一种新型磷脂酶D的制作方法

技术领域：
：本发明属于酶的基因工程
技术领域：
，具体涉及通过重叠pcr技术体外定向进化获得比酶活提高的磷脂酶d突变体，并提供由高活力磷脂酶d催化制备磷脂酸和磷脂酰丝氨酸的方法。
背景技术：
：磷脂酶d(pld)分布广泛，存在于各种动植物和微生物中。pld对磷脂分子中的磷酰氧键p-o起作用，其生物催化作用主要体现在两种反应：(1)水解磷脂上的末端磷酸酯键生成磷脂酸和羟基化合物；(2)当有另一种含羟基的化合物存在时，可催化磷脂酰基与其结合，形成新的磷脂，即磷脂酰基转移反应。磷脂酸(phosphatidicacid,pa)是一种简单而又常见的磷脂，广泛存在于动植物细胞中，是动植物细胞生物膜的基本成分。pa由甘油骨架、1或2号位的脂肪酸基团、3号位的磷酸基组成。pa是pld作用的直接产物，pa能够带动ca2+激活或协同激活细胞内各种酶，与此同时，pa还可促进细胞有丝分裂、促进细胞内超氧化物的形成、引起肌肉的收缩、促进激素分泌、诱发血小板聚集等作用。基于以上作用，pa可应用在食品工业、医药工业、化妆品等方面。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)是一类普遍存在的磷脂，通常位于细胞膜内层，是细胞膜的重要组成部分，由于参与一系列膜功能反应，尤其在人体的神经系统中，是大脑细胞膜的重要组分之一，其对改善记忆力、缓解压力、修复大脑损伤、治疗儿童多动症、抑郁症以及预防老年痴呆症等作用效果显著。但具有一定纯度磷脂酰丝氨酸自然界中含量稀少，故制备纯度高、质量好的磷脂酰丝氨酸产品具有重要意义。酶法制备磷脂酸或磷脂酰丝氨酸是指在一定条件下，用pld催化底物(如pc)反应生成磷脂酸或磷脂酰丝氨酸，该方法相比化学合成具有反应条件温和、副产物少、产品得率高、质量好等优点。生产磷脂酸或磷脂酰丝氨酸的不同点在于pld催化反应类型不同，前者属于水解反应，后者则是通过使用pld的磷脂酰基移转(transphosphatidylation)反应，对磷脂的头基进行修饰。酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，属于蛋白质工程的范畴。通常手段是利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏、高通量的筛选技术，从而能够在短时间内得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的改构酶，与此不同，需要事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，并根据这些因素有的放矢做对其dna进行改造的是定点突变。定点突变，又称为理性设计，就是在已知的dna序列中插入、缺失或取代一定长度的核苷酸序列，由于其迅速、高效的提高dna所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。本发明所使用的重叠pcr技术是定点突变技术的一种，该技术可以简单、快速的将两个或多个基因片段通过末端互补、重叠延伸进行体外基因的拼接。重叠pcr技术可以获得依靠限制性内切酶消化难以得到的产物，并且方便快速，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌。许多枯草芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素，并且属于人体肠道菌促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道ph值，间接抑制其它致病菌生长，此外其能够高效地分泌各种蛋白质，在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究的也十分清楚，密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、对培养基无特殊要求等优点。毕赤酵母属于单细胞低等真核生物，是表达外源基因比较理想的工具。它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，还因为含有特有的强有力的aox(醇氧化酶基因)启动子，可用甲醇严格地调控外源基因的表达。另外，培养成本低，产物易分离。所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐。能够对外源蛋白基因进行稳定遗传，且作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型。此外，毕赤酵母细胞表面展示系统不但具有外源基因的翻译后加工能力和蛋白的折叠加工及适度糖基化等优点，而且，经该系统得到的全细胞催化剂可以重复利用从而降低生产成本。在本发明中，高活力磷脂酶d基因及其突变体基因分别在枯草芽孢杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中表达，得到产高活力磷脂酶d，纯化后与底物反应，催化制备磷脂酸、磷脂酰丝氨酸。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高活力磷脂酶d，及利用其制备磷脂酸和磷脂酰丝氨酸的方法。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一为：一种磷脂酶d突变体，是基于seqidno.2所示的磷脂酶d氨基酸序列，其中的第139、209、256、388、519位中的至少一个氨基酸被置换为以下氨基酸：第139位：asp139ile；第209位：asn209ile；第256位：asp256thr；第388位：gln388cys；第519位：asp519val；所述突变体的基因，是以郝氏链霉菌(streptomyceshalstedii)tccc21102基因组为模板，克隆出磷脂酶d野生型基因pld(如seqidno:1所示)后，通过酶切、连接等构建重组载体，之后由重叠pcr技术对野生型磷脂酶d基因进行定点突变，得到突变体基因(见表1)。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之二为：将上述突变体基因重新构建重组载体，并在枯草芽孢杆菌wb600和毕赤酵母gs115中的高效表达，得到产高活力磷脂酶d的重组菌株，通过发酵、提取等技术获得高活力磷脂酶d。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之三为：采用本发明制备的高活力磷脂酶d分别催化磷脂酰胆碱制备磷脂酸、催化磷脂酰胆碱和丝氨酸制备磷脂酰丝氨酸。在本发明中采用如下定义：1.氨基酸和dna核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。2.磷脂酶d突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示磷脂酶d突变体中突变的氨基酸。如asn209ile，表示位置209的氨基酸由野生型磷脂酶d的asn替换成ile。位置的编号对应于seqidno：2中磷脂酶d的氨基酸序列编号.核苷酸的变化同样采用“原始核苷酸位置替换的核苷酸”来表示，位置编号对应seqidno：1中野生型磷脂酶d的核苷酸序列编号。在本发明中，pld表示野生型磷脂酶d的氨基酸序列，即原始序列(如seqidno：2所示)。用pldm加数字x的方式表示各个突变体，x分别为139、209、256、388、519，其中139代表第139氨基酸由asp替换成ile，209代表第209位氨基酸由asn替换成ile，256代表第256位氨基酸由asp替换成thr，388代表第388位氨基酸由gln替换成cys，519代表第519位氨基酸由asp替换成val；x也可以是xm-…-xn的形式，表示若干位点的组合突变体，如pldm139-209表示第139氨基酸由asp替换成ile，第209位氨基酸由asn替换成ile的突变体。各突变体的编码基因则以其氨基酸表示形式的斜体表示，如突变体pldm139的编码基因为pldm139。本发明中，氨基酸的组合突变，包含如下：pldm139-209、pldm139-256、pldm139-388、pldm139-519、pldm209-256、pldm209-388、pldm209-519、pldm256-388、pldm256-519、pldm388-519、pldm139-209-256、pldm139-209-388、pldm139-209-519、pldm139-256-388、pldm139-256-519、pldm139-388-519、pldm209-256-388、pldm209-256-519、pldm209-388-519、pldm256-388-519、pldm139-209-256-388、pldm139-209-256-519、pldm139-209-388-519、pldm139-256-388-519、pldm209-256-388-519、pldm139-209-256-388-519；表1：序列对照表所述的磷脂酶d及其突变体的表达宿主为枯草芽孢杆菌wb600，表达载体为pbsa43；所述的磷脂酶d及其突变体的表达宿主为毕赤酵母gs115，表达载体为ppic9k；所述的磷脂酶d突变体的宿主细胞为毕赤酵母gs115，展示载体为ppic9k-flo。本发明的实验步骤具体如下：1、一种构建高活力磷脂酶d突变体编码基因的过程包括如下步骤：(1)将来自郝氏链霉菌(streptomyceshalstedii)tccc21102的野生型磷脂酶d基因与载体puc-t连接，构建重组质粒puc-t-pld，通过重叠pcr定点突变野生型磷脂酶d基因，得到高活力磷脂酶d突变体编码基因；(2)将含有高活力磷脂酶d突变体编码基因的puc-t-pldmx保存。2、一株含有高活力磷脂酶d基因的枯草芽孢杆菌重组菌株及以此制备高活力磷脂酶d的过程包括如下步骤：(1)将保存的含有高活力磷脂酶d突变体编码基因的puc-t-pldmx进行酶切，将得到的高活力磷脂酶d突变体编码基因与载体大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pbsa43通过连接得到了新的重组载体；(2)将重组载体转化入枯草芽孢杆菌wb600中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高活力磷脂酶d。3、一株含有高活力磷脂酶d基因的毕赤酵母重组菌株及以此制备高活力磷脂酶d的过程包括如下步骤：(1)将保存的含有高活力磷脂酶d突变体编码基因的puc-t-pldmx进行酶切，将得到的高活力磷脂酶d突变体编码基因与表达载体ppic9k通过连接得到新的重组载体；(2)将重组载体转化入毕赤酵母gs115中，得到的重组菌株经过遗传霉素筛选和磷脂酶d的酶活测定，得到高活力磷脂酶d的高产菌株；(3)之后进行发酵，制备高活力磷脂酶d。4、一株含有高活力磷脂酶d的毕赤酵母细胞表面展示重组菌株及以此制备高活力磷脂酶d全细胞催化剂的过程包括如下步骤：(1)将保存的含有高活力磷脂酶d突变体编码基因的puc-t-pldmx进行酶切，将得到的高活力磷脂酶d突变体编码基因与毕赤酵母展示载体ppic9k-flo通过连接得到新的重组载体；(2)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母gs115中，得到毕赤酵母细胞表面展示磷脂酶d重组菌株。(3)将重组菌株发酵后制备酵母细胞表面展示高活力磷脂酶d全细胞催化剂。5、利用本发明所述磷脂酶d生产磷脂酸、磷脂酰丝氨酸的方法。有益效果：1、本发明利用重叠pcr技术对野生型磷脂酶d进行定点突变(pldm139、pldm209、pldm256、pldm388、pldm519、pldm139-209、pldm139-256、pldm139-388、pldm139-519、pldm209-256、pldm209-388、pldm209-519、pldm256-388、pldm256-519、pldm388-519、pldm139-209-256、pldm139-209-388、pldm139-209-519、pldm139-256-388、pldm139-256-519、pldm139-388-519、pldm209-256-388、pldm209-256-519、pldm209-388-519、pldm256-388-519、pldm139-209-256-388、pldm139-209-256-519、pldm139-209-388-519、pldm139-256-388-519、pldm209-256-388-519、pldm139-209-256-388-519)，得到高活力磷脂酶d，在37℃下，上述高活力磷脂酶d比野生型磷脂酶d酶活至少提高了38.2％。2、本发明分别使用了枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统、毕赤酵母表面展示系统，高活力磷脂酶d在各表达系统内发酵酶活最高值分别为36.8u/ml、48.1u/ml、140.2u/(g·细胞干重)，较野生型提高140％左右。3、本发明采用高活力磷脂酶d生产磷脂酸和磷脂酰丝氨酸的转化率分别为72.4％和78.5％，尤其是酵母展示系统的运用，将磷脂酶d展示于酵母表面，酵母细胞在生产磷脂酶的同时又充当了固定化载体，极大的降低了成本。附图说明：图1为本发明野生型磷脂酶d基因的pcr扩增电泳图其中：m为dnamarker，1为磷脂酶d基因；图2为本发明重组质粒pbsa43-pldmx酶切验证图其中：m为dnamarker，1为pbsa43-pldmx经bamhi和hindiii双酶切；图3为本发明重组质粒ppic9k-pldmx酶切验证图其中：m为dnamarker，1为ppic9k-pldmx经ecori和noti双酶切；图4为本发明重组质粒ppic9k-flo-pldmx酶切验证图其中：m为dnamarker，1为ppic9k-flo经过snabi和ecori双酶切，2为ppic9k-flo经过snabi单酶切，3为ppic9k-flo-pldmx经过snabi和ecori双酶切。具体实施方式：下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。实施例1：野生型磷脂酶d基因的获得1.野生型磷脂酶d基因来自郝氏链霉菌(streptomyceshalstedii)tccc21102，提取其基因组dna。其中郝氏链霉菌基因组dna的提取步骤如下：(1)从培养菌体的平板上挑取一环菌接种于50ml适当培养基中，26℃，150r/min培养2-3d。(2)之后取1ml培养液于1.5mlep管中，8000r/min离心20min，倒上清，用200μl溶液i或灭菌水重悬。(3)加20-50μl的50mg/ml溶菌酶在37℃下消化0.5-1h。(4)加入100μl的2％sds溶液，充分反应至菌悬液呈现粘稠状。(5)加入等体积的tris平衡酚：氯仿＝1：1，混合均匀，12000rpm离心5min，将上清转移到另一ep管中。(6)反复抽提两次，直至无蛋白层出现，最后再用等体积氯仿抽提一次。(7)加入等体积的异丙醇沉淀dna，12000r/min离心5min，弃去上清，用500μl75％乙醇洗涤2次，每次吹打后12000r/min离心5min。(8)将ep管倒置于滤纸或置于55℃金属浴中，晾干至无酒精味后用te缓冲液或灭菌水溶解，-20℃保存。2.由磷脂酶d基因设计野生型磷脂酶d基因的扩增引物，序列如下：上游p1(seqidno：5)：atgatcaaggttggtggtgttgctg下游p2(seqidno：6)：ttaaccctgacacaaacctctagcgtaatcgtpcr扩增的反应体系为50μl，其组成为：2×labuffer25μldntps(2.5mmol/l)2μl上游引物p1(20μmol/l)5μl下游引物p2(20μmol/l)5μl郝氏链霉菌基因组dna2μllataqdna聚合酶0.5μlddh2o10.5μl总体积50μl扩增程序的设置为：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：70℃45；d.延伸：72℃90s；e.b-d反应30个循环；f.延伸:72℃10min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型磷脂酶d基因的条带，共1683bp(见图1)，再由小量dna回收试剂盒回收pcr产物，得到了野生型磷脂酶d基因，即pld。实施例2：获得高活力磷脂酶d基因，以asn209ile单个氨基酸突变体为例，最终氨基酸序列如表1所示。1.野生型磷脂酶d基因与t载体进行连接。纯化后的pld与puc-t载体进行连接，随后将重组质粒化转入大肠杆菌dh5α中，通过ecori、mlui双酶切，成功验证野生型磷脂酶d基因已克隆至t载体上。2.由重叠pcr技术进行单一位点的定点突变基于重叠pcr技术进行定点突变，以得到高活力磷脂酶d，设计引物如下：上游p1(seqidno.5)：atgatcaaggttggtggtgttgctg下游p2(seqidno.6)：ttaaccctgacacaaacctctagcgtaatcgt重叠引物p3(seqidno.7)：atggaagcaacgatcaaagtgatgttagcagcagca重叠引物p4(seqidno.8)：tgctgctgctaacatcactttgatcgttgcttccat重叠引物p3与p4包含了对209位氨基酸残基的突变。将重组质粒puc-t-pld，即野生型磷脂酶d基因与puc-t载体连接的重组载体，为模板进行pcr扩增；pcr1，反应体系为50μl，其组成为：2×labuffer25μldntps(2.5mmol/l)2μl上游引物p1(20μmol/l)5μl下游引物p4(20μmol/l)5μl重组质粒puc-t-pld2μllataqdna聚合酶0.5μlddh2o10.5μl总体积50μlpcr2，反应体系为50μl，其组成为：2×labuffer25μldntps(2.5mmol/l)2μl上游引物p3(20μmol/l)5μl下游引物p2(20μmol/l)5μl重组质粒puc-t-pld2μllataqdna聚合酶0.5μlddh2o10.5μl总体积50μlpcr1和pcr2扩增程序的设置为：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：68℃30s；d.延伸：72℃45s；e.b-d反应10个循环；f.延伸:72℃10min。pcr3，反应体系如下：2×buffer25μldntps(2.5mmol/leach)2μlpcr1产物1μlpcr2产物1μllataqdna聚合酶0.5μlddh2o20.5μl总体积50μlpcr3扩增程序的设置为：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：70℃45s；d.延伸：72℃90s；e.b-d反应10个循环；f.延伸:72℃10min。pcr4，反应体系如下：2×buffer25μldntps(2.5mmol/leach)2μl上游引物p1(20μmol/l)5μl下游引物p2(20μmol/l)5μlpcr3产物2μllataqdna聚合酶0.5μlddh2o10.5μl总体积50μlpcr4扩增程序的设置为：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：70℃45s；d.延伸：72℃90s；e.b-d反应30个循环；f.延伸:72℃10min。最终得到的pcr产物进行测序(北京华大生物工程公司)，结果表明，此时扩增得到asn209ile的磷脂酶d基因片段pldm209。实施例3：在单个氨基酸突变的基础上获得多个氨基酸突变的磷脂酶d变体，以重叠pcr技术在asn209ile突变体的基础上进行asp139ile、asp256thr、gln388cys、asp519val突变为例，最终氨基酸序列如seqidno：4所示。具体策略是：先在单个突变的基础上实现双突变，随后进行第三、第四和第五个氨基酸的突变。首先在asn209ile基础上实现asp519val的突变，步骤与实施例2一致，设计重叠引物，如下：上游p1(seqidno.5)：atgatcaaggttggtggtgttgctg下游p2(seqidno.6)：ttaaccctgacacaaacctctagcgtaatcgt重叠引物p5(seqidno.9)：caacaacgtaaccgaagacttgcaaccaggatggg重叠引物p6(seqidno.10)：cccatcctggttgcaagtcttcggttacgttgttg重叠引物p5与p6包含了对519位氨基酸残基的突变。将重组质粒puc-t-pldm209，即编码突变体pldm209的基因与puc-t载体连接的重组载体，为模板进行pcr扩增；pcr1，反应体系为50μl，其组成为：2×labuffer25μldntps(2.5mmol/l)2μl上游引物p1(20μmol/l)5μl下游引物p6(20μmol/l)5μl重组质粒puc-t-pldm2092μllataqdna聚合酶0.5μlddh2o10.5μl总体积50μlpcr2，反应体系为50μl，其组成为：pcr1和pcr2扩增程序的设置为：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：68℃30s；d.延伸：72℃45s；e.b-d反应10个循环；f.延伸:72℃10min。pcr3，反应体系如下：2×buffer25μldntps(2.5mmol/leach)2μlpcr1产物1μlpcr2产物1μllataqdna聚合酶0.5μlddh2o20.5μl总体积50μlpcr3扩增程序的设置为：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：70℃45s；d.延伸：72℃90s；e.b-d反应10个循环；f.延伸:72℃10min。pcr4，反应体系如下：pcr4扩增程序的设置为：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：70℃45s；d.延伸：72℃90s；e.b-d反应30个循环；f.延伸:72℃10min。最终得到的pcr产物进行测序(北京华大生物工程公司)，结果表明，此时扩增得到asn209ile和asp519val双突变的磷脂酶d基因片段pldm209-519，序列如表1所示。继续进行其他各个突变步骤与实施例2或/和实施例3步骤一致，所有突变体引物序列见下表，在pldm209-519的基础上按上述步骤，仅按下表更换引物，依次进行asp139ile,asp256thr,gln388cys的点突变，并送至测序公司测序，确认得到5个氨基酸突变点的磷脂酶d基因片段pldm139-209-256-388-519，氨基酸序列如seqidno.4所示，核苷酸序列如seqidno.3所示。突变体f端引物r端引物pldm139p7:seqidno.11p8:seqidno.12pldm209p3:seqidno.7p4:seqidno.8pldm256p9:seqidno.13p10:seqidno.14pldm388p11:seqidno.15p12:seqidno.16pldm519p5:seqidno.9p6:seqidno.10实施例4：枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶d重组菌的构建1.表达载体pbsa43的构建以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pbe2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子p43和能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacb获得了表达载体pbsa43。它带有ampr和kmr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记，同时又可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。2.构建高活力磷脂酶d表达载体pbsa43-pldmx将重叠pcr构建的高活力磷脂酶d基因与枯草芽孢杆菌表达载体pbsa43都经bamhi和hindiii双酶切，随后进行连接，构建得到重组质粒pbsa43-pldmx，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证并测序，确定构建成功，即获得重组菌株pbsa43-pldmx。3.表达载体pbsa43-pldmx转化枯草芽孢杆菌wb600向预冷的1mm电转杯中加入60μl感受态细胞中和1μl(50ng/μl)pbsa43-pldmx，混匀并冰浴5min，设置参数(25μf，200ω，4.5-5.0ms)，电击一次，随后立即加入1ml复苏培养基(lb+0.5mol/l山梨醇+0.5mol/l甘露醇)，混匀后吸取至1.5mlep管中，37℃摇床震荡培养3h，离心后留取200μl复苏物涂布在具有抗性的lb平板上，37℃培养24h，挑取转化子，提质粒、酶切验证(如图2所示)，得到枯草芽孢杆菌重组菌株wb600/pbsa43-pldmx。实施例5：构建毕赤酵母高活力磷脂酶d游离表达重组菌1.高活力磷脂酶d表达载体ppic9k-pldmx的构建将重叠pcr纯化产物和毕赤酵母表达载体ppic9k经过ecori和noti双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，选择ampr的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功(如图3所示)，即得到重组表达载体ppic9k-pldmx。2.构建高活力磷脂酶d高表达重组菌株(1)质粒dna的线性化在转化毕赤酵母之前，分别用saci和sali限制性内切酶对重组表达质粒ppic9k-pldmx进行线性化酶切。(2)线性化质粒ppic9k-pldmx电转至毕赤酵母①将感受态细胞与线性化质粒ppic9k-pldmx加入到1.5ml预冷的离心管中，吹打混匀，随后加入预冷的电转杯中；②对转化杯冰浴10min，随后电转化；③电击后，立即加入1ml预冷的1mol/l的山梨醇溶液于电转杯中，并将电转液转移到新的1.5ml离心管中；④30℃静置培养1-2h，吸取毕赤酵母gs115电转液200μl涂布在md培养基上。(3)阳性转化子的鉴定及磷脂酶d高产菌株的筛选①涂有电转液的md平板在30℃培养2-3d；②挑取转化子，提取酵母基因组，稀释100倍后作为模板进行pcr。另以转入空质粒ppic9k的毕赤酵母gs115/ppic9k作为对照，确定阳性转化子。③确定阳性转化子后，先挑取在含不同浓度遗传霉素抗性平板上单菌落比较大的高遗传霉素抗性转化子，随后分别测定挑选出的转化子的磷脂酶d酶活，从而得到磷脂酶d的高产菌株gs115/ppic9k-pldmx。实施例6：毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶d重组菌的构建1.重组质粒ppic9k-flo-pldmx的构建将重叠pcr纯化产物和毕赤酵母表面展示表达载体ppic9k-flo经过snabi和ecori双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌dh5α感受态中，选择ampr的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功(如图4所示)，即得到重组表达载体ppic9k-flo-pldmx。2.毕赤酵母重组菌的构建将测序验证正确的重组表达载体ppic9k-flo-pldmx经sali线性化后，用电转化法转化毕赤酵母gs115，md平板筛选重组子，获得毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶d重组菌gs115/ppic9k-flo-pldmx。实施例7：高活力磷脂酶d在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备①将枯草芽孢杆菌重组菌株wb600/pbsa43-pldmx接种于含卡纳霉素(50μg/ml)lb液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；②按1％接种量转接于50ml的lb培养基中，37℃，220r/min培养48h，即得到高活力磷脂酶d粗酶液；③随后采用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力磷脂酶d纯酶酶粉。实施例8：高活力磷脂酶d在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备①挑取ypd平板上的毕赤酵母重组菌gs115/ppic9k-pldmx接种至50ml的ypd液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；②以1％的接种量转接至bmgy培养基中，30℃，250r/min培养约24h，随后4000r/min离心5min得到菌体，转接至bmmy培养基；③继续培养，30℃，250r/min，每隔24h补加250μl甲醇。在培养5天后，离心得上清，即得到磷脂酶d的粗酶液；④然后采用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力磷脂酶d纯酶酶粉。实施例9：毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶d全细胞催化剂的制备①挑取ypd平板上的毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶d重组菌gs115/ppic9k-flo-pldmx接种至50ml的ypd液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；②以1％的接种量转接到新鲜bmgy培养基中，30℃，250r/min培养约24h，随后4000r/min离心5min得到菌体，转接至bmmy培养基；③继续培养，30℃，250r/min，每隔24h补加250μl甲醇。在培养5天后，离心收集取菌体，用过膜水冲洗1-2次，加入保护剂后经真空冷冻干燥制得毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶d细胞催化剂。实施例10：磷脂酶d活力测定1.磷脂酶d酶活测定原理采用酶联比色法进行活性检测：磷脂酶d催化水解l-α-卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亚胺显色物质，在500nm波长下有吸光值。2.磷脂酶d酶活测定方法(1)卵磷脂乳液：0.345g卵磷脂，2ml乙醚，3ml7.5％tritanx-100，20mlh2o，充分混匀。(2)反应终止液：1mtris-hcl，0.5medta，ph8.0磷脂酶d的测定步骤：10ml试管内加入1.15ml卵磷脂乳液，0.1ml100mmtris-hcl，0.05mlcacl2，0.1ml粗酶液，37℃水浴反应10min，随后加入0.2ml反应终止液，煮沸5min，冷至室温。随后加入含有2u含胆碱氧化酶、4u过氧化酶、2mg4-安替比林、1mg苯酚、20mgtritanx-100的4ml10mmtris-hcl，37℃反应20min，随后在500nm处测吸光值。空白样品以水取代反应中的酶液，以此调零。酶活定义：ph＝8.0、t＝37℃时，磷脂酶d1min内催化水解l-α-卵磷脂释放1.0μmol的胆碱所需要的酶量。磷脂酶d酶活测定，测定发酵得到的高活力磷脂酶d的酶活列表如下：实施例11：以高活力磷脂酶d制备磷脂酸底物为1g大豆卵磷脂(pc含量90％)，溶于10mlph7.0的磷酸缓冲液中，按每毫升的反应体系加入3u高活力磷脂酶d，其中高活力磷脂酶d为本发明实施例7-9制备(可由任意突变体发酵得到，催化时酶粉添加量达到3u/ml即可)。反应温度40℃，在磁力搅拌器搅拌作用下反应12h，随后通过30ml氯仿/甲醇(2：1)萃取获得磷脂酸，其制备磷脂酸的转化率为72.4％。实施例12：以高活力磷脂酶d制备磷脂酰丝氨酸底物为1g大豆卵磷脂(pc含量90％)和2.5g的丝氨酸，分别溶于5mlph5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液中，最后混合，至使总体积为10ml，按每毫升的反应体系加入6u高活力磷脂酶d，其中高活力磷脂酶d为本发明实施例7-9制备(可由任意突变体发酵得到，催化时酶粉添加量达到6u/ml即可)。反应温度40℃，在磁力搅拌器搅拌作用下反应12h，随后通过30ml氯仿/甲醇(2：1)萃取获得磷酯酰丝氨酸，其制备磷脂酰丝氨酸的转化率为78.5％。序列表<110>天津科技大学<120>一种新型磷脂酶d<130>1<141>2019-06-18<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1683<212>dna<213>郝氏链霉菌(streptomyceshalstediitccc21102)<400>1atgatcaaggttggtggtgttgctgacccaagatctagaccagaaccaccaccatctcag60ggtactactttggctagaactgttagaactactgctttggtttccacttccgctttggct120ttgggtttctctttgttgggtgctactgctactgttccagcttacgctgctgaagctcca180actccacatttggactctgttgagcagactttgagacaggtttctccaggtttggaaggt240tccgtttgggaaagaactgctggtaacagattgggttcttccactccaggtggtgctgat300tggttgttgcaaactccaggttgttggggtgatgctgcttgtactgatagaccaggttct360agaagattgttggacaagatgagacaggacattgctggtgctagacagactgttgacatc420tccactttggctccatttccaaacggtggttaccaggatgctatcgttgctggtttgaaa480gagtccgctcagaagggaaacagattgaaggttagaatcatggttggtgctgctccaatc540taccactctactgttattccatcctcctacagagatgagttgttggctaagttgggtcca600gctgctgctgctaacatcactttgaacgttgcttccatgactacttccaagacttccttc660tcttggaaccactccaagttgatcgttgttgacggtggttccgttatcactggtggtatc720aactcttggaaggacgactacttggacactactcacccagtttctgacgttgacttggct780ttgtctggtcctgctgctggttctgctggtagatacttggattctttgtgggactggact840tgtagaaacaagggtaactggtcctccgtttggttcgctgcttcttctggtgctgactgt900atgccagctttgccaagaccagctactcctgaaggtggtggtgatgttcctgctttggct960gttggtggtttgggtgttggtattagacagaacgaccctacttcctcattcagaccagtt1020ttgcctactgctggtgacactaagtgtggtattggtgtttccgacaagactaacgctgac1080agagactacgacactgttaacccagaagaatccgctttgagagctttggtttcttccgct1140acttcccacattgagatttcccaacaagacgttcacgctacttgtccaccattgccaaga1200tacgaggttagattgtacgacgctttggctgctaagttggtttccggtgttaaggttaga1260atcgttgtttccgacccagctaacagaggtactattggatctggtggttactcccagatc1320aagtccttgtctgaagtttccgatgctttgagaggtagagttactgctttgactggtgac1380ggtggtagagctagaactgctttgtgtgagaacttgcagttggctactttcagagcttct1440gacaagccaacttgggctgatggtaagccatacgctcaacaccacaaattggtttctgtt1500gacggatccgctttctacatcggatccaagaacttgtacccatcctggttgcaagacttc1560ggttacgttgttgaatctcctgccgctgctgctcagttgagaactgatttgttggatcct1620cagtggagatactcccaggctacagctacttacgattacgctagaggtttgtgtcagggt1680taa1683<210>2<211>560<212>prt<213>郝氏链霉菌(streptomyceshalstediitccc21102)<400>2metilelysvalglyglyvalalaaspproargserargproglupro151015proproserglnglythrthrleualaargthrvalargthrthrala202530leuvalserthrseralaleualaleuglypheserleuleuglyala354045thralathrvalproalatyralaalaglualaprothrprohisleu505560aspservalgluglnthrleuargglnvalser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