一种竹荪孢子中活性成分连续制备工艺的制作方法

本发明属于农业加工领域，具体涉及一种竹荪孢子精深加工方法。

背景技术：

竹荪是一种大型名贵的食用菌，被历代医药学家誉为“菌中皇后”，具有提高人体免疫力的功能。相关研究表明竹荪含有丰富的氨基酸，其中包括人体必须的8种氨基酸及13种非必需氨基酸，是食用菌中含氨基酸种类最多的一种。此外，竹荪中的有效成分，如竹荪三萜、竹荪多糖，有降低血压和体内胆固醇的作用，在抗肿瘤、抗凝血、抗炎症、降血糖方面都有一定的疗效。竹荪孢子粘附于竹荪菌盖上，就整个竹荪子实体而言，竹荪孢子占干重的9~13%，相当于每生产3kg的商品干竹荪就会产生1kg的干竹荪孢子。根据相关报道，竹荪孢子含有丰富的不饱和脂肪酸和维生素等营养成分，且相关研究发现其有机溶剂提取物具有非常好的抗氧化和抗菌作用。但是，在竹荪的采摘过程中，竹荪孢子一般都是和菌盖一起被直接废弃掉，造成巨大的资源浪费；同时引起环境污染，造成连作障碍。因此，本发明提供一种竹荪孢子的精深加工工艺方法，以提取孢子多糖为主要路线，能够连续提取获得竹荪孢子多肽、竹荪孢子多糖、黄酮三萜等活性物质。

技术实现要素：

本发明的目的在于一种竹荪孢子多糖、多肽、黄酮等活性成分连续制备工艺。几乎所有多糖提取工艺均有脱脂、提取、醇沉、除蛋白这4个关键环节，但多糖提取工艺中，提取目标仅为多糖，除掉的蛋白及醇沉过后乙醇相中的成分均未获得利用。本发明发现竹荪孢子除含有活性多糖外，还含有大量的蛋白，其有机溶剂提取物具有较强的抗氧化活性。因此本发明设计一套提取工艺路线，可以对竹荪孢子连续提取，依次可以获得多肽、多糖、小分子活性物质等多个有价值的成分，达到充分利用竹荪孢子的目的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术路线：

一种竹荪孢子中活性成分连续制备工艺，以竹荪孢子多糖为主要工艺路线，将一般多糖提取过程去脂、除蛋白环节设计为黄酮等活性成分提取及多肽等营养成分收集。

具体包括以下步骤：

（1）将竹荪孢子水洗，喷雾干燥后，采用超微粉碎至粒径为1000~100纳米，将破壁竹荪孢子粉加入软水后，调节ph7-9，超声提取，超声功率300-1000w，提取温度50-70℃，超声时间20-90min，然后3000r/min离心，获得上清液为竹荪孢子多糖蛋白溶液，沉淀为孢子残渣低温保存另用；

（2）竹荪孢子多糖蛋白溶液加入低浓度盐酸，调整ph至4.3，搅拌后静置使蛋白沉淀，5000r/min离心，上清液为竹荪孢子多糖溶液，沉淀即为竹荪孢子蛋白，按此方法竹荪孢子蛋白得率为38%-55%；

（3）将竹荪孢子蛋白加水溶解后，调节ph7.5，加入竹荪孢子蛋白重量1.50%水解酶，保持温度45℃酶解4.0h，酶解后获得蛋白分子量为5.8~30kda的竹荪孢子多肽；

（4）竹荪孢子多糖溶液加碱调节ph7.5，60℃真空浓缩至原体积20%，加入4倍体积无水乙醇，充分搅拌后静置12h，5000r/min离心，沉淀即为竹荪孢子多糖，多糖得率为8%-11%，乙醇上清液备用；

（5）将步骤（4）的乙醇上清液45℃真空浓缩至原体积10%，获得浸膏ⅰ，得率0.4-0.7%；

（6）回收步骤（5）乙醇，按30:1ml/g加入步骤（1）的孢子残渣，超声提取，超声功率500w，45℃下提取60min，然后3000r/min离心，将乙醇上清液45℃真空浓缩至原体积10%，获得浸膏ⅱ，得率2.1-3.4%；

（7）将浸膏ⅰ和浸膏ⅱ合并，依次用氯仿、乙酸乙酯、甲醇在常温下浸提，回收有机溶剂后分别获得甾醇得率0.3-0.5%、三萜得率0.4-0.7%、黄酮得率0.6-1.1%活性小分子物质。

步骤（1）中破壁竹荪孢子粉和软水的料液比为1:10~1:100kg/l。

步骤（3）中水解酶为胃蛋白酶、蜗牛酶或木瓜蛋白酶。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明从竹荪孢子提取获得多糖、多肽、小分子活性化合物等；竹荪孢子至今未被开发利用，作为竹荪采收过程的副产物，以竹荪孢子为原料提取获得多糖等活性成分，具有成本低的优势，是一种资源的高效利用。

（2）几乎所有多糖提取工艺均有脱脂、提取、醇沉、除蛋白这4个关键环节，但多糖提取工艺中，提取目标仅为多糖，除掉的蛋白及醇沉过后乙醇相中的成分均未获得利用。本发明发现竹荪孢子除含有活性多糖外，还含有大量的蛋白，且其有机溶剂提取物具有较强的抗氧化、抗菌活性。因此本发明在多糖提取工艺的基础上进行优化，将除蛋白环节设计为第一步提取获得蛋白；脱脂环节设计为利用醇沉后回收的乙醇再次提取；同时针对醇沉这个步骤中，乙醇除了可以沉淀多糖，还会萃取溶液中的小分子类活性物质，因此对乙醇相进行进一步的分离提取获得不同种类的活性成分。

（3）本工艺的特别之处在于是多种成分的连续提取，即通过设计工艺路线，可连续从竹荪孢子中获得多种有效成分，极大的提高竹荪孢子的附加值。

本工艺的一个创新点就是利用提取多糖时必须用到的乙醇沉淀这个步骤，在孢子提取液中加入乙醇沉淀获得多糖后，上清液相当于对孢子提取液中的黄酮等小分子成分进行了提取。同时，将提取孢子多糖后的孢子残渣再加入回收的乙醇进行浸提，保证孢子中的小分子活性成分充分得的提取。这设计的意义在于只用一份乙醇，可以沉淀多糖，提取多糖溶液中的成分，回收乙醇后（回收乙醇的体积浓度约为70-80%，本发明研究表明该乙醇浓度下对孢子活性成分的提取效率最高）再对孢子渣进行提取。

如果第一步设计为提取黄酮，会使得整个工艺的效率没有原来的高（图2）。因为第一步采用乙醇提取后，孢子中约70-80%的小分子类有效成分已经被提取，随后在乙醇沉淀这个步骤中，上清液中的活性成分就极少，使得利用上清液意义不大。而且第一步用乙醇提取后，还需要离心获得孢子才能进行下一步多糖提取，等于多了一道程序；并且回收的乙醇由于体积浓度已经降低为70-80%，不能用于沉淀多糖，使得沉淀多糖需要用新的乙醇。（本发明研究发现沉淀多糖时使用体积浓度95%乙醇或无水乙醇可将绝大部分多糖沉淀下来）。

附图说明

图1为本发明的竹荪孢子中活性成分连续制备工艺的流程图；

图2为第一步设计为提取黄酮时的工艺流程图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。

实施例1

一种竹荪孢子多糖、多肽、黄酮等活性成分连续制备工艺，具体包括以下步骤：

（1）将竹荪孢子水洗，喷雾干燥后，采用超微粉碎至粒径为1000~100纳米，将1kg破壁竹荪孢子粉，加50l软水后，用氢氧化钠溶液调节ph至8，超声提取，超声功率500w，提取温度60℃，超声时间60min，然后3000r/min离心，获得上清液为竹荪孢子多糖蛋白溶液，沉淀为孢子残渣低温保存另用；

（2）竹荪孢子多糖蛋白溶液加入低浓度盐酸，调整ph至4.3，搅拌后静置使蛋白沉淀，5000r/min离心，上清液为竹荪孢子多糖溶液，沉淀即为竹荪孢子蛋白，按此方法竹荪孢子蛋白得率为55%；

（3）将竹荪孢子蛋白加水溶解后，调节ph7.5，加入竹荪孢子蛋白重量1.50%木瓜蛋白酶，保持温度45℃酶解4.0h，酶解后获得主要蛋白分子量为5.8~30kda的竹荪孢子多肽；

（4）竹荪孢子多糖溶液加碱调节ph7.5，60℃真空浓缩至原体积20%，加入4倍体积无水乙醇，充分搅拌后静置12h，5000r/min离心，沉淀即为竹荪孢子多糖，多糖得率为11%，乙醇上清液备用；

（5）将步骤（4）的乙醇上清液45℃真空浓缩至原体积10%，获得浸膏ⅰ，得率0.7%；

（6）回收步骤（5）乙醇，按30:1ml/g加入步骤（1）的孢子残渣，超声提取，超声功率500w，45℃下提取60min，然后3000r/min离心，将乙醇上清液45℃真空浓缩至原体积10%，获得浸膏ⅱ，得率3.4%；

（7）将浸膏ⅰ和浸膏ⅱ合并，依次用氯仿、乙酸乙酯、甲醇在常温下浸提，回收有机溶剂后分别获得甾醇0.5%、三萜0.7%、黄酮1.1%活性小分子物质。

实施例2

一种竹荪孢子多糖、多肽、黄酮等活性成分连续制备工艺，具体包括以下步骤：

（1）将竹荪孢子水洗，喷雾干燥后，采用超微粉碎至粒径为1000~100纳米，将1kg破壁竹荪孢子粉，加10l软水后，用氢氧化钠溶液调节ph至7，超声提取，超声功率300w，提取温度50℃，超声时间20min，然后3000r/min离心，获得上清液为竹荪孢子多糖蛋白溶液，沉淀为孢子残渣低温保存另用；

（2）竹荪孢子多糖蛋白溶液加入低浓度盐酸，调整ph至4.3，搅拌后静置使蛋白沉淀，5000r/min离心，上清液为竹荪孢子多糖溶液，沉淀即为竹荪孢子蛋白，按此方法竹荪孢子蛋白得率为38%；

（3）将竹荪孢子蛋白加水溶解后，调节ph7.5，加入竹荪孢子蛋白重量1.50%胃蛋白酶，保持温度45℃酶解4.0h，酶解后获得主要蛋白分子量为5.8~30kda的竹荪孢子多肽；

（4）竹荪孢子多糖溶液加碱调节ph7.5，60℃真空浓缩至原体积20%，加入4倍体积无水乙醇，充分搅拌后静置12h，5000r/min离心，沉淀即为竹荪孢子多糖，多糖得率为9%，乙醇上清液备用；

（5）将步骤（4）的乙醇上清液45℃真空浓缩至原体积10%，获得浸膏ⅰ，得率0.4%；

（6）回收步骤（5）乙醇，按30:1ml/g加入步骤（1）的孢子残渣，超声提取，超声功率500w，45℃下提取60min，然后3000r/min离心，将乙醇上清液45℃真空浓缩至原体积10%，获得浸膏ⅱ，得率2.1%；

（7）将浸膏ⅰ和浸膏ⅱ合并，依次用氯仿、乙酸乙酯、甲醇在常温下浸提，回收有机溶剂后分别获得甾醇得率0.3%、三萜得率0.5%、黄酮得率0.9%活性小分子物质。

实施例3

一种竹荪孢子多糖、多肽、黄酮等活性成分连续制备工艺，具体包括以下步骤：

（1）将竹荪孢子水洗，喷雾干燥后，采用超微粉碎至粒径为1000~100纳米，将1kg破壁竹荪孢子粉，加100l软水后，用氢氧化钠溶液调节ph至9，超声提取，超声功率1000w，提取温度70℃，超声时间90min，然后3000r/min离心，获得上清液为竹荪孢子多糖蛋白溶液，沉淀为孢子残渣低温保存另用；

（2）竹荪孢子多糖蛋白溶液加入低浓度盐酸，调整ph至4.3，搅拌后静置使蛋白沉淀，5000r/min离心，上清液为竹荪孢子多糖溶液，沉淀即为竹荪孢子蛋白，按此方法竹荪孢子蛋白得率为47%；

（3）将竹荪孢子蛋白加水溶解后，调节ph7.5，加入竹荪孢子蛋白重量1.50%蜗牛酶，保持温度45℃酶解4.0h，酶解后获得主要蛋白分子量为5.8~30kda的竹荪孢子多肽；

（4）竹荪孢子多糖溶液加碱调节ph7.5，60℃真空浓缩至原体积20%，加入4倍体积无水乙醇，充分搅拌后静置12h，5000r/min离心，沉淀即为竹荪孢子多糖，多糖得率为8%，乙醇上清液备用；

（5）将步骤（4）的乙醇上清液45℃真空浓缩至原体积10%，获得浸膏ⅰ，得率0.5%；

（6）回收步骤（5）乙醇，按30:1ml/g加入步骤（1）的孢子残渣，超声提取，超声功率500w，45℃下提取60min，然后3000r/min离心，将乙醇上清液45℃真空浓缩至原体积10%，获得浸膏ⅱ，得率2.3%；

（7）将浸膏ⅰ和浸膏ⅱ合并，依次用氯仿、乙酸乙酯、甲醇在常温下浸提，回收有机溶剂后分别获得甾醇得率0.4%、三萜得率0.6%、黄酮得率0.8%活性小分子物质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。