一种提高虾壳内钙离子结合能力的虾壳酶解的方法与流程

本发明涉及一种水产品加工方法，尤其涉及一种提高虾壳内钙离子结合能力的虾壳酶解的方法。
背景技术：
：钙对人体发挥着重要的作用，科学补钙和选择钙补充剂非常关键。市场上钙制剂种类繁多，从无机钙、有机钙到螯合钙，始终离不开钙的安全性和生物利用率这两个基本要素。螯合钙是指氨基酸或者肽与钙源中金属钙离子通过稳定的配位键作用形成的一种金属络合物，目前主要有氨基酸螯合钙和肽螯合钙两大类。氨基酸钙和肽钙作为第三代钙制剂，具有稳定性好，吸收率高，副作用小等优点，将成为市场主要的补钙剂。而其中，海洋生物钙则主要来自海洋生物体，其钙源有着独特的生物结构，特别是甲壳类等钙源，利用其丰富的蛋白质、胶原、甲壳素、钙等成分优势，辅助配位螯合制备具备安全、高生物利用率的钙制剂将成为未来海洋生物钙发展的重要方向。截止2016年底，我国海水养殖对虾总产量为127万吨，捕捞对虾产量为17.23万吨。在对虾加工中产生的虾头、虾壳等废弃物约占虾体重量30％～40％。研究表明，虾壳中富含生物钙、甲壳素等活性物质，因此开展虾壳综合利用研究并产业化应用并利用虾壳提取其中的有效成分具有重要的经济和环保意义。技术实现要素：本发明提供了一种提高虾壳内钙离子结合能力的虾壳酶解的方法，利用虾壳并通过特定酶解方法，提高酶解液结合钙的能力，从而为制备虾壳螯合钙奠定基础。本发明采用的技术方案如下：一种提高虾壳内钙离子结合能力的虾壳酶解的方法，包括以下步骤：s1：将虾壳打碎为虾壳粉并加入去离子水，磁力搅拌后得到虾壳粉溶液，虾壳粉溶液质量分数为5-25％；将虾壳粉溶液煮沸保持10-30min，后降温自然冷却；然后在虾壳粉溶液中加入食品级盐酸31(％)，加入食品级盐酸的重量为虾壳粉重量的2-3％，30-40℃维持2-3h，然后升温搅拌，将溶液中的盐酸挥发出来。s2：特定微生物初步发酵：加入米曲霉菌种和枯草芽孢杆菌菌种各0.1-0.2份，充分拌匀，低温发酵30-35h，发酵完成后升温灭菌。s3：调节发酵后的虾壳粉溶液的ph至10.0～11.0，加入3500～4500u/g碱性蛋白酶并于55～60℃条件下酶解5～6小时。s4：待步骤s3中的虾壳粉溶液酶解结束后，于95℃条件下灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，经4000rpm离心15min后完成酶解。优选的，步骤s1中的虾壳粉粒径为0.65～2.5mm。优选的，步骤s2中低温发酵的温度维持在20-23℃。优选的，步骤s3中的碱性蛋白酶添加量为4000u/g。优选的，步骤s2中的酶解温度为55℃。优选的，步骤s2中的酶解时间为5.5小时。本发明经过多方实验，选择了盐酸初步酸化，特定微生物低温初步发酵，然后再选择碱性蛋白酶酶解的技术路线。碱性蛋白酶是一种有着宽广作用范围的丝氨酸内肽酶，能够裂解glu、met、leu、tyr、lys和gly的羧端肽键，提高虾壳内钙离子的结合力，在综合考量多方的酶解条件后，可以使得酶解液的水解度达到16.33％，钙结合量平均值1.954mg/ml的水准。该方法简单易实施，多方条件安全可控，可以在生产中加以推广。以下结合附图对本发明进行更进一步详细的说明。附图说明图1为不同蛋白酶酶解液的钙结合量和水解度；图2为ph对酶解液的钙结合量和水解度的影响；图3为酶添加量对酶解液的钙结合量和水解度的影响；图4为酶解时间对酶解液的钙结合量和水解度的影响；图5为酶解温度对酶解液的钙结合量和水解度的影响；图6为底物浓度对酶解液的钙结合量和水解度的影响。具体实施方式下面，通过示例性的实施方式对本发明具体描述。然而应当理解，在没有进一步叙述的情况下，一个实施方式中的特征也可以有益地结合到其他实施方式中。以下提供实施例1至实施例4，阐述本发明中的一种提高虾壳内钙离子结合能力的虾壳酶解的方法。实施例1：一种提高虾壳内钙离子结合能力的虾壳酶解的方法，包括以下步骤：s1：将虾壳打碎为虾壳粉并加入去离子水，磁力搅拌后得到虾壳粉溶液，虾壳粉溶液质量分数为5％；将虾壳粉溶液煮沸保持10min，后降温自然冷却；然后在虾壳粉溶液中加入食品级盐酸31(％)，加入食品级盐酸的重量为虾壳粉重量的2％，30℃维持3h，然后升温搅拌，将溶液中的盐酸挥发出来。s2：特定微生物初步发酵：加入米曲霉菌种和枯草芽孢杆菌菌种各0.1份，充分拌匀，低温发酵35h，发酵完成后升温灭菌。s3：调节发酵后的虾壳粉溶液的ph至10.0，加入3500u/g碱性蛋白酶并于55℃条件下酶解5小时。s4：待步骤s3中的虾壳粉溶液酶解结束后，于95℃条件下灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，经4000rpm离心15min后完成酶解。步骤s1中的虾壳粉粒径为0.65mm。步骤s2中低温发酵的温度维持在20℃。实施例2：一种提高虾壳内钙离子结合能力的虾壳酶解的方法，包括以下步骤：s1：将虾壳打碎为虾壳粉并加入去离子水，磁力搅拌后得到虾壳粉溶液，虾壳粉溶液质量分数为25％；将虾壳粉溶液煮沸保持30min，后降温自然冷却；然后在虾壳粉溶液中加入食品级盐酸31(％)，加入食品级盐酸的重量为虾壳粉重量的3％，40℃维持2h，然后升温搅拌，将溶液中的盐酸挥发出来。s2：特定微生物初步发酵：加入米曲霉菌种和枯草芽孢杆菌菌种各0.2份，充分拌匀，低温发酵30h，发酵完成后升温灭菌。s3：调节发酵后的虾壳粉溶液的ph至11.0，加入4500u/g碱性蛋白酶并于60℃条件下酶解5小时。s4：待步骤s3中的虾壳粉溶液酶解结束后，于95℃条件下灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，经4000rpm离心15min后完成酶解。步骤s1中的虾壳粉粒径为2.5mm。步骤s2中低温发酵的温度维持在23℃。实施例3：一种提高虾壳内钙离子结合能力的虾壳酶解的方法，包括以下步骤：s1：将虾壳打碎为虾壳粉并加入去离子水，磁力搅拌后得到虾壳粉溶液，虾壳粉溶液质量分数为18％；将虾壳粉溶液煮沸保持20min，后降温自然冷却；然后在虾壳粉溶液中加入食品级盐酸31(％)，加入食品级盐酸的重量为虾壳粉重量的2.6％，33℃维持2.5h，然后升温搅拌，将溶液中的盐酸挥发出来。s2：特定微生物初步发酵：加入米曲霉菌种和枯草芽孢杆菌菌种各0.2份，充分拌匀，低温发酵33h，发酵完成后升温灭菌。s3：调节发酵后的虾壳粉溶液的ph至11，加入4000u/g碱性蛋白酶并于55℃条件下酶解5.5小时。s4：待步骤s3中的虾壳粉溶液酶解结束后，于95℃条件下灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，经4000rpm离心15min后完成酶解。步骤s1中的虾壳粉粒径为1mm。步骤s2中低温发酵的温度维持在22℃。本发明在研究过程中，前两个步骤都是为了给后面的蛋白酶酶解提供更好的酶解底物和条件。通过研究发现，本发明利用单一的碱性蛋白酶就可以达到很高的酶解效果。为此，本发明提供以下实验例4～实验例9，以阐述此种虾壳酶解方法的优点和酶解条件选择的原因。实验例4：蛋白酶的筛选实验以下提供实施本方法的材料、试剂与仪器：虾壳为南美白对虾制作虾仁脱壳后的下脚料，已熟化，收集后运往实验室。主要试剂包括中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；甲醛、氢氧化钠、浓盐酸、无水乙醇、氯化钙、钙羧酸指示剂、乙二胺四乙酸等(分析纯)等。仪器与设备包括：电子天平(al204)、ph计(phs-3c)、离心机(universal320r)、可见分光光度计(722型)、万能粉碎机(wf-18b)、超微粉碎机(wk-150a)、集热式恒温加热磁力搅拌器(df-2)。实验过程：称取适量的虾壳粉，按照物料质量加入一定体积的去离子水，置于磁力搅拌器上，调节溶液ph后按比例，加入蛋白酶，在蛋白酶最适温度下进行酶解反应，酶解结束后95℃灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，再经4000rpm离心15min。底物浓度即为虾壳粉溶液的浓度。测定虾壳在各蛋白酶的适宜ph与酶解温度下，所得酶解液的氨基态氮含量和钙离子结合活性，具体酶解条件信息如表1所示，酶解结果如图1所示。表1不同酶的酶解条件信息表酶的种类ph温度/℃酶量/(u/g底物)时间/h底物浓度/％碱性蛋白酶10.0503000410胰蛋白酶7.0373000410中性蛋白酶8.0453000410木瓜蛋白酶7.0373000410风味蛋白酶7.0373000410由图1可知，在碱性蛋白酶作用下，虾壳的水解度最高，且酶解液钙离子结合能力最强。这主要是由于碱性蛋白酶是一种有着宽广作用范围的丝氨酸内肽酶，能够裂解glu、met、leu、tyr、lys和gly的羧端肽键。胰蛋白酶酶解能力与碱性蛋白酶相当，但钙离子的螯合力弱于碱性蛋白酶。综合考虑酶解液的两项指标，选择碱性蛋白酶作为优选的酶解用酶。实验例5：不同ph条件下的酶解结果如实验例1所示的材料、试剂与仪器。实验过程：称取适量的虾壳粉，按照物料质量加入一定体积的去离子水，虾壳粉溶液的浓度为10％。将虾壳粉溶液置于磁力搅拌器上，调节溶液ph后按比例加入碱性蛋白酶，取ph分别为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0进行实验。酶解结束后95℃灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，再经4000rpm离心15min。不同ph对虾壳酶解的影响结果如图2所示。从图中看出ph值大小对酶解效果有较显著的影响，因为ph的大小对碱性蛋白酶的活力会有巨大影响，随反应液ph的升高，样品的水解度和钙结合量都逐步提高，至ph为10.0时趋于平缓，ph位于10～11时，酶解结果无显著差异。方便实际生产中的应用，选择ph为10.0作为最佳的ph值。实验例6：不同酶添加量的虾壳酶解结果如实验例1所示的材料、试剂与仪器。实验过程：称取适量的虾壳粉，按照物料质量加入一定体积的去离子水，虾壳粉溶液的浓度为10％。将虾壳粉溶液置于磁力搅拌器上，调节溶液ph后加入2500～4500u/g的碱性蛋白酶，取ph为10.0进行实验。酶解结束后95℃灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，再经4000rpm离心15min。不同酶添加量对虾壳酶解结果的影响如图3所示。随着碱性蛋白酶添加量的提高，样品水解度也在逐渐提高。但对钙离子的结合能力在蛋白酶添加量为4000u/g时达到峰值，继续增大酶用量反而抑制钙结合量。这说明虽然酶添加量提高可以使虾壳蛋白的水解度提高，但同时也会使酶解液中的钙离子结合活性肽更易被降解为无生物活性的游离氨基酸和小分子肽，令其纯度降低。结合两种指标优选，酶添加量为3500～4500u/g为好。基于实际生产应用考虑，优选酶添加量为4000u/g。实验例7：不同酶解时间下的虾壳酶解结果如实验例1所示的材料、试剂与仪器。实验过程：称取适量的虾壳粉，按照物料质量加入一定体积的去离子水，虾壳粉溶液的浓度为10％。将虾壳粉溶液置于磁力搅拌器上，调节溶液ph后加入4000u/g的碱性蛋白酶，取ph为10.0进行实验，酶解时间为3～7小时，酶解结束后95℃灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，再经4000rpm离心15min。从图4中看出，酶解时间位于5～6小时内时酶解结果良好，基于整体考量，优选的酶解时间为5.5小时。实验例8：不同酶解温度下的虾壳酶解结果如实验例1所示的材料、试剂与仪器。实验过程：称取适量的虾壳粉，按照物料质量加入一定体积的去离子水，虾壳粉溶液的浓度为10％。将虾壳粉溶液置于磁力搅拌器上，调节溶液ph后加入4000u/g的碱性蛋白酶，取ph为10.0进行实验，酶解时间为3～7小时，酶解温度为40～60℃。酶解结束后95℃灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，再经4000rpm离心15min。不同酶解温度对虾壳酶解结果的影响如图5所示。在40-60℃的温度范围内，随温度升高，酶解液中的水解度逐渐提高，并在55℃以后趋于稳定。因此，本发明方案将酶解温度设定为55～60℃，为经济效益考量，优选为55℃。实验例9：不同底物浓度下的虾壳酶解结果如实验例1所示的材料、试剂与仪器。实验过程：称取适量的虾壳粉，按照物料质量加入一定体积的去离子水，虾壳粉溶液的浓度为4％至12％。将虾壳粉溶液置于磁力搅拌器上，调节溶液ph后加入4000u/g的碱性蛋白酶，取ph为10.0进行实验，酶解时间为3～7小时，酶解温度为40～60℃。酶解结束后95℃灭酶15min，冷却至室温后调节酶解液ph至7.0，再经4000rpm离心15min。其结果如图6所示，综合考量选择10％作为底物浓度，也即虾壳粉溶液的浓度。为验证本方案具有良好的酶解效果，如实施例3进行酶解实验，实际测得的酶解液水解度达到16.33％，钙结合量平均值为1.954mg/ml。可见本方法具有良好的酶解效果，酶解过程简单可控，环境危害和职业暴露危险比较小，可以在企业生产中进行推广使用。以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。当前第1页12