一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，涉及基因、蛋白质工程技术领域，具体涉及一种黑曲霉dna光修复酶基因及其构建方法。

背景技术：

随着科学技术的发展，人类破坏自然的活动加剧，造成大气中臭氧层稀薄甚至产生空洞，阻挡紫外线的能力减弱。于是到达地球表面的中波紫外线(uvb，280nm-315nm)剂量逐渐增强，导致人类各种皮肤损伤的发病几率大大增加。其原理是uvb能直接被皮肤细胞dna吸收，引起dna上两个相邻的胸腺嘧啶产生稳定共价结合的二聚体，包括环丁烷嘧啶二聚体(cpd)和6-4光产物(6-4photoproduct)，这两类二聚体破坏dna正常结构，从而抑制dna的复制与转录，引起细胞内信号通路的紊乱，从而造成皮肤疾病甚至是皮肤癌。

光修复酶是一类在细菌、真菌、植物和动物中都普遍存在，在修复紫外线造成的dna损伤中发挥重要作用的酶。自然条件下cpd与6-4光产物这两类光致损伤分别占损伤总量的80-90％和10-20％，分别由cpd光修复酶和6-4光修复酶进行修复。光修复酶通常是一类单体蛋白，以非共价的形式结合了1到2种具有发色团的辅酶，其中一种是fad，为最常见的黄素辅酶形式。与自然界中利用nadh或是亚铁血红素类似，fad作为电子传递的中间体，可以通过得失一个或是两个电子完成氧化还原反应，传递电子。fad主要存在三种基本形式：完全氧化型(oxidized，ox)；单电子还原态即自由基型(semiquinone，sq)；双电子还原态即完全还原型(hydroquinone，hq)。在光修复酶中，必须依赖双电子还原态fad辅酶执行功能。

cpd光修复酶和6-4光修复酶两者具有高度同源的氨基酸序列和极其相似的结构，并且反应机制也大致相同。含有底物的dna双链靠近光修复酶，双链打开，损伤的dna会深入到光修复酶的底物结合口袋，形成一种酶-底物的复合物。在光照条件下，光修复酶中完全还原型状态(hydroquinone，hq)的fad通过直接吸收光子的能量，或是通过第二辅酶传递到hq，形成激发态hq，接着hq激发态上的电子传递到dna损伤底物上，使得二聚体的底物断裂成正常的胸腺嘧啶，dna结构恢复。最后，额外的电子会传递到中性自由基状态的fadh●，还原为fadh^-，整个修复过程极其短暂。尽管两类光修复酶同源性较高，但是两类光修复酶作用底物十分专一，只能修复特定的底物，而不能互换。

自1999年德国科学家报道光修复酶修复受损人类臀部皮肤的研究后，将光修复酶作为化妆品的添加成分，逐渐成为防晒产品的主流。以往研究人员对cpd光修复酶的研究已经很充分了，而对于6-4光修复酶的研究较为稀缺。

技术实现要素：

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的第1个技术问题是提供了一种黑曲霉6-4光修复酶基因。

本发明所要解决的第2个技术问题提供是含有该基因的表达载体。

本发明所要解决的第3个技术问题是含有该基因的宿主细胞。

本发明所要解决的第4个技术问题是所述光修复酶的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶基因，该6-4光修复酶具有seqidno.1的核苷酸序列。

一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶基因的编码蛋白，该编码蛋白具有seqidno.2的氨基酸序列。

一种载体，所述的载体为重组质粒，该重组质粒含有所述的定点突变的黑曲霉6-4光修复酶基因的pet-22b(+)重组质粒。

一种宿主，所述的宿主为定点突变的黑曲霉6-4光修复酶重组工程菌，该工程菌为大肠杆菌且含有所述的重组质粒表达载体，以及核苷酸序列。

该工程菌表达黑曲霉6-4光修复酶蛋白的条件为0.5mm-1mm的iptg诱导浓度及20℃的诱导温度。

本发明的构建方法为从现有的野生型(wild-type,wt)黑曲霉(aspergillusniger)中获得6-4光修复酶基因基因序列，进行人工密码子优化之后，设计突变引物得到突变体的基因s460n，其编码如seqidno:1所示的氨基酸序列，连接基因片段与pet22b质粒，构建出重组表达质粒pet22b-s460n；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于光修复酶表达的基因工程菌rosetta(de3)/pet22b-s460n；在20℃和1mmiptg条件下获得了较好的表达。

所述的黑曲霉6-4光修复酶生物医药、化妆品领域的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明采用定点突变(site-specificmutagenesis或site-directedmutagenesis)的方法改造蛋白：通过在目的dna片段(质粒，基因组)中某些目标位点引入特定的变化(包括碱基的添加，删除，点突变)，通过聚合酶链式反应(pcr)方法将某个目的基因的特定碱基突变(碱基缺失或者插入)，从而改变翻译出来的氨基酸序列，以及随之折叠成的蛋白质的空间结构和发挥的功能。

本发明通过体外表达黑曲霉6-4光修复酶，进行功能和应用性研究，为体外修复和治疗紫外线造成的皮肤损伤提供方向。比较cpd光产物和6-4光产物可知，6-4光产物比cpd光产物更具有致突变性，它能直接引起细胞的凋亡，而cpd光产物仅仅造成细胞周期暂时或短期的停滞现象，因此，对6-4光修复酶的研究就具有重要的意义。相比于野生型黑曲霉6-4光修复酶，本发明表达出的s460n突变体酶活力提高，而且活性保持更加持久稳定。

附图说明:

图1为实施例1中pcr扩增的s460n突变体基因

泳道1-2为s460n的突变体基因。

图2为实施例1所制的s460n突变体酶纯化的sds-page电泳图

泳道1-3为纯化蛋白分管收集样品，m为低分子量标准蛋白。

图3为wt光修复酶活性检测示意图

wt：检测的是第0min、7min、15min、25min、40min、90min的底物变化过程。

图4为实施例1所制的s460n突变体酶活性检测示意图

s460n：检测的是第0min、4min、10min、15min、25min、90min的底物变化过程

图5为实施例1所制的s460n突变体酶及wt光修复酶酶活性曲线

s460n：检测的是第0min、30s、1min、2min、4min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min的底物325nm吸收峰变化曲线。

wt：检测的是第0min、30s、1min、2min、4min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min的底物325nm吸收峰变化曲线。

图6为实施例1所制的s460n突变体酶及wt光修复酶酶活性曲线

s460n：检测的是第1、2、3、5、7、15天的酶活性变化。

wt：检测的是第1、2、3、5、7、15天的酶活性变化。

具体实施方式:

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：突变体酶s460n基因的获得以及表达载体的构建

1、获得wt黑曲霉光修复酶基因

查找genbank(genebankaccessionxp_001397458.2)的黑曲霉光修复酶(wt)基因序列，基于大肠杆菌(escherichiacoli，e.coli)中密码子偏好性进行优化，设计适于大肠杆菌表达的基因(an6-4)，交由上海捷瑞生物公司人工合成该基因，并装载到pet22b质粒载体上,经由公司测序成功后，寄回构建成功的重组质粒pet22b-an6-4(郑彬琼.大肠杆菌同义密码子偏好性概述[j].硅谷,2009(01):23-24.)。

2、构建突变体菌株

设计一对突变引物，突变引物分别为：

s460nf:5'atcatgaaaccgcaaataatgtgggtaattggatgtggctg3'

s460nr:5'attacccacattatttgcggtttcatgatcaatcagccattct3'

利用快速定点突变的方法，构建突变体基因。其原理是，dammethylase，(中文名称)由大肠杆菌染色体编码的两种甲基化酶之一，是dam⁺基因的产物，识别序列gatc中的腺嘌呤，将其转变成6-甲基腺嘌呤。dpnⅰ作为一种dna限制性内切酶，能够切断腺嘌呤甲基化的g^matc序列，而不能切断非甲基化的gatc序列。因此dpnⅰ能够切断来源于e.coli(dam⁺)的dna；不能切断pcr产物。

pcr扩增体系配制(60μl)

pcr扩增反应

10×fastdigestbuffer(1ml)

dpni反应体系(20μl)

dpni2μl

10×fastdigestbuffer2μl

质粒pet22b-s460n16μl

dpni反应体系(20μl)

37℃50min

80℃40min

16℃保存

以pet22b-an6-4重组质粒为模板进行pcr扩增，反应条件为95℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃3min循环35次；72℃充分延伸10min，16℃保存。如图1，得到pcr产物为突变重组质粒pet22b-s460n，经过dpni酶切反应后，将突变质粒pet22b-s460n转化大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞，经过amp抗性筛选阳性克隆，送南京金斯瑞生物公司测序鉴定。序列比对结果发现460位突变成功。

将突变成功的菌体，平板划线，挑菌，摇菌，重提质粒，转化到rosetta(de3)感受态细胞，构建工程菌rosetta(de3)/pet22b-s460n。

实施例2：突变体酶s460n的表达与纯化

1、突变体酶s460n的表达

挑取工程菌rosetta(de3)/pet22b-s460n，接种于氨苄霉素和氯霉素抗性的5ml的lb液体培养基中，37℃，225rpm摇菌，过夜扩大培养。次日将2ml培养物转接到200ml含相应抗生素的液体lb中，37℃，225rpm，振荡培养至od600为1左右；从摇床中取出细菌，降至室温。加入1mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside，iptg)，20℃，225rpm，诱导表达20h；将扩大培养的200ml菌液分四次加入50ml离心管中，5500rpm，4℃，5min离心，收集菌体。

2、突变体酶s460n的纯化

lewbuffer(500ml)

elutionbuffer(500ml)：

取5ml菌体，充分悬浮于30mllewbuffer裂解缓冲液中。将菌液置于压力破碎仪中，70mpa压力，破碎3min。将破碎液12000rpm，10min高速离心，取上清蛋白。通过亲和层析法，用30mlni²⁺离子亲和柱(purificationkit)纯化。将破碎离心后的30ml上清转移至加入到30mlni²⁺离子亲和柱中，混匀；4℃下于水平摇床上晃动样品30min，使上清与镍离子树脂充分结合。结合结束，用1倍柱体积的lewbuffer清洗树脂；用1倍柱体积的洗脱液(elutionbuffer)洗脱目的蛋白；用ep管收集洗脱蛋白(1ml)。

如图2纯化后的蛋白经12％的sds-page鉴定(1-3为纯化蛋白分管收集样品，m为低分子量标准蛋白)，在73kda处有单一特异性很高的条带，说明纯化后的蛋白的纯度较高(90％以上)。且与通过氨基酸序列计算分子量大小一致。

实施例3：突变体酶s460n与wt光修复酶的酶活性检测

紫外光照射胸腺嘧啶会产生6-4光产物，该嘧啶二聚体在325nm下有特征吸收。通过300nm-400nm近紫外可见光照射，黑曲霉光修复酶裂解还原6-4光产物，使得325nm的吸光度会逐渐下降。因此可以通过325nm处的光吸收值下降速度，即单位时间内底物减少的量，来检测蛋白修复6-4光产物的活性。

在室温中，用254nm紫外灯以1cm灯距，照射人工合成的含有16个胸腺嘧啶碱基寡聚核苷酸溶液(上海捷瑞)，持续5h，得到含有6-4光产物的寡聚核苷酸的溶液，即uv-dt16。反应体系600μl，包括8.6μm的uv-dt16，0.5μm的光修复酶，以及ph7.0样品缓冲液proteinbuffer。将反应体系置于1ml的石英比色皿中，用20w近紫外led灯(主要输出波长385nm)以灯距1cm光照进行光修复，在一定时间内，测定波长325nm附近的可见光吸光度变化，检测其体外6-4光修复酶的活性。

proteinbuffer(定容至500ml):

用hcl调ph7.0，加入ddh2o定容至0.5l。

光修复酶反应体系(600μl)

uv-dt16(8.6μm)8μl

光修复酶(0.5μm)10μl

proteinbuffer定容至600μl

使用实施例2中纯化新鲜的突变体酶s460n和wt光修复酶进行酶活检测。如图3，突变体酶s460n修复6-4光产物的变化曲线，特征吸收峰在325nm处。图中表示的曲线分别表示的是第0、4、10、15、25、90min的6-4光产物吸光度变化。

如图4，wt光修复酶修复6-4光产物的变化曲线，特征吸收峰在325nm处。图中表示的曲线分别表示的是第0、7、15、25、40、90min的6-4光产物吸光度变化。

如图5，图中表示的曲线分别反映的是突变体酶s460n以及wt光修复酶0-90min的酶活反应。每一个点表示的是6-4光产物在325nm处吸光度。由图可以分析，突变体酶s460n在反应起始20min内的斜率，明显大于wt光修复酶，表明反应速率更快，可以看出突变体酶s460n酶活性显著高于wt光修复酶。

实施例4：突变体酶s460n与wt光修复酶活力稳定性检测

自然条件下，光修复酶结合黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)执行修复功能。fad通过自身得失电子，进行氧化还原反应，使酶具有光修复活性。因此fad有三种存在形式，氧化状态，自由基状态(单电子态)和还原状态(双电子态)。在fad三种类型中，光修复酶只有结合还原型fad才具有光修复活性，在体外条件下，光修复酶会不断被空气逐渐氧化，蛋白含有的还原型fad逐渐减少，从而逐渐失去活性。

使用实施例2中的纯化的突变体酶s460n和wt光修复酶，参照实施例3中的测活方法，进行两类蛋白的活性稳定性检测。

如图6，图中表示的曲线分别反映的是突变体酶s460n第1、2、3、5、7、15天的酶活性变化以及wt光修复酶第1、2、3、5、7、15天的酶活性变化。每一个点表示的是当天酶体系反应过程中的斜率绝对值，即在单位时间内底物的减少量。斜率数值的绝对值越大，表示反应速度越快，酶活性越好。从图上可以看出，wt光修复酶的活性，在第3天完全丧失，而突变体酶s460n在第7天仍有活性，其活性减弱的程度明显小于wt光修复酶，说明突变体酶s460n活性更加持久稳定。

1999年德国科学家发现光修复酶可以体外修复人类晒伤皮肤之后，带有光修复酶的化妆品、医药开始逐步出现，并且一直受到市场欢迎。突变体酶s460n在空气中能长久保持活性，有利于执行光修复功能，修复更多的紫外造成的dna损伤，进而可以应用于生物医药、化妆品领域。

序列表

<110>安徽师范大学

<120>一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法

<130>2019.03.12

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>641

<212>prt

<213>黑曲霉(aspergillusniger定点突变)

<400>1

metproproglnseralaprothrvalilephetrphisargthrasp

151015

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<210>2

<211>1923

<212>dna

<213>黑曲霉(aspergillusniger定点突变)

<400>2

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aaa1923