Gmpplcyp8蛋白及其相关生物材料在调控植物固氮能力中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体涉及gmpplcyp8蛋白及其相关生物材料在调控植物固氮能力中的应用。
背景技术：
：目前农作物的高产很大程度上依赖于氮肥的使用，但大量施用氮肥，既增加生产成本，又造成环境污染，而固氮微生物与豆科植物之间的共生固氮是直接将大气中的氮气通过固氮酶转化为氨的生物过程，是最经济、最环保的一种生物固氮方式。大豆种子中蛋白质含量约为40％，含油量约为20％，是世界上最重要的油料作物和牲畜饲料原料。2018年全球大豆总产3.8亿吨，我国大豆产量也在1200多万吨左右，然而，大豆在种植中需要大量的氮源，在不过量施用氮肥的情况下，大豆中的氮，估计58-68％来自共生固氮。收获后，植物地下的根及根瘤中30-60％的氮又可以回补周围土壤。因此发挥豆科植物固氮作用，减少氮肥施用量，在农业以及生态学方面都具有十分重要的意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是如何提高植物固氮能力。为了解决上述技术问题，本发明首先提供了gmpplcyp8蛋白质或与gmpplcyp8蛋白质相关的生物材料的新用途。本发明提供了gmpplcyp8蛋白质或与gmpplcyp8蛋白质相关的生物材料在如下(1)-(8)中任一种中的应用：(1)调控植物固氮能力或共生固氮能力或共生结瘤能力；(2)调控植物根瘤发育；(3)调控植物根瘤数目；(4)调控植物根瘤衰老进程；(5)调控植物根瘤固氮时间；(6)调控植物结瘤素基因的表达水平；(7)调控植物植株高度；(8)调控植物地上部分鲜重；所述gmpplcyp8蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：a1)编码gmpplcyp8蛋白质的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述应用中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1所示的cdna分子或基因组dna分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码gmpplcyp8蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码gmpplcyp8蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码gmpplcyp8蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码gmpplcyp8蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码gmpplcyp8蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述应用中，a2)所述的含有编码gmpplcyp8蛋白质的核酸分子的表达盒(gmpplcyp8基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达gmpplcyp8的dna，该dna不但可包括启动gmpplcyp8基因转录的启动子，还可包括终止gmpplcyp8基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。在本发明的一个具体实施例中，启动所述gmpplcyp8基因表达的启动子为多聚泛素化启动子。可用现有的表达载体构建含有所述gmpplcyp8基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pu1301。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述农杆菌具体可为发根农杆菌a.rhizogeneslba1334。上述应用中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。上述应用中，所述调控植物固氮能力、根瘤发育、根瘤数目、根瘤衰老进程、根瘤固氮时间、结瘤素基因的表达水平、植株高度和地上部分鲜重具体体现在：当植物中的gmpplcyp8蛋白质表达量和/或活性提高时，所述植物固氮能力降低、根瘤数目减少、根瘤衰老加速、根瘤固氮时间缩短、结瘤素基因的表达水平降低、株高降低、地上部分鲜重减少；当植物中的gmpplcyp8蛋白质表达量和/或活性降低时，所述植物固氮能力提高、根瘤数目增加、根瘤衰老延缓、根瘤固氮时间延长、结瘤素基因的表达水平提高、株高提高、地上部分鲜重增加。所述结瘤素基因为nin基因和/或lb基因和/或enod40基因。所述表达水平具体为rna表达水平。在本发明的一个具体实施例中，所述调控植物固氮能力、根瘤数目、根瘤衰老进程、根瘤固氮时间、结瘤素基因的表达水平、植株高度和地上部分鲜重具体为降低植物固氮能力、减少植物根瘤数目、加速植物根瘤衰老、缩短植物根瘤固氮时间、降低结瘤素基因的表达水平、降低植物株高、减少植物地上部分鲜重。本发明还提供了上述gmpplcyp8蛋白质或与gmpplcyp8蛋白质相关的生物材料在培育固氮能力提高和/或根瘤数目增加和/或根瘤衰老延缓和/或根瘤固氮时间延长和/或株高提高和/或地上部分鲜重增加的转基因植物中的应用。本发明还提供了上述gmpplcyp8蛋白质或与gmpplcyp8蛋白质相关的生物材料在培育固氮能力降低和/或根瘤数目减少和/或根瘤衰老加速和/或根瘤固氮时间缩短和/或株高降低和/或地上部分鲜重减少的转基因植物中的应用。上述gmpplcyp8蛋白质或与gmpplcyp8蛋白质相关的生物材料在培育高固氮植物品种或培育固氮植物品种或植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种转基因植物的培育方法。本发明提供的转基因植物的培育方法包括提高目的植物中gmpplcyp8蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物固氮能力低于所述目的植物和/或所述转基因植物根瘤数目少于所述目的植物和/或所述转基因植物根瘤衰老速度快于所述目的植物和/或所述转基因植物根瘤固氮时间短于所述目的植物和/或所述转基因植物株高低于所述目的植物和/或所述转基因植物地上部分鲜重少于所述目的植物。上述方法中，所述提高目的植物中gmpplcyp8蛋白质的表达量和/或活性是通过将gmpplcyp8蛋白质的编码基因导入目的植物中来实现的。所述gmpplcyp8蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。所述gmpplcyp8蛋白质的编码基因可通过使用ti质粒，植物病毒栽体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入目的植物中。在本发明的一个具体实施例中，所述gmpplcyp8蛋白质的编码基因通过重组载体pu1301-gmpplcyp8导入目的植物。所述pu1301-gmpplcyp8为将pu1301载体的kpni和bamhi酶切位点间的dna片段替换为序列1所示的gmpplcyp8基因片段，且保持pu1301载体的其他序列不变后得到的载体。重组载体pu1301-gmpplcyp8表达序列2所示的gmpplcyp8蛋白。上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。进一步的，所述双子叶植物可为豆科植物。更进一步的，所述豆科植物可为大豆(soybean)、百脉根(lotusjaponicus)、紫云英(astragalussinicus)、苜蓿(medicagotruncatula)以及花生(arachishypogaealinn)等。在本发明的一个具体实施例中，所述百脉根可为百脉根mg20。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明从大豆中克隆出gmpplcyp8基因，构建出由多聚泛素化启动子驱动gmpplcyp8基因表达的植物表达载体，并通过毛根转化转入模式豆科植物百脉根中，通过gus鉴定得到阳性植株后，将阳性植株种在沙和蛭石1:1混合盆栽中，接种根瘤菌。通过对转基因百脉根进行功能分析发现，gmpplcyp8基因超表达后，植株明显变弱，结瘤数目明显降低，根瘤衰老明显加速。本发明的gmpplcyp8基因能够参与并负调控百脉根结瘤及加速根瘤的衰老。在实际应用中，可以通过基因编辑的手段敲除植物中的gmpplcyp8基因，以有效增加植物根瘤的数目，延长根瘤固氮的时间，进而加强植物固氮能力。本发明为获得高固氮基因编辑大豆新品种提供了基因资源，不仅在农业以及生态学上具有很重要的意义，而且在豆科作物固氮机制研究以及农业生产上具有一定的应用前景。附图说明图1为gmpplcyp8基因的pcr扩增结果。图2为qpcr检测gmpplcyp8基因在不同根瘤样品中的表达情况示意图。图中：n-瘤，d-天。图3为gmpplcyp8转基因植株与对照植株在接种50天后的生长状况比较示意图。图4为gmpplcyp8转基因植株与对照植株在接种50天后的结瘤数目统计对比示意图。图5为利用石蜡切片观察gmpplcyp8转基因植株及对照植株在接种50天后根瘤衰老情况的示意图。a为对照在接种50天后根瘤的石蜡切片；b为gmpplcyp8转基因植株在接种50天后根瘤的石蜡切片。图6为利用半定量pcr及qpcr检测gmpplcyp8转基因植株及对照植株毛根中相关基因的表达情况。a为半定量pcr分析gmpplcyp8基因在gmpplcyp8转基因植株及对照植株毛根中的表达情况；b为qpcr分析3个结瘤素基因在gmpplcyp8转基因植株及对照植株毛根中的表达情况。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所涉及的培养基及试剂配方如下：ms培养基：msbasalsaltmixture(sigma)4.3g，msvitaminpowder0.103g，0.7-0.8％(质量体积比)琼脂粉，ddh2o定容至1000ml，调节至ph5.8。yma培养基：10.0g甘露醇(或蔗糖)，0.4gyeastextract，0.5gk2hpo4，0.2gmgso4·7h2o，0.1gcacl2·6h2o，0.1gnacl，4mlrh微量元素液，ddh2o定容至1000ml，调节至ph6.8-7.0，115℃灭菌20min。rh微量元素液：5.0gh3bo3，5.0gna2moo4，ddh2o定容至1000ml。fahraeus无氮营养液：0.10gcacl2·2h2o，0.12gmgso4·7h2o，0.10gkh2po4，0.15gna2hpo4·12h2o，1mlgibson微量元素液，5mg柠檬酸铁，ddh2o定容至1000ml。gibson微量元素液：2.86gh3bo3，0.22gznso4·7h2o，2.03gmnso4·4h2o，0.13gna2moo4·2h2o，0.08gcuso4·5h2o，ddh2o定容至1000ml。gus染液：100mmsodiumphosphatebuffer(ph7.0)，0.1％tritonx-100，0.1％n-laurylsarcosine，10mmna2edta，1mm铁氰化钾(k3fe(cn)6)，1mm亚铁氰化钾(k4fe(cn)6)和0.5mg/mlx-gluc。hre培养基：20x的sh-a盐，20x的um-c维生素，10g蔗糖，3ml1mmes，0.7-0.8％(质量体积比)琼脂粉，ddh2o定容至1000ml，调节至ph5.8。110℃灭菌30min。20x的sh-a盐：kno350g，mgso4·7h2o8g，nh4h2po46g，cacl2·2h2o4g，mnso4·4h2o0.2g，h3bo30.1g，znso4·7h2o0.02g，ki0.02g，cuso4·5h2o0.004g，namoo4·2h2o0.002g，cocl2·6h2o0.002g，feso4·7h2o0.3g，naedta0.4g。用100ml无菌水分别溶解feso4·7h2o和naedta，其它盐溶于700ml无菌水中，然后混合定容至1000ml，分装为50ml每管，-20℃保存。20x的um-c维生素：肌醇2.0g，烟碱酸0.1g，盐酸吡哆醇(维生素b6)0.2g，硫胺素盐酸0.2g，甘氨酸0.04g，ddh2o定容至1000ml，分装为50ml每管，-20℃保存。mes(2-[n-morpholino]ethane-sulfonicacid)1m储存液：称29.28gmes(sigma)用ddh2o定容至150ml，调节至ph5.8，分装为6ml每管，-20℃保存。下述实施例中的pu1301载体记载于如下文献：yuans,zhuhetal.aubiquitinligaseofsymbiosisreceptorkinaseinvolvedinnoduleorganogenesis.plantphysiol.2012,160(1):106-17中，载体经限制性内切酶bamhi和kpni酶切后在3’可形成线性化粘性末端，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的发根农杆菌a.rhizogeneslba1334记载于如下文献：offringa,ia；melchers,ls,etal.,complementationofagrobacteriumtumefacienstumor-inducingauxmutantsbygenesfromthet(r)-regionoftheriplasmidofagrobacteriumrhizogenes.pnas,1986,83(18):6935-9中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的百脉根根瘤菌maff303099记载于如下文献：myral.tansengco,makotohayashi,etal.crinkle,anovelsymbioticmutantthataffectstheinfectionthreadgrowthandalterstheroothair,trichome,andseeddevelopmentinlotusjaponicus.plantphysiol,2003,131(3):1054-63中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、gmpplcyp8基因的克隆及其表达分析一、gmpplcyp8基因的克隆以大豆cdna为模板利用pcr方法扩增得到大小为1089bp的gmpplcyp8基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，gmpplcyp8基因编码的gmpplcyp8蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。具体步骤如下：1、rna的提取采用trizol试剂(购自invitrogen公司)从大豆接种的根或瘤中提取总rna，提取方法根据trizol试剂说明书进行。2、cdna的获得利用反转录酶(购自takara公司)将步骤1提取的rna反转录成cdna第一条链。反应条件为：37℃15min(反转录反应)，85℃5sec(反转录酶失活反应)。3、pcr扩增目的片段以步骤2获得的cdna为模板，采用上游引物：5'-ggtaccatggcaatgaagaagctcttg-3'和下游引物：5'-ggatcctcaaagttcatctttaggagatg-3'进行pcr扩增，得到pcr产物。pcr反应体系：cdna2μl、上游引物(10μmol/l)0.5μl、下游引物(10μmol/l)0.5μl、10×buffer2μl、氯化镁(25mm)1.2μl、dntp(2.5mm)0.4μl、dna聚合酶(5u/μl)0.2μl、无菌水13.2μl。pcr反应程序：预变性94℃5min；变性94℃0.5min，退火55℃0.5min，延伸72℃1min，35次循环；终延伸72℃10min；保存4℃。4、目的片段的回收、纯化通过琼脂糖凝胶电泳回收目的dna片段，回收方法参照北京原平皓生物技术有限公司的dna琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤详见说明书。5、gmpplcyp8基因的获得1)用kpni和bamhi分别对回收的pcr产物和pu1301载体进行双酶切，得到酶切后的pcr产物和pu1301载体。2)将酶切后的pcr产物与酶切后的pu1301载体连接，得到重组载体pu1301-gmpplcyp8。连接体系如下：酶切后的pu1301载体0.5μl、酶切后的pcr产物4μl、solutioni5.5μl。连接条件如下：16℃反应过夜。3)将5μl重组载体pu1301-gmpplcyp8转化dh5α感受态细胞，然后均匀涂布到含有卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养12-16小时。挑选转化平板上的单克隆菌落，摇菌，提取质粒。按上述pcr引物和扩增条件，以挑取的单菌落为模板，进行pcr扩增，经琼脂糖电泳检测产生大小为1089bp的gmpplcyp8基因片段，如图1所示，即为含有该基因序列的阳性克隆。4)经鉴定的阳性克隆，送交至生工生物工程股份有限公司进行dna测序。测序结果表明：gmpplcyp8基因片段的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。gmpplcyp8基因编码的gmpplcyp8蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。重组载体pu1301-gmpplcyp8为将pu1301载体的kpni和bamhi酶切位点间的dna片段替换为序列1所示的gmpplcyp8基因片段，且保持pu1301载体的其他序列不变后得到的载体。重组载体pu1301-gmpplcyp8表达序列2所示的gmpplcyp8蛋白。二、gmpplcyp8在大豆根瘤发育中的表达情况收取大豆品种天隆一号在不同发育阶段(12dn、30dn、42dn、64dn、84dn)的根瘤作为实验材料，利用qpcr技术检测gmpplcyp8在大豆根瘤不同发育阶段中的表达情况。具体步骤如下：采用trizol试剂(购自invitrogen公司)分别提取实验材料的总rna，反转录为cdna。然后利用gmpplcyp8基因引物对进行qpcr。以qact(大豆)作为内参。pcr反应程序：95℃10s；95℃5s，60℃12s，72℃15s，40个循环；接着进行溶解曲线分析。采用2-△△ct法分析gmpplcyp8基因大豆根瘤不同发育阶段中的表达情况，每组样品重复3次。gmpplcyp8基因引物对：上游引物(5'-tcacctcaaggatgatccgc-3')与下游引物(5'-aggatgtagttccttggttgcat-3')。qact内参基因引物对：上游引物(5'-atcttgactgagcgtggttattcc-3')与下游引物(5'-gctggtcctggctgtctcc-3')。结果如图2所示。结果表明gmpplcyp8基因在上述样品中差异表达，并且在根瘤发育后期表达量显著上升，从而证明了gmpplcyp8基因参与大豆共生及根瘤的发育。实施例2、转gmpplcyp8百脉根的获得及gmpplcyp8功能分析一、转gmpplcyp8百脉根的获得将实施例1构建的重组载体pu1301-gmpplcyp8转化到发根农杆菌a.rhizogeneslba1334中用于百脉根的毛根转化，得到转gmpplcyp8百脉根。百脉根毛根转化方法主要参考百脉根(lotusjaponicus)handbook。具体步骤如下：1、植物材料准备用砂纸将百脉根mg20种子磨毛后于液氮中处理1分钟。然后依次用75％(质量体积比)乙醇及5％(有效氯浓度)naclo消毒种子，完成后留少许无菌水于黑暗条件下春化处理1天。然后转到不加蔗糖的ms固体培养基上23℃暗培养2天。然后置于光照培养箱(16h光照，8h黑暗)中23℃继续培养2天，待用。2、菌株侵染将含gmpplcyp8基因的质粒(实施例1构建的重组载体pu1301-gmpplcyp8)通过转化方法导入农杆菌a.rhizogeneslba1334(壮观霉素抗性)。然后从培养了2天的平板上挑单菌落接种于5mllb培养基(含质粒抗性)，28-30℃振荡培养16-24小时。然后将前一天接种的小量菌扩大培养，1：100比例接种，28-30℃振荡培养8小时左右。将大量培养的菌液以6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，用无菌水重悬菌体，使其od600＝0.8左右。将百脉根mg20幼苗的下胚轴基部切断，有子叶的部分用此重悬菌液浸泡30分钟，捞出外植体，用滤纸吸干，置于不加蔗糖的ms培养基上共培养。3、阳性转基因根鉴定及培养先避光共培养3-5天。然后把外植体转入含有300μg/mlcefotaxime的hre培养基上继续培养10天，这期间毛根从下胚轴切口处长出。然后剪取根尖处约0.5cm长的根段放入gus染液中，37℃暗培养过夜，显蓝的根为阳性转gmpplcyp8百脉根毛根。剪去非转化的根，把苗放在装有水的平皿中(不加盖)炼苗1天，然后移栽到花盆中于光照培养箱(16h光照，8h黑暗)23℃培养。花盆中事先加入蛭石(vermiculite)和沙(sand)按1:1比例混合的基质。每3天浇一次无氮营养液。按照上述方法，将载体pu1301转化到发根农杆菌a.rhizogeneslba1334中用于百脉根的毛根转化，得到转空载体百脉根。二、gmpplcyp8基因超表达在百脉根中的功能分析1、根瘤菌接种将百脉根根瘤菌maff303099在yma平板上活化后，接入液体ty培养基中，28℃震荡培养24-36h；培养好的根瘤菌转入无菌的离心管中，4℃，7000r/min离心5min，收集菌体；以无菌fahraeus无氮营养液洗涤并离心2次；加入无氮营养液重悬菌体，接种于阳性转gmpplcyp8百脉根的幼苗根部。同时以转空载体百脉根和野生型百脉根mg20作为对照。2、gmpplcyp8基因超表达在百脉根中的功能分析接种根瘤菌50天后，收获阳性转gmpplcyp8百脉根(gmpplcyp8-ox)及转空载体百脉根(ck)，观察整个植株(包括地上部分及地下根系)表型，并拍照记录。记录每棵植株根瘤的数目，然后整体进行统计对比分析。随机选取15个较大的根瘤进行faa固定，做石蜡切片观察。随机取阳性转gmpplcyp8百脉根的根瘤材料和对照根瘤材料抽提rna，通过半定量的方法检测gmpplcyp8在阳性转gmpplcyp8百脉根毛根材料和对照毛根材料中的表达丰度；通过qpcr的方法检测3个结瘤素基因在阳性转gmpplcyp8百脉根毛根材料和对照毛根材料中的表达情况。转gmpplcyp8百脉根(gmpplcyp8-ox)取30颗植株，转空载体百脉根(ck)取35颗植株，结果取平均值。gmpplcyp8基因的半定量pcr检测方法如下：将混合后的转基因毛根材料抽提rna，反转录为cdna。然后以此cdna为模板进行pcr扩增。所用引物序列如下：gmpplcyp8：上游引物(5'-ggtaccatggcaatgaagaagctcttg-3')与下游引物(5'-ggatcctcaaagttcatctttaggagatg-3')；ubiquitin(l.japonicus)：上游引物(5'-ttcaccttgtgctccgtcttc-3')与下游引物(5'-aacaaccagcacacacagacaatc-3')。三个结瘤素基因的qpcr检测方法如下：将混合后的转基因毛根材料抽提rna，反转录为cdna。然后以此cdna为模板进行qpcr。所用引物序列如下：ubiquitin(百脉根)：上游引物(5'-ttcaccttgtgctccgtcttc-3')与下游引物(5'-aacaaccagcacacacagacaatc-3')；nin(百脉根)：上游引物(5'-aactcactggaaacaggtgctttc-3')与下游引物(5'-ctattgcggaatgtattagctaga-3')；lb(百脉根)：上游引物(5'-ctccaagcccatgctgaaaa-3')与下游引物(5'-tggcatctgcaagtgtcacttc-3')；enod40(百脉根)：上游引物(5'-caaaactcgttatgttgcgg-3')与下游引物(5'-cacctcaaaggaagaagaaca-3')。根瘤石蜡切片制作的具体步骤如下：①石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min-二甲苯ⅱ15min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。②修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，在圈内滴加蛋白酶k工作液覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。③破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。④加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(tdt)和试剂2(dutp)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。⑤阻断内源性过氧化物酶：将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3％过氧化氢溶液，室温避光孵育15min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。⑥加试剂3：切片稍甩干后，每张切片加适量试剂3(converter-pod)覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育30min。将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。⑦dab显色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为细胞核呈棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。⑧复染细胞核：harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。⑨脱水封片：将切片依次放入75％酒精6min-85％酒精6min-无水乙醇ⅰ6min-无水乙醇ⅱ6min-二甲苯ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。结果表明：gmpplcyp8基因超表达后，和转空载体对照相比，转gmpplcyp8百脉根生长状态明显变差、植株变矮、地上部分鲜重减少(图3)，转gmpplcyp8百脉根植株株高为7.9833cm，地上部分鲜重为0.558g；转空载体百脉根对照植株高度为11.3114cm，地上部分鲜重为0.6986g。和转空载体对照相比，转gmpplcyp8百脉根的根瘤数目明显减少(图4)，共生体膜的裂解现象相对比较明显，根瘤衰老也明显加速(图5)。和转空载体对照相比，gmpplcyp8基因在转gmpplcyp8百脉根毛根中的表达量显著增加(图6a)；转gmpplcyp8百脉根毛根中三个结瘤素基因的表达水平明显降低(图6b)。野生型百脉根生长状态、植株高度、地上部分鲜重、根瘤数目、根瘤衰老、相关基因表达量与转空载体百脉根无显著性差异。上述结果表明：gmpplcyp8基因负调控植物的根瘤数目，可加速根瘤衰老，是豆科植物共生的一个负调控因子，由此可以通过基因编辑的手段敲除该基因，以大大增加植物根瘤数目，延长根瘤固氮的时间，进而提高植物固氮能力，这在豆科作物固氮机制研究以及农业生产上具有一定的应用前景。以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。序列表<110>中国农业科学院油料作物研究所<120>gmpplcyp8蛋白及其相关生物材料在调控植物固氮能力中的应用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1089<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atggcaatgaagaagctcttgtgggttgtcctgtctctatctttggttcttggagtggcc60aatagctttgattttcacgacaaggatttggcgtccgaggaaagcttttgggacttgtac120gagagatggaggagtcaccacacggtttcgcgaagcctcggtgacaagcacaagcggttt180aacgtgtttaaagcaaatgtgatgcatgtccataacactaacaagatggataagccttac240aagctgaaactaaacaagtttgctgacatgaccaaccatgaatttaggagtacctatgct300ggctcaaaggttaatcaccacagaatgttccaaggcacgccacgtgggaacgggaccttc360atgtatgagaaggttggtagtgttcctccttctgtggattggaggaagaatggtgctgtc420actggtgtaaaagatcaaggccaatgtggtagttgttgggcgttttcaactgttgtagct480gttgaaggcattaaccaaatcaagacaaataagctagtctccttgtctgaacaagagctg540gtggactgtgacaccaaaaaaaatgcaggatgcaatggtgggttaatggaatctgctttt600gagttcatcaagcagaagggaggcataacaacagaaagcaattacccttacacagcacaa660gatggaacctgcgatgcatcaaaggcaaatgacctagctgtatcaattgatggccatgag720aatgtccctgctaacgacgaaaatgcattgctcaaagctgttgccaaccaacctgtctct780gtagccatagatgctgggggatctgattttcaattctactctgagggagtatttactggt840gattgtagcacggagctaaatcacggtgtagcgattgtagggtatggaacaactgttgat900gggactaattactggacagtgaggaactcttggggaccagaatggggagaacagggttac960atcagaatgcaaaggagcatatctaagaaggagggactttgtggcatagctatgatggct1020tcctacccaatcaaaaactcctccaataatccaacaggaccctcatcatctcctaaagat1080gaactttga1089<210>2<211>362<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metalametlyslysleuleutrpvalvalleuserleuserleuval151015leuglyvalalaasnserpheaspphehisasplysaspleualaser202530glugluserphetrpaspleutyrgluargtrpargserhishisthr354045valserargserleuglyasplyshislysargpheasnvalphelys505560alaasnvalmethisvalhisasnthrasnlysmetasplysprotyr65707580lysleulysleuasnlysphealaaspmetthrasnhisgluphearg859095serthrtyralaglyserlysvalasnhishisargmetpheglngly100105110thrproargglyasnglythrphemettyrglulysvalglyserval115120125proproservalasptrparglysasnglyalavalthrglyvallys130135140aspglnglyglncysglysercystrpalapheserthrvalvalala145150155160valgluglyileasnglnilelysthrasnlysleuvalserleuser165170175gluglngluleuvalaspcysaspthrlyslysasnalaglycysasn180185190glyglyleumetgluseralapheglupheilelysglnlysglygly195200205ilethrthrgluserasntyrprotyrthralaglnaspglythrcys210215220aspalaserlysalaasnaspleualavalserileaspglyhisglu225230235240asnvalproalaasnaspgluasnalaleuleulysalavalalaasn245250255glnprovalservalalaileaspalaglyglyserasppheglnphe260265270tyrsergluglyvalphethrglyaspcysserthrgluleuasnhis275280285glyvalalailevalglytyrglythrthrvalaspglythrasntyr290295300trpthrvalargasnsertrpglyproglutrpglygluglnglytyr305310315320ileargmetglnargserileserlyslysgluglyleucysglyile325330335alametmetalasertyrproilelysasnserserasnasnprothr340345350glyproserserserprolysaspgluleu355360当前第1页12