蔗糖溶液浓度为0.4mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.4u/ml，na2seo3的浓度为1.0g/l。

实施例3

操作步骤、条件、参数基本同上法，其中，蔗糖溶液浓度为0.4mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.4u/ml，na2seo3的浓度为2.0g/l。实施例4

操作步骤、条件、参数基本同上法，其中，蔗糖溶液浓度为0.2mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.4u/ml，na2seo3的浓度为1.0g/l。

实施例5

操作步骤、条件、参数基本同上法，其中，蔗糖溶液浓度为0.6mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.4u/ml，na2seo3的浓度为1.0g/l。

实施例6

操作步骤、条件、参数基本同上法，其中，蔗糖溶液浓度为0.4mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.2u/ml，na2seo3的浓度为1.0g/l。

实施例7

操作步骤、条件、参数基本同上法，其中，蔗糖溶液浓度为0.4mol/l，右旋糖酐蔗糖酶的酶活为0.6u/ml，na2seo3的浓度为1.0g/l。

使用hpgfc色谱检测以上实施例中乙醇和丙酮对产物体系纯化的效果，结果如图1所示，可以直观看出纯化前后体系中各组分的变化。纯化前，体系中除了目标产物右旋糖酐硒聚物，还含有未参与反应的少量蔗糖，蔗糖分解后产生的果糖，还有微量的葡萄糖副产物；纯化后，体系中只检测到右旋糖酐硒聚物，分离纯化的效果较好。并且产物的分子量范围在10⁵～10⁷da。

对实施例所得右旋糖酐硒聚物采用红外光谱确认，结果如图2所示，产物的红外图谱具有在3265cm^-1有一宽大的吸收峰对应分子中的羟基(-oh)的伸缩振动；2937cm^-1为c—h伸缩振动吸收峰，在1640cm^-1有一个尖长的强吸收峰，对应羟基(-oh)的弯曲振动吸收峰；在1139，1109和1050cm^-1处光谱中发现的主要特征带是由于c-o和c-c键的价振动以及cch，coh和hco键的变形振动；在1109cm^-1处的峰值是由于葡萄糖残基的c-4位置处的c-o键的振动；在998cm^-1处的峰由于醇羟基变形振动引起的；925cm^-1出现一个强吸收峰，为c-o-se伸缩振动。

结果表明：硒化基团成功接枝到右旋糖酐上，合成了右旋糖酐硒聚物。