一种裂殖壶菌发酵产多不饱和脂肪酸的调控方法与流程

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种裂殖壶菌发酵产多不饱和脂肪酸的调控方法。

背景技术：

多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，pufas)即含有两个及以上双键且碳原子数在18个及上的长直链脂肪酸，主要分为ω-3多不饱和脂肪酸和ω-6多不饱和脂肪酸。主要包括ω-3型的二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，dha)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，epa)和ω-6型花生四烯酸(arachidonicacid，ara)(bellous.etal.2016)；具有防止心血管疾病、防止炎症、免疫调节和促进视力和人脑发育等多种生理功能，在膳食营养、医药、化妆品等多领域具有广泛应用(swansond.etal.2012)。dha和epa的传统来源从深海鱼油中提取而来(ruiz-lópezn.etal.2012)。但由于深海鱼油含量有限，且全球鱼类种群数量正在减少，海洋生态系统环境受到污染，(domingojl.etal.2007)难以满足日益增长的市场需求，利用微生物法发酵生产dha和epa具有更高的生长速率、可控的生长条件、含有类胡萝卜素等抗氧化剂防止被氧化以及不受地域限制等优点，成为当前研究的热点(gongy.etal.2014)。

常见的可以合成dha和epa的微生物主要包括破囊壶藻、隐甲藻和希瓦氏菌(doughmansd.etal.2007，martinsda.etal.2013)。工业上常用的用来生产dha的菌种主要是裂殖壶菌，生产epa的菌种主要是希瓦氏菌、裂殖壶菌和酿酒酵母(xuezetal.2013)。其中裂殖壶菌摇瓶发酵生物量可达30g/l左右，脂质积累可达干重的50％以上，dha含量可达到脂质含量的30％以上，epa含量可达脂质含量的0.4％左右，成为工业生产的主要菌株(guods.etal.2017)。

目前，关于微生物法生产pufas的研究主要还集中在培养基优化、发酵条件优化以及发酵策略优化的探索上。除菌株本身产生的代谢物质影响外，培养基的组成成分和发酵策略的优化等对其生长和油脂积累也有很大影响，如最佳的碳氮比、碳源、氮源和补料策略等。当前，已有大量关于碳氮比和补料策略等方面的研究，而对细胞代谢产生影响的抑制剂因子的添加成果较少。由于裂殖壶菌产pufas代谢途径较为复杂，对此亦有较大分歧结果，成产过程的代谢调控也成为难点之一。

裂殖壶菌发酵生产pufas的油脂合成途径主要包括pks途径和fas途径。pufas的合成本质都是碳链的不断延长和氧化脱氢的酶促反应(nadph为还原力)的共同作用。裂殖壶菌的pks途径与fas合成途径类似，都以酰基载体蛋白(acp)作为碳链延长的共价结合位点，首先在乙酰-coa羧化酶(acc)的作用下，将乙酰-coa转化成丙二酰-coa，然后经过缩合、还原、脱水、还原/异构的循环往复，最终合成pufas。有所不同的是，在pks途径中，由于pks合成酶中存在脱水酶/异构酶(d/i)，pks途径可以在碳链延长过程中直接形成双键，生成一系列多酮基化合物前体，最后经过脱氢或还原反应，将这些前体合成pufas，此过程不必经过需氧去饱和引入双键的途径，即不需要脂肪酸脱氢酶和去饱和酶的参与。另外，磷酸戊糖途径(ppp)主要为油脂合成提供nadph，而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)作为该途径主要限速酶，通过提高g6pdh的活力，能够为油脂合成提供更多的nadph(cuigz.etal.2016)。研究认为，在细胞体内，过量的c16:0和c18:0会反馈抑制acc活力，降低油脂合成通路流量(qiaoketal.2015)，同时会反馈抑制g6pdh活力，nadph的合成减少。由此可见，降低细胞体内c16:0和c18:0含量可以降低对acc和g6pdh的反馈抑制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种裂殖壶菌发酵产多不饱和脂肪酸的调控方法。

本发明的技术方案如下：

一种裂殖壶菌发酵产多不饱和脂肪酸的调控方法，将产pufas的裂殖壶菌经过平板培养基培养和种子培养基活化后，获得种子液，将该种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，在该发酵培养处于对数生长初期时，向发酵液中添加三氯生，使三氯生在发酵液中的浓度达到3-10μm/l，以在对发酵液的生物量基本无影响的同时，促进发酵液中总油脂的大量积累和pufas的转化，同时提高中性油脂占比。

在本发明的一个优选实施方案中，在该发酵培养处于对数生长初期时，向发酵液中添加三氯生，使三氯生在发酵液中的浓度达到8μm。

在本发明的一个优选实施方案中，所述平板培养基的ph为6.5，且该平板培养基由葡萄糖、酵母粉、琼脂、20×组分a和500×cacl22ml以20g∶10g∶15-20g∶50ml∶2ml的比例组成；

每250ml的20×组分a的组成为：na2so460g，mgso410g，kh2po45g，(nh4)2so45g，k2so43.25g，kcl2.5g，水定容至250ml，

每100ml的500×cacl2的组成为：cacl2·2h2o8.5g或无水cacl26.418g，水定容至100ml。

进一步优选的，所述种子培养基的ph为6.5，且由葡萄糖、酵母粉、20×组分a和500×cacl22ml以20g∶10g∶50ml∶2ml的比例组成。

进一步优选的，所述发酵培养基的ph为6.5，每升发酵培养基中含有葡萄糖90g/l、玉米浆粉5g/l、蛋白胨5g/l和20×组分a50ml。

在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养的整个周期为120h。

进一步优选的，所述对数生长初期位于发酵培养开始起24h。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用三氯生作为烯酰acp还原酶的抑制剂，在裂殖壶菌体内，能抑制fas途径，从而降低了c16:0的含量；同时促进细胞体内非极性油脂向极性油脂的转化，提高极性油脂占比。

2、本发明在对数生长初期添加三氯生，减少对生物量的影响，此时细胞生长较为完善，对生物量影响较小；同时，对数生长初期细胞开始生产油脂，此时添加三氯生进一步提高了细胞内总油脂积累以及中性油脂占比；更重要的是显著提高了pufas的转化，72h时pufas/sfas显著提高，其中总油脂和pufas产量得到了最大幅度的增加。

附图说明

图1为本发明实施例1中发酵初期添加不同浓度三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵细胞生物量的影响。

图2为本发明实施例1中发酵初期添加不同浓度三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵细胞内总油脂产量的影响。

图3为本发明实施例1中发酵初期添加3μm三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵培养至72h细胞内脂肪酸成分的影响。

图4为本发明实施例2中对数生长初期添加不同浓度三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵细胞生物量的影响。

图5为本发明实施例2中对数生长初期添加不同浓度三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵细胞内总油脂产量的影响。

图6为对数生长初期添加8μm三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵培养至48h细胞内中极性油脂含量的影响。

图7为本发明实施例1中对数生长初期添加8μm三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵培养至72h细胞内中极性油脂含量的影响。

图8为本发明实施例3中对数生长中期添加不同浓度三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵细胞生物量的影响。

图9为本发明实施例3中对数生长中期添加不同浓度三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵细胞内总油脂产量的影响。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

下述各实施例中的平板的培养基的ph为6.5，且该培养基由葡萄糖、酵母粉、琼脂、20×组分a和500×cacl22ml以20g∶10g∶15-20g∶50ml∶2ml的比例组成；

每250ml的20×组分a的组成为：na2so460g，mgso410g，kh2po45g，(nh4)2so45g，k2so43.25g，kcl2.5g，水定容至250ml，

每100ml的500×cacl2的组成为：cacl2·2h2o8.5g或无水cacl26.418g，水定容至100ml。

一级和二级种子液的培养基的ph为6.5，且由葡萄糖、酵母粉、20×组分a和500×cacl22ml以20g∶10g∶50ml∶2ml的比例组成。

基础培养基(即发酵培养基)的ph为6.5，每升发酵培养基中含有葡萄糖90g/l、玉米浆粉5g/l、蛋白胨5g/l和20×组分a50ml。

发酵培养的整个周期为120h，对数生长初期位于发酵培养开始起24h。

实施例1.发酵初期添加三氯生对schizochytriumsp.atcc1381发酵的影响

将保存于-80℃的schizochytriumsp.atcc1381(购自美国典型培养保藏中心(atcc)，美国维吉尼亚州)甘油管化线于固体培养基，28℃培养36h；取活化好的平板，用灭菌的接种环挑取形态饱满的单菌落于含50ml种子培养基的250ml锥形瓶，28℃，200rpm摇床培养24h；按4％的接种量转接一级种子液至含50ml种子培养基的250ml锥形瓶，28℃，200rpm摇床培养24h；按4％的接种量转接二级种子液至含100ml发酵培养基的500ml锥形瓶中；在基础培养基中添加1-8μm三氯生，28℃，200rpm摇床培养。结果如图1、图2和图3所示。

由图1可见在发酵初期添加三氯生(≥3μm)显著降低生生物量，以至于抑制了总油脂积累。由图2可见，添加1μm三氯生在不影响生物量的前提下，略微提高了总油脂产量，而添加3μm三氯生，总油脂积累略微有所降低。由图3分析可知，与对照组相比，实验组c14:0和c16:0含量显著降低，dha和epa含量略微提高，说明三氯生的添加能显著抑制fas途径。

表1为对数生长初期添加8μm三氯生对裂殖壶菌(schizochytriumsp.)atcc1381发酵细胞内总油脂产量、以及各种pufas产量的影响：

实施例2.对数生长初期添加三氯生对schizochytriumsp.atcc1381发酵的影响

考虑到发酵初期添加三氯生对于细胞生物量影响较大，因此，考虑在细胞生长一段时间后，细胞生长的较为完善，即对数生长初期添加三氯生，以期在不影响生物量的前体下，提高细胞内总油脂产量和pufas的产量。结果如图4和图5所示。

由图4可见，在对数生长初期添加三氯生，对于细胞生物量基本没有影响；由图5和表1可见，在对数生长初期添加三氯生(≥3μm)，都能促进细胞内总油脂的积累和pufas的转化，可以发现在添加8μm三氯生时，总油脂产量和pufas产量提高最为明显，分别较对照组提高42.93％和50.4％。这可能是由于三氯生的添加抑制了烯酰acp还原酶的活性，抑制fas途径，从而降低了c16:0含量，减少了对acc的反馈抑制和g6pdh的抑制，酶活得以提高，增加油脂合成通路；同时油脂合成的fas途径和pks途径在一定程度上有竞争关系，fas途径被削弱后，pks途径在一定程度上有所提高，提高pufas含量。同时由图6和图7可见，添加8μm三氯生后，培养至48h和72h时，能显著提高中性油脂的占比，从而提高pufas在中性油脂中的含量。这可能是由于三氯生在对数生长初期添加三氯生后，抑制细胞内磷脂的合成，从而减少了极性油脂，提高了中性油脂的占比。

实施例3.对数生长中期添加三氯生对schizochytriumsp.atcc1381发酵的影响

考虑在对数生长初期，细胞内油脂刚开始合成，而在对数生长中期，细胞内油脂开始大量合成。因此考察在对数生长中期，即细胞内油脂开始大量合成时，添加三氯生对细胞内总油脂产量和pufas转化的影响。结果如图8和图9所示。

由图8可以看出，在对数生长中期添加三氯生对于生物量同样影响不大，说明细胞生长较为完善，受外界环境影响较小。由图9可以看出，细胞内总油脂产量都有所提高，并且在添加8μm三氯生时，总油脂产量较对照组提高最为明显。对比以上添加策略，实施例2的添加策略下获得最佳发酵效果，在添加8μm三氯生后，细胞内总油脂产量和pufas产量得到了最大幅度的增加，产量分别达到19.97g/l和7.58g/l，较对照组分别提高42.93％和50.4％。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。