非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒的制作方法

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒。
背景技术：
：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,nafld)，指的是与胰岛素抵抗和遗传易感有关的一类代谢应激性肝损伤疾病，包括非酒精性脂肪性肝变(non-alcoholichepaticsteatosis)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，nash)、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)。目前，随着肥胖症、2型糖尿病(type2diabetesmellitus,t2dm)和代谢综合征(metabolicsyndrome,mets)等疾病的流行，与之密切相关的nafld已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝脏生化指标异常的首因。此外，乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)慢性感染者合并nafld也愈发常见，严重危害国民生命健康和生活质量。研究发现，nafld具有家族聚集性及遗传倾向。欧洲肝病学会非酒精性脂肪性肝病临床实践指南《easl-easd-easoclinicalpracticeguidelinesforthemanagementofnon-alcoholicfattyliverdisease》中指出，pnpla3和tm6sf2等相关基因位点上的突变会增加非酒精性脂肪性肝病发病及恶化的风险。此外，亚洲地区非肥胖症人群(bmi<25kg/m2)中nafld的流行率约为20％，导致其发病的众多因素中遗传风险的影响可能比肥胖症人群更大。目前通过全基因组关联研究(gwas)发现大量与各种常见疾病相关的遗传学标志位点，数十个与nafld有关联的遗传易感性位点被发现，根据人群地域的不同这些位点的风险大小也不同。各项研究结果显示部分易感位点在nafld的发生和发展过程中可能发挥着重要作用，主要有pnpla3rs738409c>g、tm6sf2rs58542926c>t、gckrrs780094t>c等。pnpla3，patatin样磷脂酶域蛋白3，主要在脂肪细胞和肝细胞中表达，编码脂肪滋养蛋白，该蛋白具有脂肪酶和甘油转乙酰酶活性，调节肝脏甘油三酯代谢。rs738409c>g突变导致pnpla3蛋白的148位氨基酸由异亮氨酸变为蛋氨酸，阻止底物与酶活性位点的结合，脂肪水解活性下降，引起甘油三酯在肝脏细胞内蓄积。tm6sf2，跨膜蛋白6超家族成员2，在脑组织、肾脏、肝脏及小肠表达。tm6sf2rs58542926c>t的转化导致第167位谷氨酸残基被赖氨酸残基替换，影响tm6sf2编码的蛋白质功能，有研究猜测突变型的蛋白由于表达异常在细胞内加速降解，突变型蛋白量减少，甘油三酯沉积在肝脏中使肝脏中脂质含量增多，导致肝脏发生脂肪变性引起肝病，并逐步发展为严重肝纤维化或者肝硬化、甚至肝细胞癌的发生。gckr基因编码的葡萄糖激酶调节蛋白，是葡萄糖激酶(glucokinase,gck)的变构抑制剂，而gck是肝脏细胞葡萄糖代谢过程中的关键酶。rs780094位点位于gckr基因的增强子上，等位基因t会引发葡萄糖激酶调节蛋白表达量下调，对gck活性的抑制能力减弱，导致肝细胞内的葡萄糖在gck催化下过度转化为甘油三酯并在细胞内堆积，最终引发脂肪肝。因此，通过检测pnala3基因、tm6sf2基因和gckr基因及其相关位点，可以知道被检者的非酒精性脂肪肝易感风险程度的高低，从而根据检测结果对被检者进行个体化的nafld防治指导建议，对于防治nafld及其并发疾病、改善被检者生活质量具有重要意义。目前，检测nafld易感基因位点多态性的试剂盒有检测单个位点的，也有检测多个位点组合的。仅检测单个位点基因型不能全面评估nafld的易感风险；而检测多个位点的试剂盒使用的方法为一代测序法，该方法需要对扩增后的样品进行纯化、再次扩增分析序列，检测步骤繁琐、复杂，对环境及操作人员要求较高、需要昂贵的仪器设备、成本高，在临床上具有一定的限制。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，包括用于检测pnpla3rs738409c>g、tm6sf2rs58542926c>t、gckrrs780094t>c3个snp位点多态性的3对引物和3对探针；所述用于检测pnpla3rs738409c>g的引物和探针的序列如seqidno：1、seqidno：2、seqidno：7和seqidno：8所示；所述用于检测tm6sf2rs58542926c>t的引物和探针的序列如seqidno：3、seqidno：4、seqidno：9和seqidno：10所示；所述用于检测gckrrs780094t>c的引物和探针的序列如seqidno：5、seqidno：6、seqidno：11和seqidno：12所示。本发明的有益效果在于：本发明提供的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，是一种用于pnpla3、tm6sf2、gckr基因多态性的检测试剂盒，试剂盒中包含的用于检测pnpla3rs738409c>g、tm6sf2rs58542926c>t、gckrrs780094t>c3个snp位点多态性的3对引物和3对探针，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型；相比使用δct值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量pcr曲线进行确认复核，结果准确可靠；本发明提供的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。附图说明图1所示为本发明具体实施方式的pnpla3rs738409c>g野生纯合型的扩增曲线；图2所示为本发明具体实施方式的pnpla3rs738409c>g杂合型的扩增曲线；图3所示为本发明具体实施方式的pnpla3rs738409c>g突变纯合型的扩增曲线；图4所示为本发明具体实施方式的tm6sf2rs58542926c>t野生纯合型的扩增曲线；图5所示为本发明具体实施方式的tm6sf2rs58542926c>t杂合型的扩增曲线；图6所示为本发明具体实施方式的tm6sf2rs58542926c>t突变纯合型的扩增曲线；图7所示为本发明具体实施方式的gckrrs780094t>c野生纯合型的扩增曲线；图8所示为本发明具体实施方式的gckrrs780094t>c杂合型的扩增曲线；图9所示为本发明具体实施方式的gckrrs780094t>c突变纯合型的扩增曲线；图10所示为本发明具体实施方式的pnpla3rs738409位点检测样本分型结果图；图11所示为本发明具体实施方式的tm6sf2rs58542926位点检测样本分型结果图；图12所示为本发明具体实施方式的gckrrs780094位点检测样本分型结果图。具体实施方式为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本发明最关键的构思在于：本发明精选了在中国人群中与nafld高度相关的三个基因位点，使用实时荧光定量pcr技术，在常规pcr的基础上加入taqman探针来实现基因位点分型的功能。请参照表1(引物)和表2(探针)，本发明的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，包括用于检测pnpla3rs738409c>g、tm6sf2rs58542926c>t、gckrrs780094t>c3个snp位点多态性的3对引物和3对探针；所述用于检测pnpla3rs738409c>g的引物和探针的序列如seqidno：1、seqidno：2、seqidno：7和seqidno：8所示；所述用于检测tm6sf2rs58542926c>t的引物和探针的序列如seqidno：3、seqidno：4、seqidno：9和seqidno：10所示；所述用于检测gckrrs780094t>c的引物和探针的序列如seqidno：5、seqidno：6、seqidno：11和seqidno：12所示。表1名称序列(5’→3’)碱基数seqidno：1409-f1ggtgctctcgcctataacttct22seqidno：2409-r1gcagagaaagccgacttaccac22seqidno：3926-f1gctggctgaagaccttcatg20seqidno：4926-r3aacagatgtccagcagggttc21seqidno：5094-f2ggattcattccactaaaccac21seqidno：6094-r3catgttggctaggcttgt18表2名称序列(5’→3’)碱基数seqidno：7p409c-2ttcctgcttcatccc15seqidno：8p409g-2ttcctgcttcatgcc15seqidno：9p926c-2caaatacagctccgagatcaggcc24seqidno：10p926t-2caaatacagctccaagatcaggcc24seqidno：11p094c-1atgactgacacatgttt17seqidno：12p094t-1atgactgacacatattt17其中，上述探针3’端使用mgb修饰或者不修饰，5’端的修饰可以为fam、hex、cy3、cy5，荧光基团不限。从上述描述可知，本发明的有益效果在于：提供了一种pnpla3、tm6sf2、gckr基因多态性的检测试剂盒，试剂盒中包含的用于检测pnpla3rs738409c>g、tm6sf2rs58542926c>t、gckrrs780094t>c3个snp位点多态性的3对引物和3对探针，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型；相比使用δct值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量pcr曲线进行确认复核，结果准确可靠；本发明提供的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。进一步的，非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，包括pcr反应液1、pcr反应液2和pcr反应液3；所述pcr反应液1包括用于检测pnpla3rs738409c>g的引物和探针；所述pcr反应液2包括用于检测tm6sf2rs58542926c>t的引物和探针；所述pcr反应液3包括用于检测gckrrs780094t>c的引物和探针。进一步的，每个pcr反应液中还包括2×qpcrmix，所述2×qpcrmix包括热启动taq酶、dntp、ung酶、mg2+和超纯水。从上述描述可知，引入ung酶防污染系统，能更加准确、稳定的对样品进行分型检测。进一步的，非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，还包括阳性质控品1、阳性质控品2、阳性质控品3和阴性质控品；所述阳性质控品1为pnpla3rs738409cc、tm6sf2rs58542926ct、gckrrs780094tt基因型组合的人基因组dna，浓度为1-10ng/μl；所述阳性质控品2为pnpla3rs738409cg、tm6sf2rs58542926cc、gckrrs780094cc基因型组合的人基因组dna，浓度为1-10ng/μl；所述阳性质控品3为pnpla3rs738409gg、tm6sf2rs58542926cc、gckrrs780094ct基因型组合的人基因组dna，浓度为1-10ng/μl；所述阴性质控品为灭菌纯化水。从上述描述可知，通过设置阳性质控品和阴性质控品，可提高检测的准确性。进一步的，非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，还包括dmso添加剂。从上述描述可知，添加dmso可以提高扩增效率，得到更好的扩增曲线图进一步的，非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，还包括裂解液原液和20×稀释液。从上述描述可知，使用裂解液原液和20×稀释液可配置裂解液和1×tris-hcl，进而可进行全血样本dna的提取。实施例一：非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，包含表3所示的成分；表3序号组分成分数量规格1pcr反应液1引物、探针、taq酶、dntp、ung酶、水1900μl/管2pcr反应液2引物、探针、taq酶、dntp、ung酶、水1900μl/管3pcr反应液3引物、探针、taq酶、dntp、ung酶、水1900μl/管4阳性质控品1已提取的人基因组dna1100μl/管5阳性质控品2已提取的人基因组dna1100μl/管6阳性质控品3已提取的人基因组dna1100μl/管7阴性质控品灭菌纯化水1100μl/管其中，所述pcr反应液1中的引物和探针为用于检测pnpla3rs738409c>g的引物和探针；所述pcr反应液2中的引物和探针为用于检测tm6sf2rs58542926c>t的引物和探针；所述pcr反应液3中的引物和探针为用于检测gckrrs780094t>c的引物和探针；所述阳性质控品1为pnpla3rs738409cc、tm6sf2rs58542926ct、gckrrs780094tt基因型组合的人基因组dna，浓度为1-10ng/μl；所述阳性质控品2为pnpla3rs738409cg、tm6sf2rs58542926cc、gckrrs780094cc基因型组合的人基因组dna，浓度为1-10ng/μl；所述阳性质控品3为pnpla3rs738409gg、tm6sf2rs58542926cc、gckrrs780094ct基因型组合的人基因组dna，浓度为1-10ng/μl。实施例二：非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，与实施例一的区别在于还包括裂解液原液(2mol/l的naoh溶液)和20×稀释液(1.0-2.0mol/l的tris-hcl)。实施例三：1、口腔拭子样本dna提取使用口腔拭子专用采样套装或者口腔拭子样本，取出所有样本离心，去除上清，加入100μl的裂解液，95℃煮沸10min，迅速冷却5min，离心取出上清至新的离心管中，做好标记，放2～8℃暂存，得到dna样本，长时间未使用，请保存于-20±5℃。或者使用商业试剂盒提取口腔拭子样本dna，得到dna样本。2、pcr反应体系配制及加样根据样本例数制备pcr反应体系份数n(n＝样本例数+阳性对照×3+阴性对照)，每管荧光定量pcr管分装pcr反应体系18μl，dna样本量添加2μl、阴性对照2μl、阳性对照2μl，充分混合后短暂离心后，准备上机。使用实施例一的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，按表4配制pcr反应体系1-3各n管。表43、将上述荧光定量pcr管，放入荧光pcr仪中，程序设置如表5所示：表5荧光信号收集在阶段361℃45s(*标记)，收集的荧光信号为探针标记的荧光，可以为(fam、joe)。使用genotyping程序需要添加阶段4收集荧光信号，结果软件可自动分析数据。4、结果分析质控品标准需满足以下条件：1、阳性质控品检测结果正常；2、阴性质控品检测结果正常。满足以上两个条件后，按照表6对检测样本进行基因型别分析，否则实验失败。表6pnpla3rs738409c>g扩增曲线判读结果如图1-3所示，依次为野生纯合型、杂合型、突变纯合型；tm6sf2rs58542926c>t扩增曲线判读结果如图4-6所示，依次为野生纯合型、杂合型、突变纯合型；gckrrs780094t>c扩增曲线判读结果如图7-9所示，依次为野生纯合型、杂合型、突变纯合型。扩增反应完成后，通过收集得到的荧光信号进行检测结果分析：将y轴设定为fam(基因型为野生型)，x轴设定为hex(joe)(基因型为突变型)，在基因分型图上，靠近y轴的样本检测结果为野生型，靠近x轴的样本检测结果为突变型，靠近对角线的样本为杂合型。质控标准：1、阴性质控品检测结果点应靠近原点附近；2、阳性质控品1、2、3检测结果为野生纯合基因型点应在靠近x轴处，突变纯合基因型检测结果点应在靠近y轴处，杂合基因型检测结果点应靠近对角线处。具体样本结果判读如图10-12所示。实施例四：1、21例样本全血样本dna提取(1)1.5ml离心管中依次加入200μl全血、600μl灭菌纯化水，震荡混匀，瞬时离心，加入裂解液室温裂解2min，然后13000rpm离心2min，去除上清液；加入600μl灭菌纯化水，震荡混匀，13000rpm离心2min，去除上清液；加入20μl0.25mol/l的naoh，震荡混匀，瞬时离心；(2)将步骤(1)处理后的离心管放入干浴器中：99℃水浴8min后取出并冷却至室温，加入180μl1×稀释液，震荡混匀，13000rpm离心3min取50～150μl上清液转移到新的离心管中，得全血dna样本，于2～8℃保存备用；其中，所述裂解液的配置方法为：取2ml实施例二的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒中的裂解液原液，加入14ml无菌水，混匀后2～8℃保存；1×稀释液的配置方法为：取2ml实施例二的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒中的20×稀释液，加入38ml无菌水，混匀后，2～8℃保存。或者使用商业化全血提取试剂盒提取全血dna，得全血dna样本。2、根据样本例数制备pcr反应体系份数25，每管荧光定量pcr管分装pcr反应体系18μl，dna样本量添加2μl、阴性对照2μl、阳性对照2μl，充分混合后短暂离心，准备上机。使用实施例二的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，按表4配制pcr反应体系1-3各25管。3、将上述荧光定量pcr管，放入荧光pcr仪中，程序设置如表5所示；荧光信号收集在阶段361℃45s(*标记)，收集的荧光信号为探针标记的荧光，可以为(fam、joe)。使用genotyping程序需要添加阶段4收集荧光信号，结果软件可自动分析数据。4、结果分析21例样本检测结果图表7所示，与测序结果比较，一致性100％。表7序号样本编号rs738409c>grs58542926c>trs780094c>t1b60060351ccccct2b60060352cccccc3b60060353cgcccc4b60060354cgcctt5b60060355cgcctt6b60060356cgccct7b60060357cgcccc8b60060358cgcctt9b60060359ccccct10b60060360cccccc11b60060361ccccct12b60060362cccttt13b60060363cgcccc14b60060364ggccct15b60060365ggcctt16b60060366ccccct17b60060367ccccct18b60060368cgcctt19b60060369ccccct20b60060370cgcctt21b60060371cgcctt综上所述，本发明提供的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，是一种用于pnpla3、tm6sf2、gckr基因多态性的检测试剂盒，试剂盒中包含的用于检测pnpla3rs738409c>g、tm6sf2rs58542926c>t、gckrrs780094t>c3个snp位点多态性的3对引物和3对探针，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型；相比使用δct值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量pcr曲线进行确认复核，结果准确可靠；本发明提供的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷；本发明的提供的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒中包含用于提取全血dna样本的提取试剂，利用了碱裂解法的原理，可以快速提取全血基因组核酸，无需纯化即可用于扩增；较现有酚氯仿抽提法、吸附柱纯化法和磁珠法，步骤简单、耗时短，较试剂盒提取操作时间段、成本低，仅需两种试剂即可完成核酸提取并且满足检测的要求，可应用于零散样本的提取、不受样本量和试剂用量及仪器限制，可广泛应用于临床样本的提取。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>阿吉安（福州）基因医学检验实验室有限公司<120>非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1ggtgctctcgcctataacttct22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2gcagagaaagccgacttaccac22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gctggctgaagaccttcatg20<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4aacagatgtccagcagggttc21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5ggattcattccactaaaccac21<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6catgttggctaggcttgt18<210>7<211>15<212>dna<213>人工序列<400>7ttcctgcttcatccc15<210>8<211>15<212>dna<213>人工序列<400>8ttcctgcttcatgcc15<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列<400>9caaatacagctccgagatcaggcc24<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列<400>10caaatacagctccaagatcaggcc24<210>11<211>17<212>dna<213>人工序列<400>11atgactgacacatgttt17<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列<400>12atgactgacacatattt17当前第1页12