从淡水鱼中提取活性多肽的方法与流程

本发明属于生物多肽提取技术领域，具体涉及一种从淡水鱼中提取活性多肽的方法。

背景技术：

改革开放以来，渔业科技工作者在多级政府的支持下，大力培育优良品种，并积极引进国外优良品种，取得很好的成果，大力繁殖优良品种鱼苗，实施人工养殖与自然水体流放相结合，淡水鱼产量自1980年至1990年增长近4倍，1990年全国淡水鱼总产量达1237万吨，其中人工养殖为466万吨，占总产量的36％，位居世界首位。经过25年的发展，到2015年全国淡水鱼产量2900万余吨，其中人工养殖淡水鱼达1200万吨，但淡水鱼深加工所占比例较低，淡水鱼深加工企业的下脚料除鱼皮和鱼鳞用于制备胶原蛋白或进一步制备胶原蛋白低聚肽外，其它的下脚料，如鱼头、鱼骨、鱼鳍等基本上用于制备鱼粉饲料，没有得到充分利用，鱼血更是没有收集利用，在众多的餐饮企业和居民的淡水鱼消费中，鱼骨、鱼鳍、鱼血等均作垃圾处理，既污染环境又浪费资源。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从淡水鱼中提取活性多肽的方法，提高淡水鱼下脚料的利用率和经济价值，提取的多肽得率高，抗氧化性好，多肽中的芳香性氨基酸含量高。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：从淡水鱼中提取活性多肽的方法，淡水鱼提取活性多肽酶解过程中在酶解液中通入氖气，每隔20-30min在酶解液中通入氖气，通入量为15-25g/h，通入的氮气可使淡水鱼活性多肽结构中的芳香族氨基酸的酚腔基基团能够作为有效电子供体，提高制备的淡水鱼活性多肽中的芳香性氨基酸含量，增强淡水鱼活性多肽的抗氧化效果。

优选的，淡水鱼活性多肽提取步骤为：取新鲜淡水鱼，取淡水鱼鱼骨洗净，匀浆，按固液比3-5:1加入去离子水，于47-52℃条件下恒温搅拌，调ph值至6.7-7.0，加入酶制剂，酶解4-6h，酶解过程中在酶解液中通入氮气，灭酶，调ph至中性，离心，取上清液，得淡水鱼活性多肽，上述方法通过酶解法提取淡水鱼活性多肽，反应条件温和、反应效率高，不存在逆反应，提取的淡水鱼活性多肽分子量在2000-3000da之间，由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，具有很好的体外抗氧化能力，并且利用酶解将鱼骨中的无机钙转化为有机钙，并与淡水鱼活性多肽螯合形成钙螯合肽，增强提取的鱼骨活性多肽的作用和经济价值。

优选的，淡水鱼为大口鲶鱼或胡子鲶或革胡子鲶，选择鲶鱼作为提取活性多肽，改善现有鲶鱼因肉质不好常被作为饲料加工的现状，并且可对鲶鱼下脚料进一步提取活性多肽，提高鲶鱼的利用价值和经济价值。

优选，去离子水中含有0.1-0.3wt%的d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸的混合体，d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸重量比为52~58:0.3~0.7。通过在去离子水中加入的混合体可使淡水鱼细胞膜下形成小孔，致使细胞内的物质泄漏，提高活性多肽的得率，并且避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性。

优选的，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶4-10份、木瓜蛋白酶3-5份和胰蛋白酶1-2份。利用生物酶催化的酶促反应所具有的专一性特点，选择中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，将淡水鱼蛋白分解为多肽，提高多肽得率和多肽中的氨基酸数量。

优选的，灭酶处理为：将酶解液置于92-95℃条件下加热8-12min。终止酶解反应，防止酶解反应过度将得到的活性多肽分解成氨基酸。

优选的，于4-10℃条件下7000-8000r/min离心10-15min，取上清液，得淡水鱼活性多肽，提高多肽得率和纯度。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过酶解法提取淡水鱼活性多肽，反应条件温和、反应效率高，不存在逆反应，提取的淡水鱼活性多肽分子量在2000-3000da之间，由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，具有很好的体外抗氧化能力，在酶解液中通入的氮气可使淡水鱼活性多肽结构中的芳香族氨基酸的酚腔基基团能够作为有效电子供体，提高制备的淡水鱼活性多肽中的芳香性氨基酸含量，增强淡水鱼活性多肽的抗氧化效果，并且利用酶解将鱼骨中的无机钙转化为有机钙，并与淡水鱼活性多肽螯合形成钙螯合肽，增强提取的鱼骨活性多肽的作用和经济价值。

附图说明

图1为实施例5中不同胡子鲶活性多肽剂量对dpph自由基的清除率折线图；

图2为实施例5中各组小鼠组织sod活性统计图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

从淡水鱼中提取活性多肽的方法，提取步骤为：取新鲜大口鲶鱼，取大口鲶鱼鱼骨洗净，匀浆，按固液比4:1加入去离子水，去离子水中含有0.2wt%的d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸的混合体，d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸重量比为53:0.4，于48℃条件下恒温搅拌，调ph值至6.8，加入酶制剂，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶6份、木瓜蛋白酶4份和胰蛋白酶1份，酶解5h，酶解过程中在酶解液中通入氮气，每隔24min在酶解液中通入氖气，通入量为18g/h，将酶解液置于94℃条件下加热10min，调ph至中性，于8℃条件下7400r/min离心14min，取上清液，得大口鲶鱼活性多肽。

实施例2：

淡水鱼为大口鲶鱼或胡子鲶或革胡子鲶，

从淡水鱼中提取活性多肽的方法，提取步骤为：取新鲜胡子鲶，取淡水鱼鱼骨洗净，匀浆，按固液比4:1加入去离子水，去离子水中含有0.15wt%的d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸的混合体，d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸重量比为54:0.5，于50℃条件下恒温搅拌，调ph值至6.8，加入酶制剂，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶7份、木瓜蛋白酶4份和胰蛋白酶1份，酶解5h，酶解过程中在酶解液中通入氮气，每隔24min在酶解液中通入氖气，通入量为20g/h，将酶解液置于93℃条件下加热10min，调ph至中性，于6℃条件下7500r/min离心14min，取上清液，得胡子鲶活性多肽。

实施例3：

从淡水鱼中提取活性多肽的方法，提取步骤为：取新鲜革胡子鲶，取革胡子鲶鱼骨洗净，匀浆，按固液比4:1加入去离子水，去离子水中含有0.2wt%的d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸的混合体，d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸重量比为53:0.4，于48℃条件下恒温搅拌，调ph值至6.8，加入酶制剂，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶8份、木瓜蛋白酶4份和胰蛋白酶2份，酶解6h，酶解过程中在酶解液中通入氮气，每隔24min在酶解液中通入氖气，通入量为18g/h，将酶解液置于94℃条件下加热10min，调ph至中性，于8℃条件下7400r/min离心14min，取上清液，得胡子鲶活性多肽。

实施例4：

从淡水鱼中提取活性多肽的方法，优选提取步骤为：取新鲜胡子鲶，取胡子鲶鱼骨洗净，匀浆，按固液比4:1加入去离子水，去离子水中含有0.14wt%的d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸的混合体，d-苦杏仁酸和l-苦杏仁酸重量比为57:0.4，于52℃条件下恒温搅拌，调ph值至6.9，加入酶制剂，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶8份、木瓜蛋白酶4份和胰蛋白酶2份，酶解5h，酶解过程中在酶解液中通入氮气，每隔27min在酶解液中通入氖气，通入量为20g/h，将酶解液置于93℃条件下加热10min，调ph至中性，于8℃条件下7000r/min离心14min，取上清液，得胡子鲶活性多肽。

实施例5

对本发明实施例4提取的胡子鲶活性多肽进行试验：试验所用试剂均购买于北京协和生物工程研究所。

试验共选取普通级昆明种小鼠60只，体质量18~22g，小鼠在试验开始之前适应性喂养一周，自由饮水和进食，一周后，60只小鼠被随机分成3组：1组空白组、1组胡子鲶活性多肽高剂量组（实验组1）、1组胡子鲶活性多肽低剂量组（实验组2），每组20只小鼠，在4周的试验过程中，每天下午4点至5点，实验组1组的小鼠被灌胃5mg/g·d）的胡子鲶活性多肽，实验组2组的小鼠被灌胃0.5mg/（g·d）的胡子鲶活性多肽，而空白组的小鼠则被灌胃蒸馏水，在灌胃后，小鼠被允许休息30min，然后进行游泳训练，第1周游泳训练时间为20min，以后每周增加5min；游泳池的尺寸为50cm×50cm×50cm，水深为40cm，水温保持在（25±1）℃，用玻璃棒不停地搅动池中的水以使小鼠不停地游动.当小鼠头部沉入水中后7s仍不能正常地把头伸出水面，则认为此时小鼠已进入力竭状态，记录从小鼠开始游泳到力竭状态的时间，该时间为力竭游泳时间。

当训练的小鼠在小游泳池中游泳30min，然后捞出，眼眶取血，测量血液中血糖（glu）含量、血乳酸（la）含量和血清尿素氮（bun）的含量，以及肌酸激酶（ck）和乳酸脱氢酶（ldh）的活性，并且在试验第28天禁食空腹过夜，称质量后眼眶采血，低温离心分离血清（4℃，6000r/min，10min），-80℃保存待测，取血后的小鼠颈椎脱臼处死，用冰生理盐水洗去心、肝、肾上面的浮血，用滤纸吸干，称质量后用液氮迅速冷冻，以0.2mol/l、ph7.4的pbs缓冲液做匀浆介质在低温下将各器官组织按照1∶9（m/v）匀浆，于4℃，6000r/min离心10min，取上清，-80℃保存，测定不同胡子鲶活性多肽量对dpph自由基的清除率，如图1所示，测定各组小鼠组织sod活性，如图2所示。

上述实施例中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。