一种重组人酸性成纤维细胞生长因子生物学活性测定方法与流程

本发明属于细胞生长因子领域，特别涉及一种重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhafgf)生物学活性测定方法。

背景技术：

酸性成纤维细胞生长因子(acidicfibroblastgrowthfactor，afgf)是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型细胞具有广泛生物学活性的细胞因子。大量的研究已充分证实了成纤维细胞生长因子家族成员在促进创伤愈合、溃疡愈合、血管再生、神经组织修复、神经突起生长等方面具有突出的功效，孕育着巨大的临床应用前景。酸性成纤维细胞生长因子是已知fgf家族中唯一与所有受体蛋白都具有高度亲和性的因子，与受体结合后可刺激成纤维细胞和角质细胞增殖、迁徙。体外研究表明，酸性成纤维细胞生长因子的生物学效应包括促有丝分裂效应及非促分裂激素样活性。动物试验证明，afgf通过提高细胞增殖能力，促进肉芽组织形成；促进胶原蛋白重塑；诱导血管生成、增殖和分化等途径加速烧伤创面的愈合；参与脊髓损伤的修复。

目前中国专利(cn200510094203.2)已公开了重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhafgf)的制备方法。然而，对于该因子作为药物开发的体外生物学活性测定方法目前没有成熟有效的实施方案。

本发明应用小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3细胞)体外进行培养，模拟afgf体内作用方式，摸索并建立了一套用于rhafgf活性测定的方法。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明根据重组人酸性成纤维细胞生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3细胞)的生长具有刺激作用，nih3t3细胞的生长状况因重组人酸性成纤维细胞生长因子生物学活性的不同而不同，以此检测重组人酸性成纤维细胞生长因子的生物学活性。

具体地，本发明提供了一种重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhafgf)生物学活性测定方法，所述方法包括以下步骤：

(1)标准品溶液及供试品溶液的制备：取重组人酸性成纤维细胞生长因子活性测定标准品1支，用1毫升基础培养液溶解分装，按标示量梯度(稀释倍数不大于10倍)稀释至400au/ml，以上操作在无菌条件下进行；将供试品用基础培养液稀释至400au/ml，在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，每个稀释度做2个孔，以上操作在无菌条件下进行；

(2)细胞培养：复苏冻存的小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3细胞)，接种于培养瓶培养至对数生长期，用胰酶消化计数后，将细胞加入到96孔细胞培养板中，使每孔中细胞约7000-9000个(细胞密度7×10⁴-10⁹个/ml)，置于5％co2，37℃培养箱中培养24小时；弃去原细胞培养液，每孔加维持培养液100μl，置于5％co2，37℃培养箱中培养18-24小时；

(3)加样：步骤(2)的细胞培养板中每孔加入120μl基础培养液，加入步骤(1)的稀释好的标准品及供试品依次加入步骤(2)的细胞培养板中，加入的标准品及供试品的体积为40μl，加样好的细胞培养板进行培养；

(4)显色：步骤(3)培养完的细胞培养板中加入mtt(5mg/ml)20μl/孔置于5％co2，37℃培养箱中孵育4小时，每孔加入二甲基亚砜100μl，振荡混匀3-5min，以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，记录测定结果；

(5)生物学活性结果分析：试验数据采用计算机程序或四参数方程计算法进行处理，并按下式计算结果：

式中：

pr为标准品生物学活性

dr为标准品预稀释倍数ds为供试品预稀释倍数

es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数er为标准品半效稀释倍数。

进一步地，步骤(2)中加入到细胞培养板中的细胞约7000-9000个每孔。

进一步地，步骤(1)中标准品及供试品的稀释方式为梯度稀释，更优选地为4倍梯度稀释。

进一步地，所述步骤(3)中加样好的细胞培养条件为置于5％co2，37℃培养箱中培养48小时。

更进一步地，所述标准品为50000au/50μg/支，其用于供试品中重组人酸性成纤维细胞生长因子的生物学活性测定对照及计算。

所述标准品的生物学活性物质标定方法为：以制备50μg/支的重组人酸性成纤维细胞生长因子梯度稀释(稀释倍数不大于10倍)至400ng/ml，将培养至对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3细胞)以7000～9000个细胞每孔(细胞密度7×10⁴-10⁹个/ml)加入细胞培养板，置于5％co2，37℃培养24h，弃去原细胞培养液，每孔加入120μl基础培养基，加入40μl重组人酸性成纤维细胞生长因子，按连续4倍梯度稀释后培养48h；加入mtt(5mg/ml，20μl/孔)在培养箱中孵育4h，加入二甲基亚砜100μl，以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，测定ed50值，以ed50值对应浓度的倒数为1au，以以上方法多次独立标定，取平均值，以以下公式计算标准品的生物学活性：

有益效果

本发明的测定方法能够快速、简便的测定重组人酸性成纤维细胞生长因子的生物学活性，能够快速、有效的应用于重组人酸性成纤维细胞生长因子药物的质量控制，适用于产业化生产中对重组人酸性成纤维细胞生长因子生物学活性的测定。

附图说明

图1：rhafgf生物学活性建立过程中细胞数的筛选。

图1a为每孔加入7000-9000个细胞的板内各rhafgf稀释度吸光度值；

图1b为每孔加入7000-9000个细胞的rhafgf增殖曲线；

图1c为每孔加入15000-20000个细胞的板内各rhafgf稀释度吸光度值；

图1d为每孔加入15000-20000个细胞的rhafgf增殖曲线。

图2：rhafgf生物学活性建立过程中起始浓度和稀释倍数的筛选。

图2a：rhafgf起始浓度为100ng/ml，10倍稀释各稀释度吸光度值；

图2b：rhafgf起始浓度为100ng/ml，10倍稀释各稀释度吸光度值增殖曲线；

图2c：rhafgf起始浓度为100ng/ml，4倍稀释各稀释度吸光度值；

图2d：rhafgf起始浓度为100ng/ml，4倍稀释各稀释度吸光度值增殖曲线；

图2e：rhafgf起始浓度为200ng/ml，10倍稀释各稀释度吸光度值；

图2f：rhafgf起始浓度为200ng/ml，10倍稀释各稀释度吸光度值增殖曲线；

图2g：rhafgf起始浓度为200ng/ml，4倍稀释各稀释度吸光度值；

图2h：rhafgf起始浓度为200ng/ml，4倍稀释各稀释度吸光度值增殖曲线。

图3：rhafgf生物学活性建立过程中反应时间的筛选。

图3a：为每孔加入rhafgf后反应24h后稀释度吸光度值；

图3b：为每孔加入rhafgf后反应24h后增殖曲线；

图3c：为每孔加入rhafgf后反应48h后稀释度吸光度值；

图3d：为每孔加入rhafgf后反应48h后增殖曲线。

图4：三批rhafgf凝胶剂生物学活性检测。

图4a：标准品及三批rhafgf凝胶剂吸光度值(分别为两组平行)；

图4b：标准品及三批rhafgf凝胶剂4倍稀释增殖曲线(红色为标准品，绿色、蓝色、紫色为三批样品，即96孔板的第2-3行×b-h列为标准品，(第4-5行、6-7行、8-9行)×b-h列分别为三批样品)。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规实验方法，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：重组人酸性成纤维细胞生长因子标准品的标定

为配合本发明的测定方法，本实施例自制了相应的标准物质，并完成了标定，确定标准物质为50000au/50μg/支。

具体生物学活性物质的标定方法如下：

以制备50μg/支的重组人酸性成纤维细胞生长因子稀释至400ng/ml。将培养至对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3细胞)以7000～9000个细胞每孔加入细胞培养板，置于5％co2，37℃培养24h，每孔加入120μl基础培养基，再加入40μl重组人酸性成纤维细胞生长因子，按4倍梯度稀释后培养48h；加入mtt在培养箱中孵育4h，加入二甲基亚砜，以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，测定ed50值，以ed50值对应浓度的倒数为1au，以以上方法独立标定15次，取平均值。

其中，细胞培养及mtt检测所用试剂为：维持培养液于450mldmem(1g/lglucose)中加入2.5ml胎牛血清，4℃保存；基础培养液于维持培养液中加入一定量的肝素钠溶液，使肝素钠浓度为100μg/ml，4℃保存；pbs缓冲液称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，用蒸馏水溶解至1000ml，经121℃15分钟高压灭菌；噻唑蓝(mtt)溶液称mtt粉末0.25g，加pbs50ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；二甲基亚砜。

测定结果见表1：

对测定结果进行统计分析可知，平均活性标准品的生物学活性为50000au/50μg/支。

实施例2：重组人酸性成纤维细胞生长因子生物学活性测定方法的建立

本实施例所用仪器及试剂如下：

所需仪器设备：酶标仪。

所需试剂：

(1)完全培养液于450mldmem(1g/lglucose)中加入50ml胎牛血清，5ml双抗，4℃保存。

(2)维持培养液于450mldmem(1g/lglucose)中加入2.5ml胎牛血清，4℃保存。

(3)基础培养液于维持培养液中加入一定量的肝素钠溶液，使肝素钠浓度为100μg/ml，4℃保存。

(4)pbs缓冲液称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，用蒸馏水溶解至1000ml，经121℃15分钟高压灭菌。

(5)噻唑蓝(mtt)溶液称mtt粉末0.25g，加pbs50ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

(6)二甲基亚砜。

标准溶液的制备：取重组人酸性成纤维细胞生长因子活性测定标准品1支(50000au/50μg/支)，用1毫升基础培养液溶解分装，按标示量稀释至400au/ml，以上操作在无菌条件下进行。

生物学活性建立过程：

(1)复苏冻存的小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3细胞)，接种于培养瓶培养至对数生长期，用胰酶消化计数后，将细胞加入到96孔细胞培养板中，一个细胞培养板内加入7000～9000/100μl/孔的细胞，另一细胞培养板内加入15000～20000/100μl/孔的细胞，在相同给药浓度及稀释梯度的情况下，具体即以100au/mlhafgf为最高起始给药浓度，连续4倍梯度稀释加入每孔细胞中，找出增殖梯度明显的细胞数。

结果显示细胞数为7000～9000/孔，最高浓度吸光值与最低浓度两者之间的差值为0.7左右，吸光值差值越大增殖曲线越明显，更能突出不同浓度的hafgf增殖梯度效果，在测定样品时可较好的通过吸光值在曲线内计算出样品的生物学活性值。而细胞数为15000～20000/孔，由于细胞起始数较多，导致最高浓度给药孔细胞死亡，不能形成梯度增殖曲线(结果见图1)。因而将检测的细胞数定为7000～9000/孔。

(2)在一个细胞培养板内加入7000～9000/孔的处于对数生长期的nih3t3细胞，加入重组人酸性成纤维细胞生长因子进行细胞生长的刺激试验。分别设定起始浓度为100ng/ml、200ng/ml，找出最佳的起始浓度，同时分别设定浓度梯度的稀释倍数，以摸索稀释梯度对测定过程标准物质曲线拟合的影响。

结果显示随着增殖梯度的逐步细化，样品吸光度值活性曲线趋向合理，增殖梯度为4倍稀释时最佳。样品浓度大于50ng/ml基本到达s型曲线上端平台，100ng/ml活性曲线趋于明显的s型。即rhafgf促nih3t3细胞增殖范围是100ng/ml～0.01ng/ml(结果见图2)。

(3)在一个细胞培养板内加入7000～9000/100μl/孔的处于对数生长期的nih3t3细胞，加入重组人酸性成纤维细胞生长因子进行细胞生长的刺激试验。刺激时间分别设为24h和48h，进一步确定样品在24h、48h内对nih3t3细胞的刺激生长的完全性。

结果显示样品在给药24h时反应不完全，在48h内，反应达到顶峰，增殖曲线显示48h最高浓度与最低浓度促细胞增殖差异性比24h显著，所以将反应时间定为48h(结果见图3)。

由上述实验的摸索，确定了rhafgf活性检测方法的基本参数，即nih3t3细胞数为7000～9000/孔，样品浓度范围为100ng/ml-0.01ng/ml，4倍梯度进行稀释，样品的反应时间为48h。

实施例3：重组人酸性成纤维细胞生长因子生物学活性测定方法

本实施例完整的描述了重组人酸性成纤维细胞生长因子生物学活性测定方法，具体如下：

标准溶液的制备取重组人酸性成纤维细胞生长因子活性测定标准品1支(50000au/50μg/支)，用1毫升基础培养液溶解分装。按标示量稀释至400au/ml。以上操作在无菌条件下进行。

供试品溶液的制备将供试品用基础培养液稀释至400au/ml(供试品为凝胶剂时，应准确称取一定量的凝胶，再稀释至400au/ml)。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，每个稀释度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。

测定法

复苏冻存的nih3t3细胞培养至对数生长期，用胰酶消化计数后，将细胞加入到96孔细胞培养板中，使每孔中细胞约7000-9000个，置于5％co2，37℃培养箱中培养24小时。每孔加维持培养液100μl，置于5％co2，37℃培养箱中培养18-24小时。每孔加入120μl基础培养液，加入待测样40μl，按4倍梯度稀释后置于5％co2，37℃培养箱中培养48小时。加入mtt(5mg/ml)20μl/孔置于5％co2，37℃培养箱中孵育4小时。每孔加入二甲基亚砜100μl，振荡混匀3-5min。以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数方程计算法进行处理。并按下式计算结果：

式中：

pr为标准品生物学活性

dr为标准品预稀释倍数ds为供试品预稀释倍数

es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数er为标准品半效稀释倍数。

实施例4：重组人酸性成纤维细胞生长因子生物学活性测定方法的应用

为了验证本发明方法实际生产中是否能够用于重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhafgf)凝胶剂的生物学活性测定，进行了以下实验。

标准溶液的制备取重组人酸性成纤维细胞生长因子活性测定标准品1支(50000au/50μg/支)，用1ml基础培养液溶解分装。按标示量稀释至400au/ml。以上操作在无菌条件下进行。

凝胶溶液的制备准确称取1mg的凝胶，用基础培养液梯度(稀释倍数不大于10倍)稀释至400au/ml。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，每个稀释度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。

测定法培养细胞至对数生长期，用胰酶消化计数后，将细胞加入到96孔细胞培养板中，使每孔中细胞约7000-9000个，置于5％co2，37℃培养箱中培养24h。每孔加维持培养液100μl，置于5％co2，37℃培养箱中培养18-24h。每孔加入120μl基础培养液，加入待测样40μl，按4倍梯度稀释后置于5％co2，37℃培养箱中培养48h。加入mtt(5mg/ml)20μl/孔置于5％co2，37℃培养箱中孵育4h。每孔加入二甲基亚砜100μl，振荡混匀3-5min。以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数方程计算法进行处理。按本发明的计算公式计算生物学活性。

按上述方法测得三批凝胶剂生物学活性为2205au/ml、2272.5au/ml，2362.5au/ml。增殖曲线如图4所示。

结果显示，本发明方法适用于重组人酸性成纤维细胞生长因子的生物学活性测定，具有良好的重复性和稳定性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。