一种多肽及其用于有机磷农药检测的探针和制备方法与流程

本发明涉及的是一种能够检测有机磷农药的多肽探针的设计、优化及应用，属于食品安全检测领域。

背景技术：

酶是一类具有高效催化功能的生物催化剂，自然界的一切生命现象都与酶的参与有关。酶催化反应因其具有高的催化效率、高的反应专一性和温和的反应条件等特点，使其在医药、化工、食品和农业等领域发挥着重要作用。然而天然酶在实际应用上存在明显缺陷，比如来源有限、提纯困难、易失活、价格昂贵、使用条件苛刻等等。这些都使得天然酶的应用受到了极大的限制。因而，开发具有酶功能的模拟酶的体系便应运而生。

诺贝尔奖获得者cram、pederson与lehn根据酶催化反应机理，提出了主-客体化学和超分子化学，奠定了模拟酶的重要理论基础。到目前为止，学者们开发并研究了一系列主体试剂模拟酶以及纳米粒子模拟酶等，取得了一定的发展。但近年来，多肽自组装模拟酶由于其来源组成接近天然酶，具有较高生物相容性，合成方便，具有二级结构等特点逐渐成为目前模拟酶的研究热点，相继开展了以组氨酸催化酯水解、脯氨酸催化醛醇缩合为核心的多肽自组装模拟酶。

目前市面上流通的有机磷农药通常都是具有高毒性或中等毒性的农药，见效快，使用范围广，成本低，用药量少，因此，在防治农产品的病虫害方面具有重要意义。我国是世界上的农药生产和消费大国，因而农药的使用量和农药的中毒比例都是位居世界前列。在我国农药生产过程中，杀虫剂在所有农药的总产量中占绝大部分，然而有机磷类农药又在杀虫剂中占很大比例，有机磷类杀虫剂中多是高毒性的农药，不少在国外早已被禁止使用或限制使用的剧毒类或高残留的农药在我国的生产生活中仍屡见不鲜，例如甲胺磷、甲基对硫磷等。由于此类农药的大量使用，我国发生农药中毒的事件也越来越多。人们从食物和水中获取生命所需的营养物质的同时，通常也会将食物和水中残留的农药也一并吸收，这些农药残留通过一条条食物链的富集作用，在人和动物体内蓄积，增加了致畸、致癌、致突变的风险。

有机磷农药与许多基本的生物学功能有内在联系，例如生物合成，信号传导和能量传导。有机磷农药作为神经毒素以非常低的浓度抑制胆碱酯酶的活性，对人类健康造成损害甚至致命。迄今为止，广泛使用的测定有机磷农药的方法通常费用较高，因为检测仪器昂贵且需要大量的有机溶剂，分析之前的前处理也较为复杂。因此，仪器廉价，成本低，操作简单，节省时间和能够对有机磷农药进行实时检测的新分析技术受到了广泛关注。近几年，研究人员已经开发了许多可用于检测有机磷农药的传感技术，包括化学发光，电化学测定，酶联免疫吸附测定和利用碳量子点/mno2合成传感基质的荧光检测等。然而，这些报道或常规方法仍然存在一些缺点，例如应用有限，选择性差，电化学修饰方法复杂，酶稳定性差等。显然，若能开发一种新的可以改善常规分析方法并提高选择性和灵敏度的有机磷农药检测平台是非常理想的。

技术实现要素：

本发明的目的在于设计一种探针可以特异性的结合有机磷农药，并且可以利用这一特性提供一种检测有机磷农药的新方法。

人体中有机磷农药中毒的机理，主要是乙酰胆碱酯酶中的丝氨酸(s)与有机磷农药结合，导致乙酰胆碱无法及时被水解，从而中毒。所以把丝氨酸(s)作为活性位点，与有机磷农药结合；又因为亮氨酸(l)、组氨酸(h)、精氨酸(r)组成的亲疏水相间的片段lhlhlrl在疏水环境中更容易聚集，提高灵敏度。而且精氨酸(r)可以作为四苯基乙烯(tpe)与肽链的连的连接位点。最后为了提高反应的活性，加入了催化三联体。当有机磷农药与丝氨酸反应后，肽链的疏水性增强，在疏水相互作用下四苯基乙烯(tpe)分子聚集发光。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为催化三联体-lhlhlrl，所述的催化三联体含丝氨酸的催化三联体，

其中l为亮氨酸，h为组氨酸、r为精氨酸。

优选的，所述多肽的氨基酸序列为hshlhlhlrl、skdlhlhlrl、skelhlhlrl或ssklhlhlrl，

其中s为丝氨酸；h为组氨酸；d为天冬氨酸；r为精氨酸；l为亮氨基酸；e为谷氨酸；k为赖氨酸。

精氨酸(r)作为四苯基乙烯(tpe)与肽链的连的连接位点，引入tpe，设计了4种对有机磷农药有明显效果的探针，包括如下：

①probe-1：ac-hshlhlhlr(tpe)l-conh2

②probe-2：ac-skdlhlhlr(tpe)l-conh2

③probe-3：ac-skelhlhlr(tpe)l-conh2

④probe-4：ac-ssklhlhlr(tpe)l-conh2

其中ac为乙酰基；conh2为甲酰胺基；s为似氨酸；h为组氨酸；d为天冬氨酸；r为精氨酸；l为亮氨基酸；e为谷氨酸；k为赖氨酸；tpe为带醛基的四苯基乙烯分子，通过醛胺反应连接在精氨酸上。

探针的制备方法包括如下步骤：

1)将8mg权利要求1或2的多肽冻干粉溶于1200ul50％乙醇溶液制成肽溶液(2)将3.2mgtpe-cho溶于1200ul乙醇溶液中，两溶液混合后加入400ul体积比为1:1的三乙胺-乙醇溶液，在4℃下搅拌30min后，加入160ul硼氢化钠溶液(18.5mg/l)，继续在4℃下搅拌过夜，制成探针溶液。本步骤只为了让tpe通过醛胺反应连接到肽链上，形成探针。

设计的探针用于有机磷农药的检测，包括以下步骤：

将有机磷农药加在50um的探针溶液中、水浴一段时间后测其荧光强度。从而可以得出每条肽对有机磷农药的作用效果。该探针最佳作用条件为：温度37℃，ph＝7.0，时间为45分钟。

本发明的优点是：本发明主要是设计了一种制备简便、绿色环保、具有荧光性质、可用于有机磷农药检测的新型探针，并建立了一种可定量检测有机磷农药的新方法。本发明主要是新型探针的设计，包括多肽序列的设计及将多肽与tpe通过醛胺反应连接，使探针具有荧光性质。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明创造实施例所述的四种探针的制备步骤及与甲基对氧磷反应后在302nm紫外灯照射下的照片。

图2为本发明创造实施例所述的四种探针与甲基对氧磷反应最适温度测定。

图3为本发明创造实施例所述的四种探针与甲基对氧磷反应最适反应ph测定。

图4为本发明创造实施例所述的四种探针与甲基对氧磷反应最适反应时间测定。

图5为本发明创造实施例所述的最优探针probe-4与甲基对氧磷浓度的关系图。从上到下，浓度从1um–290um。

图6为本发明创造实施例所述的四种探针对三种有机磷农药水解活性。

具体实施方式

为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。

本发明各实施例所用到的原料，均为市场上购买的，tpe-cho和多肽冻干粉为委托化工公司合成，合成方法是本领域技术人员都知道的普通方法，tpe-cho的纯度要求90％以上，多肽纯度要求98％以上。

实施例1：四种探针的制备步骤及与有机磷农药反应后在302nm紫外灯照射下的照片。

将8mg多肽冻干粉溶于1200ul乙醇-水(50％)溶液中，将3.2mgtpe-cho溶于1200ul乙醇溶液中，两溶液混合后加入400ul三乙胺-乙醇(50％)溶液，在4℃下搅拌30min后，加入160ul的硼氢化钠(18.5mg/l)，继续在4℃下搅拌过夜制成探针。

将50um的探针与50um的甲基对氧磷农药在ph＝7、温度为37℃的条件下反应45min，然后在302nm紫外灯下观察。探针没有表现出荧光，在与甲基对氧磷反应后在302nm紫外灯下均呈现出黄绿色荧光。图1中上半部分从左到右依次为:probe-1、probe-2、probe-3、probe-4；下半部分为对应的探针与甲基对氧磷反应后的效果图。

实施例2：四种探针与甲基对氧磷最适反应温度测定

将50um的探针与50um的甲基对氧磷在ph＝7温度为25℃、37℃、55℃、70℃条件下反应45min后测其荧光强度。图2为所制备四种探针与甲基对氧磷最适反应温度测定图。

从表征结果图2可以看出，probe-1、probe-2、probe-4与甲基对氧磷作用的最适温度为37℃，probe-3与甲基对氧磷作用的最适温度为25℃。

实施例3：四种探针与甲基对氧磷最适反应ph测定

将50um的探针与50um的甲基对氧磷在温度为37℃、ph分别为ph＝3、ph＝5、ph＝7、ph＝8、ph＝10条件下反应45min后测其荧光强度。图3为所制备四种探针与甲基对氧磷最适反应ph测定图。

从表征结果图3可以看出，所制备四种探针与甲基对氧磷作用最适ph＝7。

实施例4：四种探针与甲基对氧磷最适反应时间测定

将50um的探针与50um的甲基对氧磷在ph＝7温度为37℃条件下分别反应0min、5min、15min、30min、45min、60min后测其荧光强度。图4为所制备四种探针与甲基对氧磷最适反应时间测定图。

从表征结果图4可以看出，所制备四种探针与甲基对氧磷最佳反应时间为45min。

实施例5：最优探针probe-4与甲基对氧磷浓度的关系图。从左到右，浓度从1um–290um。

将50um的探针与不同浓度的甲基对氧磷在ph＝7、温度为37℃的条件下反应45min，甲基对氧磷的浓度为1um、5um、10um、50um、100um、200um290um,后测其荧光强度。图5为所制备最优探针probe-4与甲基对氧磷浓度的关系图。由图5可以看出甲基对氧磷浓度越高探针probe-4的荧光强度越强，呈线性关系。

实施例6：四种探针对有机磷农药水解活性

将50um的探针与50um的甲基对氧磷、乙基对氧磷、甲基对硫磷在ph＝7、温度为37℃的条件下反应45min后测其荧光强度。图6为所制备四种探针与有机磷农药水解活性图。

从表征结果图6可以看出，四种探针对甲基对氧磷、乙基对氧磷、甲基对硫磷三种有机磷农药均有较好效果。

综上所述探针④ac-ssklhlhlr(tpe)l-conh2对有机磷农药的检测效果最优。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。