本发明涉及牡丹籽粕蛋白肽技术领域，特别涉及一种牡丹蛋白肽的制备方法。
背景技术：
牡丹是毛莨科芍药属灌木，广泛分布于河南洛阳、山东菏泽、安徽铜陵、陕西汉中、河北柏山等地，以洛阳、菏泽、铜陵种植最多，据统计，我国牡丹的种植面积已达30万亩，由于牡丹籽的含油量高，且富含亚油酸和亚麻酸，因此近几年，牡丹籽被大量应用于榨油，而榨油后的固体残渣牡丹籽粕，大多被直接废弃或者当做肥料，利用情况不理想，经过测定发现，牡丹籽粕中粗蛋白含量约为20％，因此，利用提取过牡丹籽油的牡丹籽粕来提取牡丹籽蛋白成为可能。
蛋白质是食品的重要组成成分，蛋白质经酶解后得到蛋白肽，其功能特性和生物学特性，与原有蛋白质有较大差别，如酶解后可改善蛋白质的溶解性，乳化性，起泡性等功能特性，我国每年都有大量炼油后的牡丹籽粕产物，可以得到大量的牡丹蛋白，因此，如何高效率、低成本得到满足生活所需的牡丹蛋白肽，是现在的研究热点。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述问题，研究出可得到特定分子量牡丹蛋白肽的方法，该方法制备安全，工艺简便，不用利用超滤分级，提高了制备效率，降低了生产成本。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种牡丹蛋白肽的制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:20～30与水混合，加入naoh调节ph9～10，50～60℃条件下磁力搅拌60～70min，离心(3500～4000r/min，13～18min)，取上清液，加入hcl，调节ph3～4，离心(3500～4000r/min，13～18min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力10-14mpa，萃取100～120min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液，可以脱出牡丹蛋白中辛辣味；
s3：取步骤s2所得蛋白液3份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶1～2份，果胶酶3～5份，酶活力为110～120u/ml，酶解反应ph6.5～7.0，反应温度40～60℃，反应时间2～4h，酶解后，高温灭活，加入8％～12％的hcl，调节ph至4.0～4.5，在90～100r/min条件下搅拌，使未酶解的牡丹蛋白呈凝乳状析出，过滤分离，提纯后喷雾干燥得牡丹蛋白肽，sds-page电泳测定蛋白质相对分子质量为小于1000da，凯氏定氮法测定得到小于1000da蛋白肽的得率在95％以上。
优选的，所述步骤s3中的复合蛋白酶为β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶，加入β-半乳糖苷酶1～2份，a-葡萄糖苷酶4～5份，酶活力为80～90u/ml，酶解反应ph为6.0～7.0，反应温度40～45℃，反应时间3～4h，酶解后，高温灭活，加入8％～12％的hcl，调节ph至4.0～4.5，在70～80r/min条件下搅拌，使未酶解的牡丹蛋白呈凝乳状析出，过滤分离，提纯后喷雾干燥得牡丹蛋白肽，sds-page电泳测定蛋白质相对分子质量为1000～2000da，凯氏定氮法测定得到1000～2000da蛋白肽的得率在95％以上。
优选的，所述步骤s3复合蛋白酶为胰凝乳蛋白酶1～2份，果胶酶3～5份，酶活力为110～120u/ml，酶解反应ph6.5～7.0，反应温度40～60℃，反应时间2～4h，酶解后，高温灭活，加入8％～12％的hcl，调节ph至4.0～4.5，在90～100r/min条件下搅拌，使未酶解的牡丹蛋白呈凝乳状析出，过滤分离，提纯后喷雾干燥得牡丹蛋白肽，sds-page电泳测定蛋白质相对分子质量为2000～3000da，凯氏定氮法测定得到2000～3000da蛋白肽的得率在95％以上。
不同的复合酶组合，可以破坏牡丹蛋白不同位点的肽键，从而可以得到不同特定分子量的牡丹蛋白肽。
优选的，所述牡丹籽粕为带种皮的牡丹籽粕，或者不带种皮的牡丹籽粕。
优选的，所述s1中过80～100目筛。
优选的，所述s3酶解反应ph为6.8，反应温度为58℃，反应时间为2.5h，酶解后95℃高温灭活15min。
优选的，所述复合蛋白酶为β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶时，所述酶解反应ph为6.5，反应温度为43℃，反应时间为3.5h，酶解后95℃高温灭活15min。
优选的，所述复合蛋白酶为纤维素酶和糖化酶时，所述酶解反应ph为6.0，反应温度为50℃，反应时间为3.5h，酶解后95℃高温灭活15min。
与现有技术相比本发明具有以下技术效果：对牡丹籽粕进行再利用，所述牡丹籽粕为带种皮的，或者不带种皮的，先制备牡丹分离蛋白，再利用超临界co2技术萃取，脱除牡丹蛋白中辛辣味，所得牡丹蛋白用胰凝乳蛋白酶和果胶酶反应，可以得到特定分子量小于1000da的牡丹蛋白肽，得率在95％以上；所得牡丹蛋白用β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶反应，可以得到特定分子量为1000da-2000da的牡丹蛋白肽，得率在95％以上；所得牡丹蛋白用纤维素酶和糖化酶反应，可以得到特定分子量为2000da-3000da的牡丹蛋白肽，得率在95％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
s3：取步骤s2所得蛋白液3份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶1份，果胶酶3份，酶活力为115u/ml，酶解反应ph6.5，反应温度55℃，反应时间2.5h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.3，在90r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得相对分子质量为小于1000da牡丹籽蛋白肽，得率为96.5％。
实施例2
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
s3：取步骤s2所得蛋白液3份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶1.5份，果胶酶3.5份，酶活力为118u/ml，酶解反应ph6.8，反应温度58℃，反应时间2.5h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.3，在90r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得相对分子质量为小于1000da牡丹籽蛋白肽，得率为96.9％。
实施例3
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
s3：取步骤s2所得蛋白液3份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶2份，果胶酶4份，酶活力为114u/ml，酶解反应ph7.0，反应温度60℃，反应时间3.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.3，在90r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得相对分子质量为小于1000da牡丹籽蛋白肽，得率为95.8％。
实施例4
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶，加入β-半乳糖苷酶1份，a-葡萄糖苷酶4份，酶活力为87u/ml，酶解反应ph为6.5，反应温度45℃，反应时间3h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在75r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得1000～2000da牡丹籽蛋白肽，得率为96.3％。
实施例5
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶，加入β-半乳糖苷酶1.5份，a-葡萄糖苷酶4.5份，酶活力为89u/ml，酶解反应ph为6.5，反应温度45℃，反应时间3.5h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在75r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得1000～2000da牡丹籽蛋白肽，得率为95.8％。
实施例6
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶，加入β-半乳糖苷酶2份，a-葡萄糖苷酶5份，酶活力为86u/ml，酶解反应ph为7.0，反应温度45℃，反应时间4h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在75r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得1000～2000da牡丹籽蛋白肽，得率为96.2％。
实施例7
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力13mpa，萃取105min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为纤维素酶和糖化酶，加入纤维素酶1份，糖化酶5份，酶活力为99u/ml，酶解反应ph5.0，反应温度50℃，反应时间3.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在60r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得2000～3000da蛋白肽，得率为96.4％。
实施例8
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力13mpa，萃取105min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为纤维素酶和糖化酶，加入纤维素酶2份，糖化酶5.5份，酶活力为103u/ml，酶解反应ph6.0，反应温度50℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在60r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得2000～3000da蛋白肽，得率为95.3％。
实施例9
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力13mpa，萃取105min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为纤维素酶和糖化酶，加入纤维素酶3份，糖化酶6份，酶活力为98u/ml，酶解反应ph7.0，反应温度50℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在60r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得2000～3000da蛋白肽，得率为96.2％。
对比例1
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
s3：取步骤s2所得蛋白液3份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶0.5份，果胶酶2份，酶活力为43u/ml，酶解反应ph6.8，反应温度55℃，反应时间2.5h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.3，在90r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得相对分子质量为小于1000da牡丹籽蛋白肽，得率为47.1％。
对比例2
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
s3：取步骤s2所得蛋白液3份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶1份，果胶酶2份，酶活力为39u/ml，酶解反应ph6.0，反应温度55℃，反应时间2.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.3，在90r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得相对分子质量为小于1000da牡丹籽蛋白肽，得率为49.3％。
对比例3
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
s3：取步骤s2所得蛋白液3份，加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶3份，果胶酶7份，酶活力为49u/ml，酶解反应ph6.5，反应温度55℃，反应时间3.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.3，在90r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得相对分子质量为小于1000da牡丹籽蛋白肽，得率为52.7％。
对比例4
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶，加入β-半乳糖苷酶1份，a-葡萄糖苷酶2份，酶活力为29u/ml，酶解反应ph为6.0，反应温度45℃，反应时间3h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在75r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得1000～2000da牡丹籽蛋白肽，得率为47.5％。
对比例5
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶，加入β-半乳糖苷酶2份，a-葡萄糖苷酶1份，酶活力为33u/ml，酶解反应ph为6.0，反应温度45℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在75r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得1000～2000da牡丹籽蛋白肽，得率为51.7％。
对比例6
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力12mpa，萃取110min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶，加入β-半乳糖苷酶2份，a-葡萄糖苷酶7份，酶活力为33u/ml，酶解反应ph为7.5，反应温度45℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在75r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得1000～2000da牡丹籽蛋白肽，得率为49.3％。
对比例7
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力13mpa，萃取105min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为纤维素酶和糖化酶，加入纤维素酶1份，糖化酶3份，酶活力为41u/ml，酶解反应ph7.0，反应温度50℃，反应时间3.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在60r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得2000～3000da蛋白肽，得率为29.6％。
对比例8
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力13mpa，萃取105min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为纤维素酶和糖化酶，加入纤维素酶2份，糖化酶4份，酶活力为43u/ml，酶解反应ph7.0，反应温度50℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在60r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得2000～3000da蛋白肽，得率为36.5％。
对比例9
一种牡丹蛋白肽制备方法，所述方法步骤为：
s1：将牡丹籽粕粉碎，用超临界co2萃取脱脂，过筛，按料液比1:25与水混合，加入naoh调节ph9.35，57.6℃条件下磁力搅拌66min，离心(3800r/min，15min)，取上清液，加入hcl，调节ph3.5，离心(3800r/min，15min)，沉淀用少量去离子水清洗至中性后冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；
s2：将s1所得牡丹籽蛋白溶解，溶解液用超临界co2萃取，萃取压力13mpa，萃取105min，萃取完后常温静置半小时，收集蛋白液；
步骤s3中的复合蛋白酶为纤维素酶和糖化酶，加入纤维素酶4份，糖化酶7份，酶活力为38u/ml，酶解反应ph8.0，反应温度50℃，反应时间4.0h，酶解后，高温灭活，加入10％的hcl，调节ph至4.6，在60r/min条件下搅拌，过滤分离，提纯后喷雾干燥得2000～3000da蛋白肽，得率为39.8％。
实验例1
凯氏定氮法测定蛋白肽得率
(一)测定蛋白质中氮含量
将蛋白质与浓硫酸共热，向其中加入催化剂硫酸铜，硫酸分解为二氧化硫，水和原子态氧，蛋白质氧化为二氧化碳和水，而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵；反应完全后加入naoh,nh4+转变为nh3，通过蒸馏把nh3导入过量的硼酸溶液中，通过标准盐酸滴定，滴定消耗的标准盐酸摩尔数为nh3的摩尔数，即蛋白质中氮的含量m。
(二)测定蛋白肽中氮含量
将蛋白肽与浓硫酸共热，向其中加入催化剂硫酸铜，硫酸分解为二氧化硫，水和原子态氧，蛋白质氧化为二氧化碳和水，而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵；反应完全后加入naoh,nh4+转变为nh3，通过蒸馏把nh3导入过量的硼酸溶液中，通过标准盐酸滴定，滴定消耗的标准盐酸摩尔数为nh3的摩尔数，即为蛋白肽中氮的含量m。
蛋白肽得率＝蛋白肽中氮含量m/蛋白质中氮含量m*100％
实验例2
sds-page电泳测定蛋白质相对分子质量
(一)仪器、原料和试剂
仪器：垂直版型电泳槽；直流稳压电源；50ul枪头，玻璃板、水浴锅、染色槽、烧杯、吸量管、滴管。
原料：0.5mg/ml样品溶液
试剂：tris-hcl缓冲液ph8.9，tris-hcl缓冲液ph6.7,30％分离胶储液，10％浓缩胶储液，10％sds溶液，染色液，脱色液。
(二)实验步骤
1、安装电泳槽
2、配胶
3、制备凝胶板
4、样品处理及加样
将0.5mg/ml样品溶液和标准蛋白液用沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用，将15ul样品小心加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，开始电泳。
5、电泳
将电泳仪打开，将电流调到10ma。待样品分离时，电流调至25ma，当蓝色染料迁移至底部，电流调为零，关闭电源，拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端做标记，染色。
6、染色及脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，用直尺量取各条带与凝胶顶端的距离。
7、计算
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上可找出其分子量。
相对迁移率mr＝样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)
实施例1-3和对比例1-3反应条件下，胰凝乳蛋白酶和果胶酶反应结果如表1所示：
表1胰凝乳蛋白酶和果胶酶反应条件下，加入3份牡丹蛋白，小于1000da牡丹蛋白肽的制备
实施例4-6和对比例4-6反应条件下，β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶反应结果如表2所示：
表2β-半乳糖苷酶和a-葡萄糖苷酶反应条件下，加入3份牡丹蛋白，1000～2000da牡丹蛋白肽的制备
实施例7-9和对比例7-9反应条件下，纤维素酶和糖化酶反应结果如表3所示：
表3纤维素酶和糖化酶反应条件下，加入3份牡丹蛋白，2000`3000da牡丹蛋白肽的制备
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