CD47单域抗体及其用途的制作方法

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种针对整合素相关蛋白(cd47)分子胞外段的阻断型单域抗体及其衍生蛋白。还公开了其编码序列、相关制备方法及其用途，特别是在治疗和/或预防、或诊断cd47相关疾病例如肿瘤中的用途。

背景技术：

近年来，抗体药物以其独有的优势成为21世纪全球生物医药领域的研究热点，越来越多的抗体药物进入了临床实践。通过使用抗cd47抗体阻断cd47和sirpa的相互作用具有靶向性治疗的效果。目前处于phasei的三个药物分别为fortyseven的hu5f9-g4、celgene的cc-90002以及trillium的tti-621。trillium的cd47抗体项目为sirpa-fc融合蛋白，与hu5f9-g4具有相类似的cd47亲和力(nm级别)。而sirpa-fc分子量更小约80kda，相对于抗体分子的150kda具有更好的穿透性和组织分布性；sirpa-fc对于红细胞的亲和力要远远低于hu5f9-g4，表明其可能具有更好的安全性。

然而，传统单克隆抗体分子量较大、难以渗透进入组织间，并且单抗的生产周期长、人源化较为困难，因此，寻找具有更小分子量的抗体尤为重要。除抗原结合片段(fab)、单链抗体(scfv)等基于传统单抗进行改造的小分子抗体外，在自然界骆驼科与鲨鱼科的体内存在一种天然的目前发现的最小抗原结合片段。这种抗体在1989年由布鲁塞尔自由大学muyldermans等发现，他们在分离检测骆驼血清中的抗体时首次发现了一种重链抗体，该抗体缺失了两条轻链cl和恒定区ch1，仅由n端可变区(vhh)，铰链区和两个恒定区(ch1、ch2)构成，其可变区(vhh)即称为单域抗体(nanobody)。单域抗体分子量仅有约15kda，其纳米级的分子大小和独特的结构赋予它优于传统抗体的多种特性，如稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等。单域抗体因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体和小分子药物的优势，几乎完美地克服了传统抗体的开发周期长，稳定性低，保存条件苛刻等缺陷。这种分子量仅为常规抗体1/10的单域抗体逐渐成为新一代抗体诊断及治疗中的新兴力量。因此应用单域抗体技术研发cd47治疗性抗体药物具有广阔的前景。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种针对cd47胞外段的单域抗体，该单域抗体能够有效阻断cd47与其配体sirpa的相互作用，并且该抗体不会引起人红细胞凝集。本发明同时提供该单域抗体及其衍生物的编码序列、制备方法、及在诊断治疗中的用途。

为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种抗cd47单域抗体vhh链的互补决定区cdr区，所述vhh链的互补决定区cdr由seqidno.:5所示的cdr1,seqidno.:6所示的cdr2，seqidno.:7所示的cdr3组成。

在另一优选例中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh链的框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。

本发明第二方面，提供了一种抗cd47单域抗体的vhh链，所述vhh链包括框架区fr和本发明第一方面所述的互补决定区cdr，所述的框架区fr由

(a)seqidno.:1所示的fr1，seqidno.:2所示的fr2，seqidno.:3所示的fr3，seqidno.:4所示的fr4组成；或

(b)seqidno.:10所示的fr1，seqidno.:11所示的fr2，seqidno.:12所示的fr3，seqidno.:13所示的fr4组成。

在另一优选例中，所述的抗cd47单域抗体的vhh链如seqidno.:8或14所示。

本发明第三方面，提供了一种抗cd47单域抗体，它是针对cd47表位的单域抗体，并且具有如seqidno.:8或seqidno.:14中所示的氨基酸序列的vhh链。

本发明第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的抗cd47单域抗体vhh链的cdr区、本发明第二方面所述的抗cd47单域抗体的vhh链、或本发明第三方面所述的抗cd47单域抗体。

在另一优选例中，所述多核苷酸具有如seqidno.:9或15所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸包括dna或rna。

本发明第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第四方面所述的多核苷酸。

本发明第六方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第五方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞。

本发明七方面，提供了一种产生抗cd47单域抗体的方法，包括步骤：

(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗cd47单域抗体的培养物；以及

(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗cd47单域抗体。

在另一优选例中，所述的抗cd47单域抗体具有如seqidno.:8或14所示的氨基酸序列。

本发明第八方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)如本发明第二方面所述的抗cd47单域抗体的vhh链、或如本发明第三方面所述的抗cd47单域抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。

在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第二方面所述的抗cd47单域抗体的vhh链、如本发明第三方面所述的抗cd47单域抗体。

在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第二方面所述的抗cd47单域抗体的vhh链、本发明第三方面所述的抗cd47单域抗体。

本发明第九方面，提供了本发明第三方面所述的抗cd47单域抗体的用途，用于制备(a)用于检测cd47分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。

本发明第十方面，提供了一种药物组合物，含有：

(i)本发明第一方面抗cd47单域抗体vhh链的互补决定区cdr、本发明第二方面所述的抗cd47单域抗体的vhh链、或如本发明第三方面所述的抗cd47单域抗体、或本发明第八方面所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

本发明第十一方面，提供了本发明第三方面所述抗cd47单域抗体的一种或多种的用途：

(i)用于检测人cd47分子；

(ii)用于流式检测；

(iii)用于细胞免疫荧光检测；

(iv)用于治疗肿瘤；

(v)用于肿瘤诊断。

在另一优选例中，所述用途为诊断性和/或非诊断性的，和/或

治疗性和/或非治疗性的。

本发明第十二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第二方面所述的重链可变区vhh的序列或如本发明第三方面所述的单域抗体的序列；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6his标签和ha标签在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于cd47蛋白。

本发明第十三方面，提供了如本发明第二方面所述的vhh链、如本发明第三方面所述的单域抗体、或本发明第八方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中cd47蛋白；

其中，所述药剂用于治疗或预防表达cd47蛋白(即cd47阳性)的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括：黑色素瘤、胃癌、淋巴瘤、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。

本发明第十四方面，提供了一种检测样品中cd47蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明第三方面所述的单域抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在cd47蛋白。

本发明第十五方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用本发明第三方面所述的单域抗体或本发明第八方面所述的免疫偶联物。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

本发明第十六方面，提供了一种抗cd47单域抗体vhh链的框架区fr，所述的vhh链的框架区fr由seqidno.:1所示的fr1，seqidno.:2所示的fr2，seqidno.:3所示的fr3，seqidno.:4所示的fr4组成。3

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是抗原蛋白及单域抗体纯化sds-page图，图中a为核酸分子标准，b为纯化的hcd47(ecd)-fc蛋白，该蛋白由hek293f细胞表达，纯度达到90％以上。

图2是构建文库的库容检测图，构建好的文库被梯度稀释后涂板，图中显示取1/5梯度稀释10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍的克隆数目，通过计算单克隆数确定文库大小，计算该文库的库容为2.5x10⁹cfu。

图3是构建文库的插入率检测图，展示的是构建的单域抗体文库的插入率检测结果。从左到右凝胶孔的dna条带分别是：第一道为dna分子标记，其余孔道为检测插入片段的pcr产物，pcr产物带约为500bp；经检测，该文库的插入率达到100％。

图4展示的是cd47单域抗体筛选富集过程。文库经第一轮淘选未出现富集，第二轮淘选出现1.8倍富集，第三轮淘选出现5.6倍富集，第四轮淘选出现19倍富集。

图5是1株hek293f系统表达cd47单域抗体与fc(igg4pe)融合蛋白的纯化图，其中单域抗体对应seqidno.:8氨基酸序列，经proteina亲和柱亲和层析纯化后，cd47单域抗体的sds-page的电泳图。结果显示，cd47单域抗体经过该纯化过程，其纯度可达到90％以上。

图6是facs检测cd47单域抗体的阻断效果，用稳定表达人全长cd47蛋白的hek293t细胞与各组单域抗体和生物素化的hsirpa(ecd)-fc蛋白共反应。由图可知，hsirpa(ecd)-fc-生物素与稳转细胞的结合率由阴性对照组的97.3％降至2.21％，这表明加入的单域抗体能够明显阻断cd47与sirpa的相互作用。结果表明本发明特异性针对cd47的单域抗体对cd47与sirpa的结合具有很好的阻断效果。

图7是流式细胞术检测人源化cd47单域抗体的阻断效果。用表达cd47蛋白的稳转株细胞与人源化单域抗体和生物素化的hsirpa(ecd)-fc蛋白共反应，阴性对照组中hsirpa(ecd)-fc-生物素与稳转株细胞的结合率为97.2％，而加入cd47单域抗体和人源化单域抗体后，hsirpa(ecd)-fc-生物素与稳转细胞的结合率显著降低；这表明人源化前及人源化后的单域抗体均能够明显阻断cd47与hsirpa的相互作用。

图8是流式细胞术检测人源化单域抗体与阳性对照抗体的ic50。结果表明，人源化cd47单域抗体的ic50为1.51ug/ml，而阳性对照抗体(b6h12)的ic50为12.34ug/ml，候选人源化单域抗体的阻断效果优于对照抗体。

图9是人源化单域抗体的亲和力检测结果。利用fortebio'soctetsystem测定人源化nb1-fc的亲和力为1.65e-9m。

图10是elisa检测cd47单域抗体的种属特异性结果。可见人源化后的cd47单域抗体只与人源的sirpa相互作用，不与大鼠及小鼠的cd47发生相互作用，候选的人源化单域抗体具有较好的种属特异性。

图11是人源化前后的单域抗体对红细胞的凝集作用结果。结果表明，人源化前与人源化后的单域抗体均不会引起红细胞的凝集反应。而阳性对照抗体b6h12在抗体浓度为62.5nm时会轻微引起红细胞凝集。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一类抗cd47单域抗体，实验结果表明，本发明获得的cd47单域抗体既能有效与cd47结合。

具体地，本发明利用人源的cd47抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫单域抗体基因文库。然后将cd47蛋白分子偶联在酶标板上，展示cd47蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫单域抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了cd47特异性的单域抗体基因。再将此基因转至大肠杆菌中，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的、且特异性高的单域抗体株。

如本文所用，术语“本发明单域抗体”、“本发明的抗cd47单域抗体”、“本发明cd47单域抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于cd47(包括人cd47)的单域抗体。特别优选的是vhh链的氨基酸序列如seqidno.:8或14所示的单域抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“单域抗体(vhh)”、“单域抗体”(singledomainantibody,sdab，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(vhh)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(vhh)。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nihpubl.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗cd47蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，术语“重链可变区”与“vh”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementaritydeterminingregion,cdr)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区cdr1、cdr2、和cdr3。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合cd47蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(cdr)，将该段间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。

本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带cdr的抗体重链可变区的分子，只要其cdr与此处鉴定的cdr具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6his标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有cd47蛋白结合活性的、包括上述cdr区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述cdr区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含单域抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。

用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、pk(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如il-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

整合素相关蛋白cd47

整合素相关蛋白(cd47)是一种50kd的膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。因其最先以膜表面蛋白的形式与整合素αvβ3一起从白细胞和胎盘中分离出来，且其功能多与整合素有关，因此称之为整合素相关蛋白(integrin-associatedprotein，iap)。cd47广泛表达于造血细胞(红细胞、淋巴细胞、血小板、单核细胞和中性粒细胞)表面以及胎盘、肝和脑组织上。通过与其配体间的相互作用，参与生物体的多种生理活动，如血小板的激活、清除，巨噬细胞的趋化、吞噬作用，基质细胞支持的造血生成以及中性粒细胞的迁移及激活过程。cd47与抑制性受体信号调节蛋白a互为受体和配体，可形成cd47-sirpa信号复合体，该信号复合物具有介导双向信号调节并调控多种免疫反应进程的作用。作为红细胞的自身标志抑制红细胞的清除，参与溶血性贫血的发病机制；在正常造血干细胞(hematopoieticstemcells,hscs)上，cd47表达的意义在于保持其在机体内的相对稳定；在白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌和乳腺癌等恶性肿瘤中，cd47高表达于肿瘤细胞表面，提示临床预后不良。肿瘤细胞通过借此“别吃我”信号，逃避了肿瘤免疫。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合cd47蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

标记的单域抗体

在本发明的一个优选例中，所述单域抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗cd47的单域抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单域抗体。

本发明的抗cd47单域抗体具有很好的特异性，很高的效价。

检测方法

本发明还涉及检测cd47蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中cd47蛋白的水平。

在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。

试剂盒

本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明还提供了用于检测cd47水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别cd47蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

应用

如上所述，本发明的单域抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与cd47相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对cd47的临床诊断和靶向治疗。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明单域抗体高特异性针对人的具有正确空间结构的cd47蛋白，且不与红细胞结合。

(b)本发明单域抗体的亲和力强，且人源化抗体具有优异的种属特异性。

(c)本发明单域抗体的生产简便。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：人cd47蛋白的表达纯化

(1)将人cd47的核苷酸序列合成在pcdna3.1(-)载体上，然后将其胞外段序列亚克隆至pfuse-igg1载体上；(2)用omega质粒大提试剂盒提取构建的pfuse-igg1-hcd47(ecd)质粒；(3)培养hek293f细胞至od为2.0×10⁶个/ml；(4)将质粒与转染试剂pei1:3混合均匀后静置20min，然后加入到hek293f细胞中，37℃，6％co2摇床培养箱中培养5-6天；(5)收集细胞上清，与proteina珠子在室温下结合1h；(6)用磷酸盐缓冲液ph7.0洗涤珠子后，再用0.1mph3.0glycine洗脱蛋白；(7)将洗脱的蛋白超滤至pbs中，测定产量后取样进行sds-page检测(检测结果如图1所示)，其余蛋白保存于-80℃冰箱；

实施例2：cd47单域抗体文库的构建及筛选

文库构建：简要地，(1)将1mghcd47(ecd)-fc抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激b细胞表达抗原特异性的单域抗体；(2)7次免疫结束后，提取100ml骆驼外周血淋巴细胞并提取总rna；(3)合成cdna并利用套式pcr扩增vhh；(4)利用限制性内切酶psti及noti酶切20μgpmecs噬菌体展示载体(biovector供应)及10μgvhh并连接两个片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞tg1中，构建cd47单域抗体文库并测定库容，库容大小为2.5×10⁹cfu(结果如图2所示)。与此同时，随机挑取24颗克隆进行菌落pcr检测，结果表明所建文库的插入率为100％，图3显示菌落pcr结果。

抗体筛选鉴定：简要地，(1)将溶解在100mmnahco3、ph8.2中的10μghcd47(ecd)-fc抗原(10μgfcinnahco3作为对照)偶联在nunc酶标板上，4℃放置过夜；(2)第二天加入100μl0.1％bsa，室温封闭2h；(3)2h后，加入100μl噬菌体(2×10¹¹cfu免疫骆驼单域抗体噬菌展示基因库)，室温作用1h；(4)用0.05％pbs+tween-20洗5遍，以洗掉非特异的噬菌体；(5)用100mm三乙醇胺将与cd47特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌tg1细胞，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复4轮使阳性的克隆被富集(图4)。(6)从富集后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选200个单个菌落并接种于含有100μg/ml的氨苄青霉素的tb培养基(1ltb培养基中含有2.3gkh2po4，12.52gk2hpo4，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4ml甘油中，生长至对数期后，加终浓度1mm的iptg，28℃培养过夜。(7)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的elisa板中，在室温下放置1h。(8)用pbst洗去未结合的抗体，加入鼠抗ha抗体(covence)，在室温下放置1h。(9)用pbst洗去未结合的抗体，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，在室温下放置1h。(10)用pbst洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于elisa仪上，在405nm波长，读取吸收值。(11)当样品孔od值大于对照孔od值3倍以上时(ratio+/-＞3)，判为阳性克隆孔。(12)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mlamp的lb液体中以便提取质粒并进行测序。

实施例3：cd47单域抗体在真核细胞hek293中的表达纯化及流式细胞术检测单域抗体的阻断功能

真核细胞hek293f表达cd47nb-fc融合蛋白：(1)将测序结果正确的cd47nb序列克隆至pfuse-igg4载体(购自invivogen)，用omega质粒大提试剂盒提取pfuse-igg4-nb质粒；(2)培养hek293f细胞至od为2.0×10⁶个/ml；(3)将质粒与转染试剂pei按照1:3混合均匀后静置20min，然后加入到hek293f细胞中，37℃，6％co2摇床培养箱中培养5-6天；(4)收集细胞上清，与proteina珠子在室温下结合1h；(5)用磷酸盐缓冲液ph7.0洗涤珠子后，再用0.1mph3.0glycine洗脱蛋白；(6)将洗脱的蛋白超滤至pbs中，测定产量后取样进行sds-page检测(检测结果图5所示)，其余蛋白保存于-80℃冰箱。

流式细胞术鉴定单域抗体的阻断功能：简要地，(1)制备hsirpa(ecd)-fc-biotin，蛋白生物素的方法参照生物素试剂说明书；(2)每个样品取5×10⁵个cd47稳转细胞于0.5％bsa-pbsbuffer中，加入上述纯化的cd47单域抗体5μg，同时设置阴性对照(higg1)和空白组(pbs)，所有样本中同时加入5μghsirpa(ecd)-fc-biotin，4℃孵育20min；(3)pbs洗涤2次细胞，加入ebioscience的sa-pe，4℃孵育20min，pbs洗涤2次细胞后用流式细胞仪(bdfacscalibur)检测。

检测结果如图6所示，hsirpa(ecd)-fc-生物素与稳转细胞的结合率由阴性对照组的97.3％降至2.21％，这表明加入的单域抗体能够明显阻断cd47与sirpa的相互作用。结果表明本发明特异性针对cd47的单域抗体对cd47与sirpa的结合具有很好的阻断效果。

实施例4：cd47单域抗体的人源化改造

首先，以seqidno.:8所示的cd47单域抗体序列为模板在结构数据库中同源结构的搜索，共搜寻到1288个结构，取其中evalue＝0.0并且序列等同性≥70％的29个结构；其次，对这29个结构进行结构比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，最终选取包括3dwt在内的11个蛋白，进行基于seqidno.:8所示的cd47单域抗体序列的多模板同源模建，最终获得的5个结构，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构，继续下面的工作；然后对模建的最优结构，利用protsa服务器计算残基的溶剂可接触性，即残基的折叠态相对于去折叠态的溶剂可接触面积的比值为判据，取大于40％的残基为暴露于溶剂外的残基；最后，对模建的最优结构和dp-47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。最终确定出一种人源化cd47单域抗体，由seqidno.14所示的氨基酸序列编码。人源化前后抗体序列对应如下表1：

实施例5：流式细胞术检测人源化cd47单域抗体的阻断效果

首先，将人源化后的cd47单域抗体nb1902序列(seqidno.:15)合成至pfuse-igg4pe载体上，用omega质粒大提试剂盒提取pfuse-igg4pe-nb1902质粒；然后利用hek293f系统将人源化的单域抗体nb1902-fc表达出来，表达方法同实施例3。随后，将人源化前后的两株抗体及对照抗体(b6h12)分别稀释至1ug/ul、1/4ug/ul、1/8ug/ul。分别于配体5ughsirpa(ecd)-fc-biotin混合后与稳定表达hcd47的细胞混合，实验流程及检测方法同实施例3。检测结果如图7所示。

由图7可见，阴性对照组中hsirpa(ecd)-fc-生物素与稳转株细胞的结合率为97.2％，而加入cd47单域抗体和人源化单域抗体后，hsirpa(ecd)-fc-生物素与稳转细胞的结合率显著降低；这表明人源化前及人源化后的单域抗体均能够明显阻断cd47与hsirpa的相互作用。

实施例6：流式细胞术检测人源化cd47单域抗体的ic50

(1)每个样品取5×10⁵个cd47稳转细胞于0.5％bsa-pbsbuffer中，加入梯度稀释的cd47人源化单域抗体(nb1756-fc)及对照抗体b6h12(抗体稀释梯度为30ug/ml、25ug/ml、20ug/ml、15ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、3.333ug/ml、2.5ug/ml、1.667ug/ml、1.25ug/ml、1ug/ml、0.833ug/ml、0.625ug/ml、0.5ug/ml、0.417ug/ml、0.313ug/ml)，每个样品加入100ul，同时设置阴性对照(higg4)，所有样本中同时加入5μghsirpa(ecd)-fc-biotin，4℃孵育20min；(2)pbs洗涤2次细胞，加入ebioscience的sa-pe，4℃孵育20min，pbs洗涤2次细胞后用流式细胞仪(bdfacscalibur)检测，使用graphpadprism6软件进行数据处理。

结果如图8所示，人源化的cd47单域抗体的ic50为1.51ug/ml，而对照抗体(b6h12)的ic50为12.34ug/ml。可见候选人源化单域抗体的阻断效果显著优于对照抗体。

实施例7：人源化单域抗体的亲和力检测

(1)用pbst将人源化的单域抗体从100nm进行梯度稀释，分别为：100nm、66.7nm、44.4nm、29.6nm、19.8nm、13.2nm。将抗原蛋白hcd47(ecd)-fc和fc分别稀释至30ug/ml。(2)设置仪器运行条件：温度30℃，shakespeed1000rpm。使用已包被proteina的探针(fortebiopartno:18-5010)捕获抗体，捕获时间180s；结合梯度稀释的抗原，结合时间180s；解离时间300s；10mm甘氨酸(ph1.7)再生3次，每次5s。(3)用fortebio'soctetsystem进行上机检测。

检测结果如图9所示：人源化nb1902-fc的亲和力为1.65e-9m，与已报导的对照抗体(b6h12)的亲和力相似，参考文献zengd,sunq等人，oncotarget.2016dec13；7(50):83040-83050。

实施例8：人源化cd47单域抗体的种属特异性检测

(1)将人源化的cd47单域抗体基因克隆至大肠杆菌表达载体pmecs上，表达纯化过程同实施例4；(2)包被抗原蛋白cd47(人)、cd47(鼠)、cd47(猴)：每孔0.5μg(5μg/ml，100μl)，包被igg4为对照，4℃过夜；(3)第二天用pbst洗涤3次，加入200μl的1％bsa室温下封闭2h；(4)pbst洗涤三次，分别加入100ul浓度为10μg/ml人源化后的单域抗体，室温下反应1h；(5)用pbst洗去未结合的抗体，加入鼠抗ha抗体(covence)，在室温下放置1h；(6)用pbst洗去未结合的抗体，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，在室温下放置1h；(7)用pbst洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于elisa仪上，在405nm波长，读取吸收值。

根据吸收值判断单域抗体的特异性，检测结果如图10所示：人源化后的单域抗体能够与人源和猴源的cd47相互作用，而不与鼠源的cd47相互作用，两株抗体具有优异的种属特异性。

实施例9：人源化cd47单域抗体对红细胞的凝集反应

由于红细胞表面有cd47高表达，因此会更容易优先和cd47抗体药物结合，把药物富集在表面起到“储水池”的作用。因此，该种情况容易出现贫血。只有药物进入体内后首先需要突破血小板对cd47抗体的“吸收池”作用，才能有效到达作用位置发挥作用。

将人源化前后的cd47单域抗体、阳性对照抗体(b6h12，序列来源见wo2011143624a2)、阴性对照(igg4)分别梯度稀释(4000nm、1000nm、250nm、62.5nm、15.625nm、3.906nm、0.976nm、0nm)。将梯度稀释好的抗体分别加入到猴子的红细胞悬液(2％)中，置于37℃下反应30min后观察结果。

结果如图11所示表明，人源化前后的单域抗体均不会引起红细胞的凝集反应。其中对照抗体(b6h12)的实验结果与penkas.petrova等人，2016，clin.cancer.res.23(4)报道的结果一致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海洛启生物医药技术有限公司

<120>cd47单域抗体及其用途

<130>p2018-0334

<160>15

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>25

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

glnvalglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglygly

151015

serleuargleusercysalaalaser

2025

<210>2

<211>10

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

glytyralatyrthrseraspcysmetgly

1510

<210>3

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

trppheargglnthrproglylysgluarggluglyvalalaleu

151015

<210>4

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

iletyrthrproglyasnserthr

15

<210>5

<211>38

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

asntyralaaspservallysglyargphethrileserglnaspasn

151015

vallysasnthrvaltyrleuglnmetasnserleulysprogluasp

202530

thralamettyrtyrcys

35

<210>6

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

alaalaargargglyalacysserleuargleuprophephetyr

151015

<210>7

<211>11

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

trpglyglnglythrglnvalthrvalserser

1510

<210>8

<211>122

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

glnvalglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyralatyrthrserasp

202530

cysmetglytrppheargglnthrproglylysgluarggluglyval

354045

alaleuiletyrthrproglyasnserthrasntyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserglnaspasnvallysasnthrvaltyr

65707580

leuglnmetasnserleulysprogluaspthralamettyrtyrcys

859095

alaalaargargglyalacysserleuargleuprophephetyrtrp

100105110

glyglnglythrglnvalthrvalserser

115120

<210>9

<211>366

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

caggtgcagctgcaggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactc60

tcctgtgcagcctctggatacgcctacactagcgactgcatgggctggttccgccagact120

ccagggaaggagcgcgagggggtcgcacttatttatacgcctggtaatagcacaaactat180

gccgactccgtgaagggtcgattcaccatctcccaagacaacgtcaagaacacggtgtat240

ctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcgagacga300

ggcgcctgctcacttaggttgccctttttttactggggccaggggacccaggtcaccgtc360

tcctca366

<210>10

<211>25

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

glnvalglnleuglngluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaser

2025

<210>11

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

trppheargglnthrproglylysglyleugluglyvalalaleu

151015

<210>12

<211>38

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

asntyralaaspservallysglyargphethrileserglnaspasn

151015

serlysserthrvaltyrleuglnmetasnserleuargalagluasp

202530

thralamettyrtyrcys

35

<210>13

<211>11

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

trpglyglnglythrleuvalthrvalserser

1510

<210>14

<211>122

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

glnvalglnleuglngluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyralatyrthrserasp

202530

cysmetglytrppheargglnthrproglylysglyleugluglyval

354045

alaleuiletyrthrproglyasnserthrasntyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserglnaspasnserlysserthrvaltyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralamettyrtyrcys

859095

alaalaargargglyalacysserleuargleuprophephetyrtrp

100105110

glyglnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>15

<211>366

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

caggtgcagctgcaggagtccggcggcggcctggtgcagcccggcggctccctgaggctg60

tcctgcgccgcctccggctacgcctacacctccgactgcatgggctggttcaggcagacc120

cccggcaagggcctggagggcgtggccctgatctacacccccggcaactccaccaactac180

gccgactccgtgaagggcaggttcaccatctcccaggacaactccaagtccaccgtgtac240

ctgcagatgaactccctgagggccgaggacaccgccatgtactactgcgccgccaggagg300

ggcgcctgctccctgaggctgcccttcttctactggggccagggcaccctggtgaccgtg360

tcctcc366