本发明属于天然产物的提取分离方法，具体涉及灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸活性成分的同步提取分离纯化方法。
背景技术：
灵芝(ganodermalucidum(leyssexfr.)krast.)属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌。传统中医认为，灵芝味甘、性温、无毒，具有滋补强身、扶正固本之功效，作为我国中草药珍品，素有“仙草”之誉，具有独特、优异的生理效能。东汉时期的《神农本草经》、明代著名医药学家李时珍的《本草纲目》，即对灵芝的功效有详细的极为肯定的记载。现代研究表明，灵芝药理成分非常丰富，其中有效成份达10大类，包括灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、氨基酸、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)，以及多种微量元素如ge、p、fe、ca、mn和zn等。灵芝能够调节和增强人体免疫力，降血脂血糖、保肝，抑制肥胖和动脉硬化，阻止胆固醇吸收；对神经衰弱、冠心病、高血压、慢性支气管炎、糖尿病和肿瘤等有良好的预防和治疗作用。最新研究还表明：灵芝还具有抗疲劳、美容养颜、延缓衰老、防治艾滋病等功效。目前，灵芝已作为药物正式被国家药典收载，同时它又是国家批准的新资源食品，可以药食两用。
现代医学证明：灵芝多糖能够调节和增强人体免疫力，从而用于肿瘤、糖尿病、艾滋病等重大疾病的预防和防治；如bao-meishao等报道了灵芝多糖的免疫活性(immunereceptorsforpolysaccharidesfromganodermalucidum,biochemicalandbiophysicalresearchcommunication323(2004)133-141)，以及chenxp等揭露了灵芝多糖对自由基的清除作用和对宫颈癌小鼠体内抗氧化酶、免疫活性的影响(freeradicalscavengingofganodermalucidumpolysaccharidesanditseffectonantioxidantenzymesandimmunityactivitiesincervicalcarcinomarats，carbohydratepolymers,2009,77(2),399)。经查阅文献，活性研究基本使用高纯度的灵芝多糖；灵芝三萜酸类化合物是近年来发现的除灵芝多糖外的另一类具有明显药理活性的化合物，自1982年kubota等首次从赤芝子实体中分离得到三萜类化合物灵芝酸a和b以来，灵芝酸的研究备受关注，到目前为止，已先后从灵芝子实体中分离得到100多种三萜酸类化合物。灵芝酸一般分布在子实体的外周部位，而且随子实体成熟度的提高而递增，该类物质具有保肝、抗肿瘤、降血糖、抑制组胺释放等功能(enhancementofil-2andifn-gexpressionandnkcellsactivityinvolvedintheantitumoreffectofganodericacidmeinvivo.internationalimmunopharmacology，2007，7(6)：864-870；structure-activityrelationshipforinhibitionof5a-reductasebytriterpenoidsisolatedfromganodermalucidum.bioorganic&medicinalchemistry，2006,14(24)：8654-8660)；此外，灵芝还是氨基酸的“贮存库”，有17中氨基酸，其中有7种是人体内必须的氨基酸，氨基酸占灵芝的10％以上，总的氨基酸中游离态氨基酸占30％-35％，其余的多数和多糖结合成糖肽链，而且这些氨基酸容易被人体吸收，所以常作为保健品使用，受到人们的青睐。综上所述，目前对灵芝活性成分的药理研究已很明确，在临床或保健需求量大，随着人们对医疗保健水平要求的提高，对药用物质基础的明确化要求更高，所以对灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的提取纯化并作为原料药用于药品、保健品等方法具有重要的意义。
目前对于灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸单独纯化的报道很多，但普遍存在工艺复杂，收率不高，不能综合利用，造成了资源浪费；另外，由于灵芝内活性组分的理化性质差别较大，一般的提取方法都是双溶剂二次提取才能充分的提取灵芝活性成分，大大增加了生产成本，而且有些有效组分分布在细胞壁内，不经过物理或化学方法破壁很难将活性组分提取出来，给提取工艺带来了一定的困难，传统的工艺如超微粉碎、高压爆破等物理处理方法虽然能达到破壁的效果，但是成本高，后续工艺处理较为麻烦，从而不能得到广泛应用，如申请号为200810151025.6，名称为“利用超高压提取灵芝子实体多糖的方法”，采用了超高压提取方法提取灵芝多糖，该提取方法成本较高、存在安全隐患，不利于生产推广，而且在超高压环境下可能会导致活性成分结构发生变化，由于没有后续纯化处理工艺，只能得到粗多糖；如公开号为cn1560072a，名称为“一种从灵芝中制备灵芝三萜酸和灵芝多糖的方法”，该方法采用超临界萃取技术进行活性成分提取，该技术成本高，不易于生产推广，而且缺少后续纯化工艺，得到的灵芝三萜酸含量(60.2％)及灵芝多糖含量(36％)均较低。另外，目前针对于灵芝活性成分的提取纯化方法，尚未将灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸进行同时提取的研究，如何能够实现这三种有效成分的同时提取，节约提取纯化程序，有待进一步的研究开展。
因此，急需提供一种能够同步提取纯化灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸活性成分的方法，并大大提高上述三种活性成分的纯度，提高其得率。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，大大提高活性成分的纯度，并简化纯化工序，降低成本，提高灵芝产品的效益。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为，一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)将灵芝子实体粉碎后过筛，加入碱液及还原剂于0—5℃进行超声提取，对提取液离心得离心液和药渣；所述还原剂包括硼氢化钠、亚硫酸氢钠或亚硫酸钠中的一种，还原剂与灵芝子实体的重量比为1:20，所述碱液的浓度为0.3-1mol/l；
(2)将步骤(1)所得离心液调ph值至2-4，放置8-16小时，离心，分别收集离心清液和沉淀；
(3)氨基酸和灵芝多糖的提取纯化：
(a)将步骤(2)中的离心清液通过陶瓷微滤膜过滤，收集过滤液及未透过液；
(b)将步骤a中的过滤液通过阳离子交换树脂吸附，依次用纯化水、碱液洗脱，以茚三酮显色反应检测氨基酸，收集碱液洗脱过程中呈阳性反应的洗脱液，洗脱液调ph至4-7，加热沸腾2小时，冷却，放置8-16小时，过滤，将滤液减压浓缩，浓缩物真空干燥，打粉混匀，即得棕色粉末氨基酸；
(c)将步骤a中的未透过液加入无水乙醇至含醇量为5-30％，醇沉，离心，收集离心液，再加入无水乙醇至含醇量50-95％，醇沉，离心，收集沉淀；
(d)将步骤c中的沉淀使用有机试剂法除蛋白，减压回收残留有机试剂，浓缩液通过阴离子交换树脂吸附，依次使用纯化水、盐溶液洗脱，以硫酸-蒽酮法检测多糖，收集呈阳性反应的洗脱液；
(e)将步骤d中的洗脱液合并，超滤纯化，收集未透过液，将未透过液进行低温真空干燥，即得类白色海绵状干燥物灵芝多糖；
(4)将步骤(2)中的沉淀用碱液溶解，调ph至6-8，上阴离子交换树脂，使用弱碱乙醇液洗脱，收集醋酐-浓硫酸显色成阳性的洗脱液，洗脱液调ph至2-6，减压回收溶剂，真空干燥，呈浅黄色固体，使用乙醇加热溶解，冷却重结晶，得白色针状结晶，真空干燥，即得灵芝总三萜酸。
上述方法中，所得棕色粉末为氨基酸含量60％以上的原料，类白色海绵状干燥物为灵芝多糖含量90％以上的原料，白色结晶颗粒为灵芝总三萜酸含量92％以上的原料。
本发明的上述提取纯化方法，和传统工艺相比，本发明采用低温碱液超声提取，达到了优良的提取效果，同时结合抗氧剂对易氧化活性成分起到了保护作用，将灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸肽类化合物同时提取出来，然后使用陶瓷膜微滤技术，直接将小分子活性成分与大分子活性成分分离开来，更适合于生产应用。另一方面，本发明采用离子交换树脂对活性成分进行纯化，使灵芝三萜酸、氨基酸类化合物在离子状态下的离子交换吸附是定向吸附，去除了多余的成分，使灵芝多糖脱去了蛋白和色素，结晶及超滤在灵芝三萜酸和灵芝多糖纯化工艺的应用，大大的提高活性成分的纯度，制备的灵芝多糖纯度在90％以上、灵芝总三萜酸纯度在92％以上及氨基酸含量在60％以上，充分利用了灵芝资源，而且本发明中所有的纯化工序简单、容易操作、成本低廉，容易在生产中广泛使用。
进一步的是，步骤(1)中所述碱液包括氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液。
进一步的是，步骤(1)中所述灵芝子实体经粉碎后过100目筛网。
进一步的是，步骤a中所述陶瓷微滤膜的孔径为0.22um或0.45um或0.8um。
进一步的是，步骤b中所述阳离子交换树脂为732型阳离子交换树脂或d001型阳离子交换树脂，所述碱液为0-1mol/l氨水或0-1mol/l氢氧化钠水溶液，调ph采用的酸液为0-5mol/l盐酸水溶液或0-5mol/l硫酸水溶液。
进一步的是，步骤d中除蛋白采用的有机试剂为乙醚或石油醚。
进一步的是，步骤d中所述阴离子交换树脂为717型阴离子交换树脂或deae纤维素阴离子交换树脂。
进一步的是，步骤d中所述盐溶液为0-1mol/l氯化钠溶液。
进一步的是，步骤(4)中所述阴离子交换树脂为d311型弱碱性阴离子交换树脂或d941型弱碱性阴离子交换树脂。
进一步的是，步骤(4)中所述弱碱乙醇液中弱碱的质量浓度为1-10％，所述弱碱为naoh或na2co3或nahco3，所述弱碱与乙醇的体积比为1：1-5。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明采用的方法可以同时从灵芝子实体中提取纯化得到灵芝多糖含量在90％以上、灵芝三萜酸含量在92％以上以及氨基酸含量在60％以上的三种活性成分，三种物质的提取纯化在一次生产过程中即可完整进行，且生产设备简单，工艺路线易操作，生产成本低，生产效率高，可进行工业化生产。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，按照如下步骤进行：
a、取灵芝子实体，粉碎过100目筛，称取1kg，加入15l0.3mol/l氢氧化钠水溶液，同时加入50g硼氢化钠，于0-5℃超声提取3小时，然后以8000r/min离心，得离心液；使用1mol/l盐酸调ph为3.5，放置过夜(12h)，8000r/min下离心，分别收集离心清液和沉淀，备用；
b、取离心清液，通过0.45um陶瓷膜微滤，待浓缩液至1l时，加入等体积的纯化水，继续微滤，重复微滤一次，分别收集过滤液和未透过浓缩液；将过滤液通过732型阳离子交换树脂吸附，依次使用纯化水、0.5mol/l氨水洗脱，收集氨水洗脱过程中茚三酮检测呈阳性反应的洗脱液，然后使用1mol/l盐酸调ph至4.8，加热沸腾2小时，冷却，放置过夜(12h)，过滤，将滤液于60℃减压浓缩至150ml，水浴蒸干，60℃真空干燥，取出打粉混匀，即得棕色粉末，检测氨基酸含量为63.5％；将微滤未透过液加入等体积的纯化水稀释，搅拌加入无水乙醇至含醇量15％，放置过夜(12h)，8000r/min离心，收集离心清液，继续加入无水乙醇至含醇量为85％，放置过夜，8000r/min离心，收集沉淀，然后加入500ml纯化水使溶解，加入200ml乙醚除蛋白，分液漏斗分离下层水层及有机相，有机相回收溶剂，水层重复除蛋白一次，过滤，减压回收溶剂至100ml，上deae-纤维素阴离子交换树脂吸附，先用纯化水洗涤树脂柱，然后使用0.1mol/l氯化钠溶液洗脱，收集硫酸-蒽酮试剂检测呈阳性反应的洗脱液，合并洗脱液，通过10kd超滤膜去除小分子物质，收集为透过液，将未透过液低温真空干燥，即得灵芝多糖，检测多糖含量为91.1％。
c、将a中离心后沉淀用1％氢氧化钠溶液溶解，并加该碱液至ph为7.4，所得溶液通过d311型阴离子交换树脂吸附，先用纯化水洗涤树脂柱，再用3％氢氧化钠乙醇溶液(体积比1：1)洗脱，收集醋酐-浓硫酸试剂显色呈阳性的洗脱液，然后用1mol/l盐酸调ph至4.2，减压回收溶剂，水浴蒸干，真空干燥，得浅黄色固体，加入15倍量无水乙醇加热溶解完全，冷却，结晶，过滤，得白色针状晶体，真空干燥，即得白色粉末状固体，检测灵芝总三萜酸含量为93.6％。
本发明实施例中涉及的检测方法如下：
氨基酸使用紫外可见分光光度法测定含量，u-2000型紫外可见分光光度计，显色剂为茚三酮试剂，对照品为精氨酸，检测波长为576nm；灵芝多糖含量测定使用紫外可见分光度法，u-2000型紫外可见分光光度计，硫酸蒽酮溶液为显色剂，检测波长为625nm，对照品为葡萄糖；灵芝总三萜酸含量测定紫外分光光度法，u-2000型紫外可见分光光度计，对照品为灵芝酸b，检测波长为526nm。
实施例2
一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，按照如下步骤进行：
a、取灵芝子实体，粉碎过100目筛，称取1kg，加入15l0.5mol/l碳酸钠水溶液，同时加入50g硼氢化钠，0-5℃超声提取3小时，8000r/min离心，得离心液；使用1mol/l盐酸调ph为3.1，放置过夜(8h)，8000r/min离心，分别收集离心清液和沉淀，备用；
b、取离心清液，通过0.22um陶瓷膜微滤，待浓缩液至1l时，加入等体积的纯化水，继续微滤，重复微滤一次，分别收集过滤液和未透过浓缩液；将过滤液通过d001型阳离子交换树脂吸附，依次使用纯化水、0.5mol/l氢氧化钠溶液洗脱，收集碱液洗脱过程中茚三酮检测呈阳性反应的洗脱液，然后使用1mol/l盐酸调ph至4.8，过滤，将滤液60℃减压浓缩至150ml，水浴蒸干，60℃真空干燥，取出打粉混匀，即得棕色粉末，检测氨基酸含量为61.2％；将微滤未透过液加入等体积的纯化水稀释，搅拌加入无水乙醇至含醇量20％，放置过夜，8000r/min离心，收集离心清液，继续加入无水乙醇至含醇量为90％，放置过夜(8h)，8000r/min离心，收集沉淀，然后加入500ml纯化水使溶解，加入200ml乙醚除蛋白，分液漏斗分离下层水层及有机相，有机相回收溶剂，水层重复除蛋白一次，过滤，减压回收溶剂至100ml，上deae-纤维素阴离子交换树脂吸附，先用纯化水洗涤树脂柱，然后使用0.3mol/l氯化钠溶液洗脱，收集硫酸-蒽酮试剂检测呈阳性反应的洗脱液，合并洗脱液，通过10kd超滤膜去除小分子物质，收集为透过液，将未透过液低温真空干燥，即得灵芝多糖，检测多糖含量为90.3％。
c、将a中离心后沉淀用1％氢氧化钠溶液溶解，并加该碱液至ph为6.2，所得溶液通过d941型阴离子交换树脂吸附，先用纯化水洗涤树脂柱，再用8％碳酸钠乙醇溶液(体积比1：1)洗脱，收集醋酐-浓硫酸试剂显色呈阳性的洗脱液，然后用1mol/l盐酸调ph至4.2，减压回收溶剂，水浴蒸干，真空干燥，得浅黄色固体，加入15倍量无水乙醇加热溶解完全，冷却，结晶，过滤，得白色针状晶体，真空干燥，即得白色粉末状固体，检测灵芝总三萜酸含量为94.3％。
活性成分的检测方法同实施例1。
实施例3
一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，按照如下步骤进行：
a、取灵芝子实体，粉碎过150目筛，称取1kg，加入15l1mol/l碳酸氢钠水溶液，同时加入50g亚硫酸钠，0-5℃超声提取3小时，8000r/min离心，得离心液；使用1mol/l盐酸调ph为3.8，放置过夜(10h)，8000r/min离心，分别收集离心清液和沉淀，备用；
b、取离心清液，通过0.8um陶瓷膜微滤，待浓缩液至1l时，加入等体积的纯化水，继续微滤，重复微滤一次，分别收集过滤液和未透过浓缩液；将过滤液通过d001型阳离子交换树脂吸附，依次使用纯化水、0.8mol/l氢氧化钠溶液洗脱，收集碱液洗脱过程中茚三酮检测呈阳性反应的洗脱液，然后使用1mol/l盐酸调ph至5.7，过滤，将滤液60℃减压浓缩至150ml，水浴蒸干，60℃真空干燥，取出打粉混匀，即得棕色粉末，检测氨基酸含量为67.2％；将微滤未透过液加入等体积的纯化水稀释，搅拌加入无水乙醇至含醇量10％，放置过夜(10h)，8000r/min离心，收集离心清液，继续加入无水乙醇至含醇量为90％，放置过夜，8000r/min离心，收集沉淀，然后加入500ml纯化水使溶解，加入200ml石油醚除蛋白，分液漏斗分离下层水层及有机相，有机相回收溶剂，水层重复除蛋白一次，过滤，减压回收溶剂至100ml，上711型阴离子交换树脂吸附，先用纯化水洗涤树脂柱，然后使用0.8mol/l氯化钠溶液洗脱，收集硫酸-蒽酮试剂检测呈阳性反应的洗脱液，合并洗脱液，通过10kd超滤膜去除小分子物质，收集为透过液，将未透过液低温真空干燥，即得灵芝多糖，检测多糖含量为93.7％。
c、将a中离心后沉淀用1％氢氧化钠溶液溶解，并加该碱液至ph为7.8，所得溶液通过d941型阴离子交换树脂吸附，先用纯化水洗涤树脂柱，再用10％碳酸氢钠乙醇溶液(体积比1：2)洗脱，收集醋酐-浓硫酸试剂显色呈阳性的洗脱液，然后用1mol/l盐酸调ph至4.2，减压回收溶剂，水浴蒸干，真空干燥，得浅黄色固体，加入15倍量无水乙醇加热溶解完全，冷却，结晶，过滤，得白色针状晶体，真空干燥，即得白色粉末状固体，检测灵芝总三萜酸含量为92.9％。
活性成分的检测方法同实施例1。
对比例1
按照实施例1的方法，在步骤a中不添加碱液和还原剂，直接在低温下进行超声提取，最终所得氨基酸含量为52.6％，灵芝多糖含量为83.5％，灵芝总三萜酸含量为84.3％。
对比例2
按照实施例2的方法，在步骤a中不添加碱液，直接在常温下加入还原剂进行超声提取，最终所得氨基酸含量为55.8％，灵芝多糖含量为84.3％，灵芝总三萜酸含量为86.1％。
对比例3
按照实施例3的方法，在步骤a中加入碱液及还原剂于常温下进行超声提取，步骤b中采用001×7型阳离子交换树脂对过滤液进行吸附，步骤c中采用ab-8大孔吸附树脂进行吸附提取灵芝总三萜酸，最终所得氨基酸含量为57.4％，灵芝多糖含量为85.1％，灵芝总三萜酸含量为88.3％。