鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法与流程

本发明涉及耐药判断技术领域，尤其涉及鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法。

背景技术：

感染鸡只的霉形体主要分为鸡败血霉形体和鸡滑膜霉形体两种，其中鸡败血霉形体又称鸡毒支原体，主要感染鸡和火鸡，引起鸡的慢性呼吸道系统传染病，而滑膜霉形体则感染鸡只使其出现关节炎等症状，泰乐菌素作为动物专用药，对畜禽的呼吸道疾病具有良好的治疗作用，并且不易产生药物残留，毒性作用弱，具有极高的安全性，进一步促进了其在兽医临床上的应用。

我国目前养殖业用药的不合理已经导致耐药现象的产生，耐药检测具有必要性和紧迫性，为了减缓鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性产生，保护和维持泰乐菌素的有效性，需要对鸡毒支原体开展耐药监控措施，耐药判定标准是对细菌进行有效耐药监控的科学手段，是判断细菌耐药性的科学准则，为了监测耐药性产生，分析耐药现状和发展规律，更科学的指导临床用药，本发明提出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，以解决现有技术中的不足之处。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，通过本发明方法可以得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准，能够为科学养殖提供稳定的用药数据支持，能更科学的进行指导临床用药，安全性高，能够有效减缓鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性产生，保护和维持泰乐菌素的有效性。

本发明提出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，包括以下步骤：

步骤一：建立泰乐菌素对鸡毒支原体的耐药检测方法：以金黄色葡萄球菌atcc29213作为质控菌株，泰乐菌素作为质控药物，测定泰乐菌素对临床分离鸡毒支原体的mic；

步骤二：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值，其中野生型临界值用cowt表示：首先从临床感染鸡只中分离获取出鸡毒支原体107株，与实验室保存的标准菌株4株组成共111株鸡毒支原体，然后采用肉汤稀释法测定了泰乐菌素对111株鸡毒支原体的mic值，将得到的mic数据带入ecoffinder软件，进行线性回归模拟，得到不同置信区间下的野生性临界值；

步骤三：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值，药效学临界值用copd表示：选取了mic90的菌株进行鸡胚毒力实验，选择spf级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，选择卵黄囊接种方法，接种剂量为10⁶ccu，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择m17菌株进行pk-pd试验，制定药效学临界值，将得到的pk-pd数据利用crystalball7软件进行蒙特卡洛模拟，选取达标率在90％以上所对应的最大mic值为药效学临界值；

步骤四：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，临床临界值用cocl表示：选取了5个不同的mic的菌株进行鸡胚毒力实验，选择spf级鸡胚进行对鸡毒支原体的毒力鉴定，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，实验选择卵黄囊接种方法，接种剂量为10⁶ccu，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择m1、m11、m17、m23和m24菌株进行临床治疗试验，制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，临床试验制定的临床临界值可通过“window”计算、非线性回归和二分树(cart)分析方式进行验证；

步骤五：根据泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值、泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值和泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，利用折点制定流程图来制定最终的折点，得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准。

进一步改进在于：所述步骤一中建立泰乐菌素对鸡毒支原体耐药检测方法时，由于鸡毒支原体可代谢葡萄糖而产酸，该特性可致液体培养基发生ph变化，需要采用颜色变化单位滴度试验进行检验，然后再应用于间接测定培养物的含量。

进一步改进在于：所述步骤二中鸡毒支原体的分离获取过程包括菌种分离、菌种纯化、菌种鉴定和菌种保存。

进一步改进在于：所述步骤二中首先通过对数转换，进行野生型菌株正态性分布检验，选择属于正态分布的野生型菌株mic范围，确定mic分布属于正态分布后，进行非线性回归分析，运用非线性回归方法对转换为对数分布的mic数据进行多次拟合，首先从最小mic到分布频率最高的mic进行拟合，然后每次拟合递增一个mic梯度，直至拟合的菌株数目与实际菌株数目差异最小，然后确定最佳拟合范围为最小的mic到菌株数目差异最小的mic，再使用excel公式中norminv函数，验证野生型菌株的最大取值上限，再通过normdst函数确定验证最大上限的概率，最终确定的临界值应该至少包括95％的野生型菌株，利用最后clsi将这些统计分析步骤进行整合，通过一个excel软件ecoffinder分析软件直接对野生型菌株mic分布数据进行分析，得到泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值。

进一步改进在于：所述步骤三中鸡胚毒力实验具体过程为：择spf级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，在无菌操作台进行试验，用75％左右的医用酒精消毒鸡蛋表面，过程中不可擦掉胚胎和气囊标记，实验选择卵黄囊接种，接种剂量为10⁶ccu，接种方法为：气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用7号注射器针头垂直刺入约3cm，注射接种菌液约0.2ml，石蜡封口，继续在37℃孵化，每天翻蛋2次。

进一步改进在于：所述步骤三中利用crystalball7软件对药动学数据进行蒙特卡洛模拟得到药动学靶值在不同mic下的达标率，选择达标率在90％以上所对应的最大mic值为药效学临界值。

进一步改进在于：所述步骤四中制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值时，根据mic分布范围，选择具有致病力的鸡毒支原体，选择依据：最高峰值mic、最高峰值mic左右的、野生型临界值、mic50、mic90的mic的菌株，根据具体mic分布综合考虑选择5个mic菌株。

进一步改进在于：所述步骤四中菌株的致病力试验是通过鸡胚感染模型试验进行验证，将对数生长期对应菌液通过卵黄囊注射接种于鸡胚，每个鸡胚接种0.3ml同样浓度的菌液，同时以无菌空白肉汤腹腔注射鸡胚作为空白对照组，观察鸡胚死亡情况，选择死亡率高的菌株。

进一步改进在于：所述步骤四中临床试验得到的临床临界值可带入“window”算法、spss软件中的非线性回归和salfordpredictivemodeler软件的二分树(cart)分析进行验证，首先先用“window”方法对临床疗效的结果进行分析，测定其参数值maxdiff和car，根据参数值确定临床临界值范围，再根据eucast提议的poc与mic之间的公式，利用spss软件中的非线性回归对其所得数据进行拟合，以log2mic为自变量，poc为因变量，得到相关系数最高的模型表达式来确定临床临界值范围，最后再将临床试验数据带入salfordpredictivemodeler软件中，以mic为预测变量，poc为目标变量，进行二分树(cart)分析来确定临床临界值的范围。

进一步改进在于：所述步骤五中首先将野生型临界值、药效学临界值和临床临界值进行比较，当出现野生型临界值等于临床临界值情况时，该值即为折点值；当出现不相等情况时，则比较三个临界值的大小，确定最终的折点值即为鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准。

本发明的有益效果：通过本发明方法可以得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准，能够为科学养殖提供稳定的用药数据支持，能更科学的进行指导临床用药，安全性高，能够有效减缓鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性产生，保护和维持泰乐菌素的有效性。

附图说明

图1为本发明方法中根据clsi制定折点的流程示意图。

图2为本发明方法中利用ecoffinder软件进行线性回归制定野生型临界值的结果示意图。

图3为本发明方法中利用crystalball7软件进行蒙特卡洛模拟达标率制定药效学临界值的结果示意图。

图4为本发明方法中利用salfordpredictivemodeler软件进行二分树(cart)分析制定临床临界值的结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据图1、2、3、4所示，本实施例提出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，包括以下步骤：

步骤一：建立泰乐菌素对鸡毒支原体耐药检测方法：以金黄色葡萄球菌atcc29213作为质控菌株，泰乐菌素作为质控药物，测定泰乐菌素对临床分离鸡毒支原体的mic，建立泰乐菌素对鸡毒支原体耐药检测方法时，由于鸡毒支原体可代谢葡萄糖而产酸，该特性可致液体培养基发生ph变化，需要采用颜色变化单位滴度试验进行检验，然后再应用于间接测定培养物的含量；

步骤二：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值，野生型临界值用cowt表示：首先从湖北、湖南和河南地共进行20余次样品采集，共计采集样品4000余份，分离得到疑似鸡毒支原体107株，与实验室保存的4株鸡毒支原体参考菌株bg44t、hs、f和pg31菌株，组成共111株鸡毒支原体，鸡毒支原体的分离获取过程包括菌种分离、菌种纯化、菌种鉴定和菌种保存，然后采用肉汤稀释法测定了泰乐菌素对111株鸡毒支原体的mic值，将得到的mic数据带入ecoffinder软件，首先通过对数转换，进行野生型菌株正态性分布检验，选择属于正态分布的野生型菌株mic范围，确定mic分布属于正态分布后，进行非线性回归分析，运用非线性回归方法对转换为对数分布的mic数据进行多次拟合，首先从最小mic到分布频率最高的mic进行拟合，然后每次拟合递增一个mic梯度，直至拟合的菌株数目与实际菌株数目差异最小，然后确定最佳拟合范围为最小的mic到菌株数目差异最小的mic，再使用excel公式中norminv函数，验证野生型菌株的最大取值上限，再通过normdst函数确定验证最大上限的概率，最终确定的临界值至少包括95％的野生型菌株，利用最后clsi将这些统计分析步骤进行整合，通过一个excel软件ecoffinder分析软件直接对野生型菌株mic分布数据进行分析，得到泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值；

使用ecoffinder软件，将泰乐菌素对鸡毒支原体的mic分布代入rawcount，计算出累积分布，使用非线性回归拟合累积分布，得到泰乐菌素对鸡毒支原体的数据拟合结果，软件自动模拟在不同的置信区间95.0％，97.5％，99.0％，99.5％和99.9％内野生型菌株分布的上限；取95.0％置信区间内的野生型鸡毒支原体mic分布的上限为最终的野生型临界值，即为2μg/ml；

步骤三：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值，药效学临界值用copd表示：选取了mic90的菌株进行鸡胚毒力实验，选择spf级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，选择卵黄囊接种方法，接种剂量为10⁶ccu，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择m17菌株进行pk-pd试验，制定药效学临界值，鸡胚毒力实验具体过程为：择spf级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，在无菌操作台进行试验，用75％左右的医用酒精消毒鸡蛋表面，过程中不可擦掉胚胎和气囊标记，实验选择卵黄囊接种，接种剂量为10⁶ccu，接种方法为：气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用7号注射器针头垂直刺入约3cm，注射接种菌液约0.2ml，石蜡封口，继续在37℃孵化，每天翻蛋2次；

对鸡胚毒力实验选出来的m17进行体外药效学研究，得到药效学数据；对鸡灌胃泰乐菌素进行药动学研究，得到药动学数据；利用winnonlin软件模拟药效学和药动学数据，得到药动-药效参数；选取抑制性模型sigmoidemax模型预测药动-药效参数和抗菌药效应之间的关系，得到在不同抗菌效果下的药效学靶值；

利用crystalball7软件对患病组肺组织中的药动学数据auc均值和标准差分别进行蒙特卡洛模拟，得到模拟的10000只鸡的药动学数据，利用winnonlin模拟得到患病组e＝-3时对应的药动学靶值为51.19，从而计算在不同mic下的达标率结果如表1所示，当mic为2μg/ml时，达标率为0％；当mic为1μg/ml时，达标率为93.68％，高于90％；根据药效学临界值制定规则，达标率在90％以上所对应的最大mic值即为药效学临界值，由于采用感染靶部位的模拟结果对临界值的制定更有意义，最终制定的泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值为1μg/ml；

表1蒙特卡罗模拟药动学参数在不同mic值下的达标率

步骤四：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，临床临界值用cocl表示：根据mic分布范围，选择具有致病力的鸡毒支原体，据具体mic分布综合考虑选择5个不同最高峰值mic、最高峰值mic左右的、野生型临界值、mic50、mic90的mic的菌株进行鸡胚毒力实验，选择spf级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，实验选择卵黄囊接种方法，接种剂量为10⁶ccu，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择m1、m11、m17、m23和m24菌株进行临床治疗试验，制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，其中菌株的致病力试验是通过鸡胚感染模型试验进行验证，将对数生长期对应菌液通过卵黄囊注射接种于鸡胚，每个鸡胚接种0.3ml同样浓度的菌液，同时以无菌空白肉汤腹腔注射鸡胚作为空白对照组，观察鸡胚死亡情况，选择死亡率高的菌株；

利用pk-pd参数折点值计算给药剂量，计算公式如下：

其中，cl指泰乐菌素在鸡肺组织中清除率；(auc/mic)bp指对应不同治疗效应的pk/pd参数折点值；mic为临床鸡毒支原体的mic；f为生物利用度；fu为游离药物浓度比例；

将泰乐菌素达到不同抗菌效应目的所对应的auc24h/mic值代入剂量计算方程即可求出泰乐菌素达到不同抗菌效应时所需的日给药剂量，当临床分离的目标菌株的mic值为2μg/ml时，得出的各个给药剂量结果见表2：

表2不同用药目的下的给药剂量

通过mlxplore软件模拟预测三个给药剂量(预防、治疗、清除)和不同给药间隔下细菌的生长情况，从而得到最佳的给药方案和给药间隔最终制定的给药方案是24h给药间隔、45.88mg/kgb.w的给药剂量、连续给药3天；

将试验鸡只在实验之前经过7天适应，在适应期间，无鸡只死亡，采食饮水情况正常，健康状态良好，无异常行为，也无其它菌感染现象，适应期过后对鸡只进行人工感染，采用气管灌注1ml的鸡毒支原体进行感染，连续感染7天，感染鸡毒支原体滴度为1×10⁹ccu，空白对照组以同样气管注射的方式接种空白fm-4肉汤；

经过药物治疗后，敏感菌株m1菌株和m11菌株对应的治愈率可以达到100％，mic相对较大的菌株的治愈率要低于敏感菌株，且mic值越大，治愈率就越低，说明药物的治疗效果与感染菌株的mic值是有负相关性，当感染菌株mic为0.03μg/ml时，治愈率为100％；感染菌株mic为0.5μg/ml时，治愈率为93.3％；感染菌株mic为1μg/ml时，治愈率为80％，根据临床临界值选择治愈率大于等于90％时的最大mic值为临床临界值，得出泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值为0.5μg/ml；

将所得到的数据先用“window”方法对临床疗效的结果进行分析，测定其参数值maxdiff和car，根据参数值确定临床临界值范围；maxdiff和car所对应的菌株数量重复数要大于4；本研究通过car计算方法得到的概率分别为1、1、0.97、0.92、0.84，但是需要排除car落在最小和最大mic分布的情况，最终可选择比最大mic小一个梯度的mic值为临界值上限，为1μg/ml；而通过maxdiff算法计算得到的对应数值分别为11、13、11、3、0，然后选择最大maxdiff值所对应的mic分布为临界值下限，即0.03μg/ml；由于两种算法得到的结果不一致，因此通过该方法得到临床临界值的分布范围为0.03-1μg/ml；

再根据eucast提议的poc与mic之间的公式，利用spss软件中的非线性回归对其所得数据进行拟合，以log2mic为自变量，poc为因变量，选择与实验数据相关系数最高的模型表达式为y＝82.992-9.364x-1.628x2-0.91x3,得到的模拟r²值为0.975；根据结果表达式，计算治愈率为90％所对应的自变量log2mic为-0.82，mic为0.57μg/ml，所以临床临界值小于0.57μg/ml；

最后，再将临床试验数据带入salfordpredictivemodeler软件，以mic为预测变量，poc为目标变量，进行二分树(cart)分析；从回归树可知，当mic<＝0.75μg/ml时，治愈率为97.8％；当mic>0.75μg/ml时，治愈率为76.7％；当mic接近0.75μg/ml，治愈率为89.3％；因此cart分析所得到的临床临界值应为最靠近且小于0.75μg/ml的值；

综合上述分析方法，“window”方法得到的临床临界值选择窗为0.03-1μg/ml；非线性回归分析表明临床临界值小于0.57μg/ml；cart回归树分析表明临床临界值应为靠近且小于0.75μg/ml的值。通过临床治疗实验所得到的临床临界值0.5μg/ml都满足上面条件，所以本实验最后制定的泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值为0.5μg/ml；

步骤五：根据泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值、泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值和泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，利用折点制定树状图来制定最终的折点，首先将野生型临界值、药效学临界值和临床临界值进行比较，当出现野生型临界值等于临床临界值情况时，该值即为折点值；当出现不相等情况时，则比较三个临界值的大小，确定最终的折点值即为鸡霉形体对泰乐菌素的耐药判定标准；

已知泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值(cowt)为2μg/ml，泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值(copd)为1μg/ml以及泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值(cocl)为0.5μg/ml，将这三个临界值带入clsi公布的折点制定的流程图，符合cowt＞copd＞cocl,对应的折点值应该选择野生型临界值，得到鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准为2μg/ml。

通过本发明方法可以得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准，能够为科学养殖提供稳定的用药数据支持，能更科学的进行指导临床用药，安全性高，能够有效减缓鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性产生，保护和维持泰乐菌素的有效性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。