专利名称：甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域中的克隆、表达技术，具体涉及甘蔗条螟生长发育关键基因——蜕皮调节转录因子CSHR3基因克隆及细菌介导RNAi技术表达CsHR3 dsRNA,来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程。
背景技术：
随着世界人ロ的急剧增长，如何提高农作物产量是一个迫在眉睫的问题。据统计， 因虫害引起的粮食损失占整个粮食收成的20%。因此，如何有效控制虫害是提高作物产量的ー个重要因素。大量使用化学农药虽然可以抑制虫害，但容易引起昆虫的抗性，而且对环境破坏极大，不利于人类的可持续发展。随着生物技术的快速发展，通过转基因方法改造植物，提高植物自身的抗虫害能力已成为农作物育种的主流。上世纪九十年代，科学家们利用转基因手段使农作物表达Bt蛋白以提高农作物对农业害虫的生物防治在全球被广泛使用。然而，最近的研究发现有些昆虫的中肠上皮细胞中丢失了一类能与Bt蛋白结合的受体而使昆虫对Bt蛋白产生了抗性。最近，在农业上RNAi技术已发展成为一种控制虫害、提高作物品质的新方法。RNA干扰(RNAi)是ー种新发现的基因调控机制。人们从植物的基因表达共抑制和真菌的抑菌作用现象发现了 RNA干扰这ー古老的生物体基因调控机制。早在1998年，Fire 等人发现双链RNA (dsRNA)可导致靶基因的表达抑制。不久，RNA干扰已发展成为ー种成熟技术，被广泛应用于靶基因的功能研究中。在昆虫中，通过dsRNA诱导的RNA干扰(RNAi) 可用来研究昆虫基因的功能。尤其是近年来，细菌介导或植物介导RNAi表达dsRNA的方法已在多种昆虫中诱导靶标基因的沉默。然而，还有很多科学问题需要去探讨和研究，如通过 RNAi介导沉默害虫非中肠基因能否诱导害虫死亡表型的出现；RNAi介导表达dsRNA量与害虫死亡表型或生长发育阻碍是否呈正相关；RNAi介导沉默靶标基因的周期与害虫生测表型之间的相关性；选择哪ー靶标基因在害虫生物防治中周期短、生测效果好、更加高效等， 这ー系列问题都需要在试验探索和研究中验证。RNAi技术在昆虫中研究功能基因的方法主要是注射法，一般通过把预干扰靶标基因dsRNA或SiRNA用微量注射器导入昆虫的胚胎或体腔，从而实现对靶标基因mRNA表达的抑制。注射法RNAi虽然在昆虫功能基因方面取得了巨大的成绩，但也存在以下诸多问题: 首先，注射法RNAi对实验操作人员技术要求很高、难度大、強度大，极易因操作不当而导致数据不准及昆虫死亡。其次，注射法RNAi制备dsRNA或SiRNA均需要借助昂贵的国外试剂盒完成，增加了实验成本，所制备dsRNA或siRNA的量却很少。最后，注射法RNAi往往需要对单ー昆虫逐个进行注射操作，为其广泛应用田间害虫生物防治増加了难度。为了能满足方便地研究昆虫功能基因需要，特别是为探索新的害虫生物防治方法，需要更好的细菌介导或植物介导RNAi技术在昆虫功能基因研究应用。
蜕皮调节转录因子是ー类同时启动蜕皮早期基因簇表达，又抑制蜕皮晚期基因簇表达的调节因子，在昆虫蜕皮过程中发挥重要的基因表达调控作用。现有研究发现，可从多种昆虫中获得家族的生长发育关键基因，如棉铃虫がぬ J、烟草天蛾i&K 、果蝇
等。Josefa等从德国小蠊中克隆到蜕皮调节转录因子汝ガ似，并通过RNAi技术抑制汝ガ似基因表达，结果发现幼虫不能脱掉旧表皮，发生皮层溶离，表明取*K 基因直接參与德国小蠊幼虫蜕皮。昆虫若不能正常蜕皮，则无法变成成虫，从而形成取食量降低、没有生命力甚至死亡表型的个体。蜕皮调节转录因子是蜕皮过程中关键因子，同时也受到机体相关基因的严格调控，当表达水平降低或异常提高时都会影响昆虫的正常蜕皮。因此，打破蜕皮基因的平衡，干扰昆虫蜕皮，破坏其正常的生长发育过程，可达到杀灭害虫和控制害虫种群的目的。国外已对果蝇、烟草天蛾、德国小蠊等蜕皮调节转录因子进行了基因克隆和作用机理研究。其中果蝇的/研究较为深入，该基因在果蝇蜕皮和变态生长发育中起关键作用。GenBank数据库中目前尚无关于甘蔗条螟蜕皮调节因子基因的记录和研究报道。
发明内容
本发明目的在于提供ー种从甘蔗条螟幼虫中提取的甘蔗条螟蜕皮调节转录因子 cDNA，并提供甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法以及重组应用，还提供了ー种细菌介导RNAi技术防治甘蔗条螟的新方法。为实现上述目的，本发明采取如下技术方案
本发明从甘蔗条螟中克隆到甘蔗条螟蜕皮调节转录因子6 / 基因的cDNA，它具有 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示的序列
(I)SEQ ID NO. I 的信息
(a)序列特征
*长度1266碱基对 *类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性
(b)分子类型cDNA
(c)假设否
(d)反义否
(e)最初来源甘鹿条螟(CXiirOsacchariphagus)
(f)序列描述SEQID NO. I
权利要求
1.一种甘蔗条螟蜕皮调节转录因子的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所述。
2.权利要求I所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子，其氨基酸序列如SEQID NO. 2 所述。
3.权利要求I所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，包括以下步骤(O从甘蔗条螟预蛹期幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA ；(2)根据不同鳞翅目昆虫蜕皮调节转录因子的保守序列设计简并引物CsHR3-middle fragment-Pl 5' -ACAGffGGTGAACTACCAGTG -3’CsHR3-middle fragment-P2 :5’-GACCATGRAATTGGTCGCT-3’(3)以cDNA为模板，PCR扩增甘蔗条螟CsHR3基因的中间片段；(4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到PMD19-T simple载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，蓝白斑筛选含中间片段的阳性克隆子；(5)根据CsHR3中间片段的测序结果，设计3’RACE特异性引物，以甘蔗条螟cDNA为模板，PCR扩增CsHR3基因的3’片段序列；CsHR3-3’ RACE-GSPI :5’ - CGGGTCAACAGGAATAGATGTCA -3’CsHR3-3’ RACE-GSP2 :5’- CAGCGCCTGACTCAGTGTATGAC-3’(6)纯化步骤(5)所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到PMD19-T 载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，蓝白斑筛选获得CsHR3基因 3’端的阳性克隆子；(7)将步骤(4)和(6)所得的阳性克隆子进行序列测定，然后将测定所得序列通过生物信息学软件DNAman拼接，得到CsHR3基因1266 bp序列。
4.如权利要求3所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，其特征在于，所述步骤(I)中反转录合成cDNA具体为取总RNA 5微升、Random引物I微升、底物dNTPs 2 微升，用RNase-free H2O加至10微升,混勻，65°C保温5min,迅速放至冰上冷却3min ;然后在上述混合物中加入5 X Primer Script Buffer 4微升、RNA酶抑制剂O. 5微升、AMV反转录酶O. 5微升，并用RNase-free H2O加至20微升，42°C反应60min，70°C灭火15min，4°C冷却，-20°C保存备用。
5.如权利要求3所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，其特征在于，步骤(3)和(5)中PCR扩增所用的反应试剂组成及反应条件如下首先将下述试剂混合在一起，模板 cDNAIM-I脱氧核苷酸底物dNTP4μ1Ex-Taq DNA 聚合酶O. 5μ1 IOXTaq DNA聚合酶缓冲液5μ1正向引物(ΙΟμΜ)2μ1反向引物(ΙΟμΜ)2μ1ddH2035. 5μ1总体积50μ1反应条件为首先94°C预变性3分钟；然后进行如下循环94°C 30秒，50°C 30秒，720C 2分钟，共进行32循环；最后72°C延伸10分钟。
6.权利要求I所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的重组应用，采用细菌介导RNAi 技术在RNaseIII缺陷型大肠杆菌HTl 15中表达dsRNA，获得具有生物活性的dsRNA，通过饲喂甘蔗条螟幼虫，来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程，从而用于甘蔗条螟害虫的生物防治；或者通过基因工程方法将甘蔗条螟蜕皮调节转录因子转入作物，获得具有抗虫能力的作物。
7.—种细菌介导RNAi防治甘鹿条螟的方法,其特征在于,选择甘鹿条螟脱皮调节转录因子CsHR3基因作为靶标，选定其CsHR3基因上含有非LBD功能结构域和LBD功能结构域的两个dsRNA干扰片段，构建细菌介导的RNAi重组载体L4440-CsHR3_I I、L4440-CsHR3_I2， 同时选用绿色荧光蛋白基因EGFP作为阴性对照，清水作为负对照；通过热激法将上述载体导}KEcoli. HT115 (8似86 111缺陷型大肠杆菌)中，加入0.8禮IPTG进行诱导表达，提取细菌表达dsRNA进行甘蔗条螟幼虫的饲喂试验，记录3龄和5龄甘蔗条螟饲喂7天后表型变化及体内CsHR3基因mRNA降低水平。
全文摘要
本发明属于生物基因工程领域，甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。本发明克隆方法是从甘蔗条螟预蛹期幼虫中提取总RNA，反转录合成cDNA；根据不同鳞翅目昆虫蜕皮调节转录因子的保守序列设计简并引物，PCR扩增甘蔗条螟CsHR3基因的中间片段，再通过3’-RACE技术设计特异性引物，成功获得CsHR3基因1266bp片段。本发明采用细菌介导RNAi技术在RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌HT115中表达dsRNA，获得具有生物活性的dsRNA，通过饲喂甘蔗条螟幼虫来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程，从而用于甘蔗条螟害虫的生物防治；或者通过基因工程方法将甘蔗条螟蜕皮调节转录因子转入作物，获得具有抗虫能力的作物。
文档编号A23K1/16GK102586259SQ20121005961
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者余乃通, 刘志昕, 张树珍, 张雨良, 熊国如, 王俊刚, 王健华 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所