诱变微生物菌株的方法、丁酸梭菌菌株及应用与流程

本发明涉及丁酸菌菌种育种，具体涉及诱变微生物的菌株及由此得到的丁酸梭菌菌株及其应用。

背景技术：

丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)，又称酪酸梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌。丁酸梭菌能够调整肠道菌群平衡，促进肠道益生菌群的增殖，尤其是乳酸菌和双歧杆菌的增殖，而且能够有效防止幽门螺杆菌引起的肠道菌群的异常变化，具有极强的整肠作用。丁酸梭菌也具有抑制肠道内有毒物质，如氨、胺类等的产生，避免此类有害物质在肠道内聚集，减少其对机体的毒害作用，在调整肠道的微生态领域具有重要的应用价值。丁酸梭菌的代谢产物主要是丁酸，人类对短链脂肪酸的吸收和代谢能力很强，其中尤以对丁酸的吸收和代谢为快。丁酸进入肠道后能抑制去乙酰化酶活性、促进结肠蛋白质合成增加，从而促进肠上皮细胞愈合，同时丁酸还能起到调节宿主的基因表达，也能抑制表皮生长因子诱导的细胞增生，并通过下调环氧合酶(cyclooxygenase)抑制人肠微血管内皮细胞的增生，从而起到了预防和治疗肠炎、肠癌等肠道疾病的作用。

鉴于丁酸梭菌优良的生理功能，获得稳定高产丁酸的丁酸梭菌是其发挥效能的关键。菌种的优劣，直接影响到丁酸梭菌产品的产量和质量。优良菌株的选育，是保证丁酸梭菌提高丁酸生产水平的重要环节。但目前的商业性丁酸梭菌普遍存在产酸能力低，特别是丁酸生产水平不足的问题。

微生物的育种技术主要有诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。其中，诱变育种能够提高突变率，在较短的时间内活动更多的优良变异类型，产生自然界原来没有的或一般常规方法无法获得的新类型、新性状、新基因，能够打破基因连锁，提高重组率，在水平上，诱变育种往往会导致比同源或异源转基因更大的转变。因此，诱变育种是目前应用最多也是最经济实用的育种方法，是对育种手段不足的一种有益补充。

诱变育种可以采用物理方法如紫外诱变，诱变剂主要包括紫外线、x-射线、γ-射线，快速中子等，在诱变微生物菌种中较为常用。也可以采用化学诱变。化学诱变是通过一定浓度范围的化学诱变剂对活体进行处理造成生物细胞内的损伤和错误修复等，产生突变体，具备易操作，剂量易控制，对基因组损伤小，突变率高。

由于物理和化学的诱变方法所产生的突变是随机的尽管基因突变频率较高，但突变无方向性，并不能确保增加正向突变的频率，所以选择合适的筛选方法也是保证菌株选育的重要措施。

技术实现要素：

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明通过紫外线结合亚硝酸钠诱变，筛选得到产酸量明显提高的菌株。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种诱变微生物菌株的方法，其包括以下步骤：

(1)使微生物经紫外线照射处理得到第一诱变微生物；和

(2)使所述第一诱变微生物与亚硝酸钠接触得到第二诱变微生物。步骤(2)中的亚硝酸钠接触过程可进行一次，也可进行两次以上。下面说明两个步骤。

本发明的步骤(1)可优选包括下述子步骤：

(1-1)培养基的配制：

本发明的培养基包括生长培养基和筛选培养基。生长培养基用于使微生物在其中生长，包括在生长培养上经紫外线照射处理。生长培养基一般包含葡萄糖、酵母粉、氯化钠、硫酸镁，其ph6-7。生长培养基中，葡萄糖的含量一般为2-20g/l，优选3-15g/l，更优选5-10g/l。酵母粉的含量一般为酵母粉0.5-25g/l，优选1-20g/l，更优选5-15g/l。氯化钠的含量一般为0.05-10g/l，优选0.1-5g/l，更优选0.5-3g/l。硫酸镁的含量一般为0.01-0.1g/l，优选0.02-0.08g/l，更优选0.05-0.06g/l。

本发明的筛选培养基为在生长培养基的基础上进行加筛选试剂得到的培养基。筛选试剂的实例包括碳酸钙和溴甲酚紫等。碳酸钙的添加量一般为0.5-1wt％。溴甲酚紫的添加量一般为0.02-0.05wt％。筛选培养基的初始ph6-7.0。

(1-2)菌悬液的制备：

挑取原微生物菌株，接入生长培养基中，活化，37℃静止培养，取对数生长期的种子液进行诱变。将种子液在5000rpm的条件下离心5min，弃上清液，沉淀用ph7.0磷酸缓冲液洗涤两次，菌体经玻璃珠打散，制成1-9×10⁷cfu/ml左右的菌悬液。

(1-3)紫外线诱变：

步骤(1-2)中得到的菌悬液取3ml，倒入带盖的培养皿中，紫外灯照射5-60min后，避光稀释，取一定的稀释倍数涂平板，箱中，37℃厌氧培养24h，所得菌株备用。

(1-4)紫外线诱变初筛：

以步骤(1-3)诱变菌株的产酸圈和菌体直径(l/d)的比例大小来表示菌株产酸量的多少，以此为指标，选择变色圈和菌落直径比例大的菌落，筛选出表现良好的菌株，进行下一步的复筛。

(1-5)紫外线诱变复筛：

将(1-4)所得初筛挑选的阳性诱变菌株分别接到液体培养基中，37℃厌氧培养48h，离心取发酵液，用氢氧化钠滴定法测定其产酸总量，以消耗的氢氧化钠摩尔数代表产酸量，并在培养的过程中观测气泡产生的时间以衡量菌体生长的速度，以产酸量及生长快慢为筛选菌株的综合衡量指标。

本发明的步骤(2)可优选包括以下子步骤：

(2-1)亚硝酸钠诱变：

取(1-5)中得到阳性菌株，按照(1-2)的方法制备好菌悬液，加入等体积的0.1-1.0mol/l的亚硝酸钠，26℃分别处理5-60min后，加入0.07mol/l的磷酸二氢钠(ph＝8.6)终止反应。一定稀释倍数的诱变菌转接到固体培养基，37℃厌氧培养24h，测定诱变菌株的产酸能力(l/d)。

(2-2)亚硝酸钠诱变复筛：

对(2-1)选出的阳性诱变菌株进行复筛，通过最先产气泡的时间衡量生长速度较快，通过酸碱滴定法衡量产酸量，筛选生长速度快且产酸量高的菌株。

(2-3)亚硝酸钠二次诱变：

对(2-2)得菌株进行二次亚硝酸钠诱变，用酸碱滴定法测定产酸能力，筛选出优良的阳性诱变菌株。

本发明中的微生物的类型不限定，优选微生物为丁酸梭菌。

本发明的诱变微生物的方法中，步骤(1)得到的第一诱变微生物具有提高的产酸能力。与原野生菌株相比，第一诱变微生物的产酸能力优选提高15％以上。步骤(2)得到的第二诱变微生物具有进一步提高的产酸能力。与原野生菌株相比，第二诱变微生物的产酸能力优选提高提高1.6倍。

本发明的第二方面，提供由第一方面的诱变微生物菌株的方法得到的诱变菌株。

本发明的第三方面，提供一种丁酸梭菌，其具有提高的产酸能力。当将所述菌株接到液体培养基中，在37℃厌氧培养48h后，发酵液浓度达到1×10⁸cfu/ml，利用氢氧化钠滴定法测定其产酸量为25mmol/l以上。

在某些实施方案中，本发明的丁酸梭菌菌株为经本发明的诱变方法得到的一种微生物，其已于2019年3月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmccno：17327。

本发明的第四方面，提供一种发酵方法，其包括使本发明的菌株在适于微生物生长的条件下进行培养得到发酵物的步骤。可选地，本发明的发酵方法进一步包括从发酵物中分离丁酸的步骤。

本发明的第五方面，提供第三方面的菌株的应用。所述应用包括在禽类养殖中的应用，优选地，所述应用包括用于提高禽类产蛋品质；在制备酸奶中的应用，优选地，所述应用包括用于提高酸奶细腻醇厚品质；在制备咀嚼片中的应用，优选地，所述应用包括使所述咀嚼片能够调整肠道菌群平衡，促进肠道益生菌群增殖。

本发明的诱变方法采用了物理诱变和化学诱变相结合的方式，利用物理诱变效率高、操作简便的特性，以及化学诱变对基因组损伤小，突变效率高，处理成本低，简单易行容易操作，然后通过菌株产酸圈、菌体直径、耗碱量和产气速度初筛复筛，并用高效液相色谱法确证，最终筛选出稳定、高产的菌株。本发明得到的丁酸梭菌菌种产酸能力明显提高。

附图说明

图1紫外线初筛平板的照片。

图2紫外诱变复筛结果。

图3亚硝酸钠诱变复筛结果。

图4亚硝酸钠二次诱变初筛及复筛结果。

图5诱变菌株nn-2的遗传稳定性结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

实施例1

本实施例为微生物的诱变方法例。具体地，包括以下步骤：

(1)培养基配方

生长培养基，包括液体培养基和固体培养基。液体培养基：葡萄糖10g/l，酵母粉8g/l，氯化钠2g/l，硫酸镁0.5g/l，ph6.0；固体培养基：液体培养基加琼脂15-20g/l，ph6.0。

筛选培养基：生长培养基中加1％碳酸钙和0.04％溴甲酚紫，ph7.0。

(2)菌悬液的制备：挑取实验室保存的丁酸梭菌菌株一环，接入生长培养基中，活化，37℃静止培养，取对数生长期的种子液进行诱变。将种子液在5000rpm的条件下离心5min，弃上清液，沉淀用ph7.0磷酸缓冲液洗涤两次，菌体经玻璃珠打散，制成1×10⁷cfu/ml的菌悬液。

(3)紫外线诱变时间的确定：步骤(2)中得到的菌悬液取3ml，紫外灯分别照射0-60min后，取一定的稀释倍数涂平板，箱中，37℃避光厌氧培养24h，计算致死率。选择致死率为75％的诱变时间10min。

(4)紫外线诱变初筛：按照上述确定的诱变时间，对原始丁酸梭菌菌种进行10min紫外诱变，从200株诱变的菌落中筛选出了14株表现良好的阳性菌株，筛选出的诱变菌株较原始菌株产酸能力(l/d)高出15％以上。结果如图1所示。

(5)紫外线诱变复筛：将上述筛选出的14株阳性菌株进一步进行复筛。以酸碱滴定法衡量其产酸总量，并在培养的过程中观测产气泡的时间以衡量菌体生长的速度，以产酸量及生长快慢为筛选菌株的综合衡量指标，筛选出一株优良的阳性菌株(cu-5)。产酸量在初筛的基础上提高了1.3倍。结果如图2所示。

(6)亚硝酸钠诱变初筛：取紫外线诱变得到的优良阳性菌株，按照(2)制备好菌悬液1ml，加入1mol/lph＝4.5的醋酸缓冲溶液1ml及0.1mol/l的亚硝酸钠1ml，26℃保温30min后，加入0.07mol/l的磷酸二氢钠(ph＝8.6)20ml终止反应。取一定稀释倍数的反应液涂平板，37℃厌氧培养24h，鉴别平板中诱变菌株的产酸能力(l/d)。从180株经过诱变的菌落中筛选出了12株表现良好的菌株，筛选出的诱变菌株较的产酸能力(l/d)提高了高出28.5％以上。

(8)亚硝酸钠诱变复筛：对经亚硝酸钠诱变初筛筛选出的12株阳性菌株进行复筛，以酸碱滴定法测的产酸量和最先产气泡产生时间跟踪的生长速度为指标，筛选出一株表现良好的阳性菌株(un-8)。产酸量在初筛的基础上提高了1.1倍。结果如图3所示。

(9)亚硝酸钠二次诱变：对上述经亚硝酸钠诱变后的优良菌株un-8进行二次亚硝酸钠诱变，诱变条件同上。以测定产酸能力(l/d)为判别指标，从120株菌株中筛选出阳性菌株13株。进一步对所选阳性菌株进行复筛实验得到一株优良菌株(nn-2)。总产酸量在原有基础上提高了1.1倍。结果如图4所示。

对于得到的菌株nn-2，鉴定其遗传稳定性。具体方法如下：上述复合条件下得到的诱变菌株连续传代十代，产酸量和生长速度没有降低的趋势，说明诱变菌株nn-2遗传性状稳定。用高效液相色谱检测丁酸产量的结果表明，与原始菌株相比，丁酸产量提高了1.3倍，总产酸量约提高了1.6倍，结果如图5所示。将菌株nn-2于2019年3月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmccno：17327。

实施例2

本实施例为丁酸梭菌的应用实验例。

选取体重均匀、健康的蛋鸡1000只，随机分为2组(对照组和丁酸梭菌组)，每组500只。其中对照组投料为正常鸡饲料，丁酸梭菌组在正常鸡饲料的基础上以0.2g/kg的量添加菌株nn-2。除此之外，两个试验组中的鸡在相同条件下自由采食和饮水。试验期30天。

在产蛋期收集鸡蛋，统计产蛋率，并在每组中随机取50枚测定其中的胆固醇和蛋白质含量。结果发现丁酸梭菌组中，产蛋率提高2％；鸡蛋中胆固醇降低33％，蛋白质提高22.4％，显著提高鸡蛋品质。

实施例3

本实施例为丁酸梭菌的应用实验例。

将5％白砂糖加入到预热至63～65℃的原料奶中调配，搅拌溶解，均质，使其更加均匀稳定，95℃加热灭菌，保温10min后取出。当杀菌后的原料乳冷却至42～45℃时，加入6％丁酸菌进行接种，搅拌混匀。将接种后的酸奶37℃恒温发酵培养，12h后终止发酵，取出置于4℃冷藏后熟15h，以赋予酸奶良好的口感和风味，制得丁酸菌发酵酸奶。

制得的丁酸菌发酵酸奶，质地细腻，口感柔和，风味醇厚，表面柔滑，凝乳稳定，不分层，无乳清析出，有酸奶特有香味，营养丰富。

实施例4

本实施例为丁酸梭菌的应用实验例。

将验收来的鲜奶过滤，在纯牛奶中加入适量白砂糖，溶解后过滤，均质，以提高其稳定性。95℃灭菌5min。灭菌后，将原料乳冷却到40℃。接入丁酸梭菌2％、保加利亚乳杆菌2％、嗜热乳杆菌2％(1:1:1)混合菌种。将接种后的酸奶放入40℃恒温发酵培养，10h后终止发酵，取出置于4℃冰箱冷藏后熟15h取出,以赋予酸奶良好的口感和风味。

制得的酸奶组织细腻，无杂质，无气泡，口感顺滑，无砂质感，有浓郁的牛乳脂香，风味醇厚。

实施例5

本实施例为丁酸梭菌的应用实验例。

将培养得到的丁酸菌，加入脱脂奶粉10％、谷氨酸钠1％复配的冻干保护剂冷冻干燥，得到丁酸梭菌冻干粉。冻干粉菌数均达1×10¹¹cfu/g。将得到的丁酸菌菌粉与干酪乳杆菌菌粉(1×10¹¹cfu/g)、双歧杆菌菌粉(1×10¹¹cfu/g)混合(1:1:1)，再混入食用葡萄糖、麦芽糊精、山梨糖醇、硬脂酸镁，粉碎过筛，所得物均匀喷施浓度为6％的果胶乙醇溶液，使其能够捏造成粒，造粒后再压片成型，于30℃通风干燥60小时，遮光密封真空保存，得到混合益生菌咀嚼片。

该咀嚼片成型完整，味道酸甜适口，稳定性良好，能够调整肠道菌群平衡，促进肠道益生菌群的增殖。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。