恩拉霉素单组分的产量提高方法、培养基以及分离方法与流程

本发明属于发酵技术领域，涉及一种恩拉霉素单组分的产量提高方法、培养基以及分离方法。

背景技术：

恩拉霉素(enramycin)又名恩拉霉素，为杀真菌素链霉菌strepomycesfungicidicus产生的多肽类抗生素。

恩拉霉素的盐酸盐为白色结晶性粉末，熔点为238～245℃，易溶于二甲基亚砜，可溶于甲醇、含水乙醇，难溶于丙酮，不溶于苯、氯仿，对热、光照和潮湿都有极好的稳定性。恩拉霉素粗制品为灰色或灰褐色粉末，有特臭。恩拉霉素在饲料中具有很高的稳定性，在室温条件下长期储存很少降解，在制成颗粒料过程中也非常稳定，与饲料混合后在室温下长期储存效价下降甚微。恩拉霉素在肠道内不被降解，能够保持原有的抗菌活性。

恩拉霉素是由13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的有机碱。其中氨基酸分子构成环装多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。根据末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素a和恩拉霉素b，恩拉霉素则是由这两种成分组成的混合物。

申请公布号为cn106148460的专利申请提到一种提高恩拉霉素b组分产量的发酵培养基及发酵方法，该方法主要是在恩拉霉素发酵培养基中添加一定量的复合维生素，从而达到提高恩拉霉素b的目的，但复合维生素并不是应用比较广泛的发酵原材料，给发酵过程增加一定的困难，且专利中未提到提高恩拉霉素a的方法，因此对于工业生产还是具有很大的局限性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高恩拉霉素单组分产量的方法以及培养基，旨在通过添加恩拉霉素合成前体氨基酸，以提高恩拉霉素组分a或组分b的产量。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种恩拉霉素单组分的产量提高方法，其特征在于，通过维持培养基中含有一定浓度的氨基酸以提高恩拉霉素a和/或恩拉霉素b的产量；

其中，维持培养基中含有浓度为0.01-0.05％的缬氨酸以提高恩拉霉素a的产量；

维持培养基中含有浓度为0.02-0.1％的异亮氨酸以提高恩拉霉素b的产量。

进一步的技术方案在于，一种用于上述所述方法的培养基，其特征在于，所述培养基为基础发酵培养基，其各组分按照质量百分比配比，其包括玉米淀粉8-10％，黄豆饼粉1-4％，棉籽饼粉0.3-0.7％，玉米浆1-4％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，硫酸铵0.1-0.5％，碳酸钙0.2-0.5％，硫酸亚铁0.01-0.05％，消泡剂0.1-0.5％，氨基酸，余量为水；

所述氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸；所述缬氨酸的浓度为0.01-0.05％，所述异亮氨酸的浓度为0.02-0.1％。

进一步的技术方案在于，所述的培养基中各组分按照质量百分比配比，其包括玉米淀粉10％，黄豆饼粉3％，棉籽饼粉0.5％，玉米浆3％，磷酸二氢钾0.04％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.25％，硫酸亚铁0.02％，消泡剂0.3％，氨基酸，余量为水；

进一步的技术方案在于，所述氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸；所述缬氨酸的浓度为0.01％，所述异亮氨酸的浓度为0.04％。

进一步的技术方案在于，所述氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸；所述缬氨酸的浓度为0.02％，所述异亮氨酸的浓度为0.06％。

进一步的技术方案在于，所述氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸；所述缬氨酸的浓度为0.02％，所述异亮氨酸的浓度为0.04％。

进一步的技术方案在于，所述培养基的ph为7.3-7.5。

本发明另一目的在于，提供一种恩拉霉素中单组分的分离方法，旨在通过加大恩拉霉素各组分在发酵培养液中的含量差，以简化恩拉霉素各组分之间的提取困难。

为解决上述技术问题，本发明所述技术方案为：一种恩拉霉素中单组分的分离方法，其特征在于，利用上述所述方法扩大恩拉霉素各组分在发酵培养液中的含量差。

进一步技术方案在于，利用上述所述培养基扩大恩拉霉素各组分在发酵培养液中的含量差。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明通过添加恩拉霉素a或恩拉霉素b合成途径中的前体物可以大幅度提高相应的产物含量，减少了提取过程中出现的恩拉霉素a和恩拉霉素b分离度不够，产品纯度不高的问题，极大的方便了提纯，且方法简单，原材料易得，工艺操作简单。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1-1是本发明实施例1序号为1恩拉霉素高效液相色谱图；

图1-2是本发明实施例1序号为2恩拉霉素高效液相色谱图；

图1-3是本发明实施例1序号为3恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-1是本发明实施例2序号为1恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-2是本发明实施例2序号为2恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-3是本发明实施例2序号为3恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-4是本发明实施例2序号为4恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-5是本发明实施例2序号为5恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-6是本发明实施例2序号为6恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-7是本发明实施例2序号为7恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-8是本发明实施例2序号为8恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-9是本发明实施例2序号为9恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-10是本发明实施例2序号为10恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-11是本发明实施例2序号为11恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-12是本发明实施例2序号为12恩拉霉素高效液相色谱图；

图2-13是本发明实施例2序号为13恩拉霉素高效液相色谱图；

图3-1是本发明实施例3序号为1恩拉霉素高效液相色谱图；

图3-2是本发明实施例3序号为2恩拉霉素高效液相色谱图；

图3-3是本发明实施例3序号为3恩拉霉素高效液相色谱图；

图3-4是本发明实施例3序号为4恩拉霉素高效液相色谱图；

图3-5是本发明实施例3序号为5恩拉霉素高效液相色谱图；

图3-6是本发明实施例3序号为6恩拉霉素高效液相色谱图；

图4-1是本发明实施例4序号为1恩拉霉素高效液相色谱图；

图4-2是本发明实施例4序号为2恩拉霉素高效液相色谱图；

图4-3是本发明实施例4序号为3恩拉霉素高效液相色谱图；

图4-4是本发明实施例4序号为4恩拉霉素高效液相色谱图；

图4-5是本发明实施例4序号为5恩拉霉素高效液相色谱图；

图4-6是本发明实施例4序号为6恩拉霉素高效液相色谱图；

图5-1是本发明对比例5序号为1恩拉霉素高效液相色谱图；

图5-2是本发明对比例5序号为2恩拉霉素高效液相色谱图；

图5-3是本发明对比例5序号为3恩拉霉素高效液相色谱图；

图5-4是本发明对比例5序号为4恩拉霉素高效液相色谱图；

图5-5是本发明对比例5序号为5恩拉霉素高效液相色谱图；

图5-6是本发明对比例5序号为6恩拉霉素高效液相色谱图；

图5-7是本发明对比例5对照组恩拉霉素高效液相色谱图；

图5-8是本发明对比例5对照组恩拉霉素高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

本发明阐述了一种恩拉霉素单组分的产量提高方法，其通过维持培养基中含有一定浓度的氨基酸以提高恩拉霉素a或恩拉霉素b的产量；

其中，维持培养基中含有浓度为0.01-0.05％的缬氨酸以提高恩拉霉素a的产量；

维持培养基中含有浓度为0.02-0.1％的异亮氨酸以提高恩拉霉素b的产量。

本发明还阐述了一种用于上述方法的培养基，所述培养基为基础发酵培养基，其各组分按照质量百分比配比，其包括玉米淀粉8-10％，黄豆饼粉1-4％，棉籽饼粉0.3-0.7％，玉米浆1-4％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，硫酸铵0.1-0.5％，碳酸钙0.2-0.5％，硫酸亚铁0.01-0.05％，消泡剂0.1-0.5％，氨基酸，余量为水；

所述氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸；所述缬氨酸的浓度为0.01-0.05％，所述异亮氨酸的浓度为0.02-0.1％。

本发明优选实施例中，培养基中各组分按照质量百分比配比，其包括玉米淀粉10％，黄豆饼粉3％，棉籽饼粉0.5％，玉米浆3％，磷酸二氢钾0.04％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.25％，硫酸亚铁0.02％，消泡剂0.3％，氨基酸，余量为水；

本发明优选实施例中，所述氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸；所述缬氨酸的浓度为0.01％，所述异亮氨酸的浓度为0.04％。

本发明优选实施例中，所述氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸；所述缬氨酸的浓度为0.02％，所述异亮氨酸的浓度为0.06％。

本发明优选实施例中，所述氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸；所述缬氨酸的浓度为0.02％，所述异亮氨酸的浓度为0.04％。

本发明优选实施例中，所述培养基的ph为7.3-7.5。

本发明还阐述了一种恩拉霉素中单组分的分离方法，其利用上述所述恩拉霉素单组分的产量提高方法扩大恩拉霉素各组分在发酵培养液中的含量差。

本发明还阐述了一种恩拉霉素中单组分的分离方法，其特征在于，利用上述所述培养基扩大恩拉霉素各组分在发酵培养液中的含量差。

实施例1培养基成分对产量和组分含量的影响实验

本发明提供的摇瓶培养基中采用黄豆饼粉、棉籽饼粉和玉米浆作为氮源。由于恩拉霉素属于多肽类抗生素，本实验主要考察培养基中主要氮源对产量和组分的影响。

1、培养基的配置

准确称取玉米淀粉10％，黄豆饼粉1-4％，棉籽饼粉0.3-0.7％，玉米浆1-4％，磷酸二氢钾0.04％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.25％，硫酸亚铁0.02％，消泡剂0.3％。调ph到7.3-7.5，121℃灭菌30min。

2、发酵生产恩拉霉素

发酵培养基中接入10％的杀真菌素链霉菌种液，28℃、270rpm/min培养180h，对得到的发酵液进行高效液相色谱检测，结果如表1所示：

表1不同培养基配比发酵液中恩拉霉素含量和各组分含量

实施例2氨基酸添加实验

根据对恩拉霉素的结构分析，组成恩拉霉素的氨基酸主要有精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、组氨酸组成，另外酪氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸可能对其代谢都有影响作用。因此对上述氨基酸进行添加实验，考察对组分a和组分b的影响实验。对照组不添加任何氨基酸。

1、基础培养基

准确称取玉米淀粉10％，黄豆饼粉3％，棉籽饼粉0.5％，玉米浆3％，磷酸二氢钾0.04％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.25％，硫酸亚铁0.02％，消泡剂0.3％，其余为水，调ph到7.3-7.5，121℃灭菌30min。

2、添加氨基酸

向基础培养基中分别加入0.05％的精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。

3、发酵培养

发酵培养基中接入10％的杀真菌素链霉菌种液，28℃、270rpm/min培养180h，对得到的发酵液进行高效液相色谱检测。高效液相色谱结果如图5所示。经高效液相色谱检测，结果如表2所示：

表2添加不同的氨基酸后发酵液中恩拉霉素含量以及各组分含量

实施例3不同浓度缬氨酸对恩拉霉素a的影响实验

1、培养基的配置

准确称取玉米淀粉10％，黄豆饼粉3％，棉籽饼粉0.5％，玉米浆3％，磷酸二氢钾0.04％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.25％，硫酸亚铁0.02％，消泡剂0.3％。加入终浓度为0.01-0.03％的缬氨酸，调ph到7.3-7.5，121℃灭菌30min。对照组不添加任何氨基酸。

2、发酵生产恩拉霉素

发酵培养基中接入10％的杀真菌素链霉菌种液，28℃、270rpm/min培养180h，对得到的发酵液进行高效液相色谱检测。高效液相色谱结果如图1所示。经高效液相色谱检测，结果如表3所示：

表3添加不同浓度缬氨酸后发酵中恩拉霉素含量和各组分含量

实施例4不同浓度异亮氨酸对恩拉霉素b的影响实验

1、培养基的配置

准确称取玉米淀粉10％，黄豆饼粉3％，棉籽饼粉0.5％，玉米浆3％，磷酸二氢钾0.04％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.25％，硫酸亚铁0.02％，消泡剂0.3％。加入终浓度为0.01-0.03％的缬氨酸，调ph到7.3-7.5，121℃灭菌30min。对照组不添加任何氨基酸。

2、发酵生产恩拉霉素

发酵培养基中接入10％的杀真菌素链霉菌种液，28℃、270rpm/min培养180h，对得到的发酵液进行高效液相色谱检测。高效液相色谱结果如图1所示。经高效液相色谱检测，结果如表4所示：

表4添加不同浓度的异亮氨酸后发酵液中的恩拉霉素含量和各组分含量

实施例5不同恩拉霉素a和b差值发酵液分离实验

由于本发明涉及到的方法主要是在发酵液中对恩拉霉素a和恩拉霉素b进行组分调整，可分别针对性的降低组分a或组分b的含量，因此针对不同组分比例的发酵液可分别收集对应的组分，不必进行多次收集，省去了多次收集的繁琐步骤，简化提纯工艺。

对得到的不同恩拉霉素a和b差值的发酵液利用大孔树脂进行分离纯化，分别对收集液进行hplc检测纯度，结果如表5所示。对照组发酵过程中不添加任何氨基酸。

表5组分含量不同发酵液分离后各组分含量。