一种抗BAP31单域抗体及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种抗BAP31单域抗体及其应用。

背景技术：

BAP31是位于内质网(Endoplasmic reticulum,ER)上的一个跨膜蛋白，最初把它作为B细胞受体相关蛋白(B cell receptor associated protein,BAP)，命名为BAP31。

BAPs家族的4个无糖基化修饰成员：BAP29、BAP31、BAP32和BAP37。虽然它们的序列不同，但是它们具有相似的结构特征：一个疏水性的N端和一个具有α-螺旋结构的C端。BAP31的编码基因位于Xq28，编码246个氨基酸，成熟的BAP31分子量为28kDa。BAP31由3个跨膜片段和一个13kDa胞质尾构成，其N端位于内质网腔中，C端位于胞浆中。

BAP31作为一种新的肿瘤相关抗原，近年来被发现在多种肿瘤组织中高表达，目前已有多篇文献报道BAP31高表达可以促进肿瘤的发生与转移。我们在前期研究中，以化学合成法合成BAP31C末端含有39个氨基酸(第207-246个氨基酸)的多肽。以此段多肽BAP31(207-246aa)为抗原，从人源噬菌体单域抗体库中筛选到能与其特异性结合的单域抗体。我们发现抗体VH-D1可以特异性抑制BAP31与p27^kip的结合，抑制p27^kip蛋白酶体降解，使细胞内p27^kip蛋白水平增加。因为p27^kip是一种周期相关蛋白，p27^kip蛋白水平增加，促进了胃癌细胞周期阻滞，从而达到抑制胃癌细胞增殖的目的[1]。

本发明在此研究的基础上，选取新的BAP31活性区域作为抗原(BAP31第164-206个氨基酸)，对于此段多肽的功能研究国内外未见报道。利用化学合成法合成含有43个氨基酸的多肽片段BAP31(164-206aa)，以此为抗原，从人源噬菌体单域抗体库筛选与其特异性结合的单域抗体，并评价抗体对胃癌细胞的杀伤作用。发现筛选所得的单域抗体VH-F12可以特异性抑制BAP31与EpCAM的结合，显著降低EpCAM的表达水平。对VH-F12的抗肿瘤活性进行体内、体外评价，发现该抗体可以显著促进胃癌细胞自噬性死亡，其对肿瘤细胞的杀伤作用对比前期文献发表的抗体VH-D1[1]有大幅度提升。另外，我们发现VH-F12可以显著抑制胃癌干样细胞的干性和自我更新能力。由于新的理论提出肿瘤干样细胞是肿瘤形成、复发、恶性转移和耐受放化疗的根源，因此抗肿瘤药物不仅应该对肿瘤细胞有抑制作用，还应该有效的杀伤肿瘤干样细胞。VH-F12对胃癌细胞和胃癌干样细胞都表现出显著的杀伤作用，为开发单抗类抗肿瘤药物提供新的探索方向，对提高肿瘤治疗疗效有重要意义。

单域抗体仅由重链可变区单域结构域组成，其分子量大小是完整抗体的1/12，最初单域抗体是从鲨鱼或羊驼体内发现的，现在可以由人源化的噬菌体单域抗体库筛选获得。单域抗体具有高亲和性和特异性等特点。人源的单域抗体还具有免疫原性低、溶解性和稳定性较好等特点，因此更适合于治疗应用。此外，单域抗体由于其分子量小，易于穿透实体瘤，可以结合到常规抗体不易结合的狭小裂隙中。使单域抗体在抗肿瘤治疗和新药研发方面具有巨大潜力。

目前仍然没有针对BAP31抗体用于临床实验及BAP31治疗性药物，我们已发表一篇有关BAP31单域抗体(抗BAP31(207-246aa))用于干扰p27^kip蛋白酶体降解，抑制胃癌细胞增殖的报道[1]。选取新的BAP31抗原区域(164-206aa)，筛选获得具有全新氨基酸序列的BAP31单域抗体(VH-F12)。其能有效干预BAP31与EpCAM结合，诱导胃癌细胞自噬性死亡的同时对胃癌干细胞产生显著的抑制作用，从而有效杀伤肿瘤细胞，相关研究国内外未见报道。

参考文献[1]：Jing Chen,Haotian Guo,Haitao Jiang,Mwichie Namusamba,Changli Wang,Tian Lan,Tianyi Wang*,Bing Wang*.A BAP31intrabody induces gastric cancer cell death by inhibiting p27kip1 proteasome degradation.International Journal of Cancer,2019；144(8):2051-2062.

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种抗BAP31单域抗体及其应用，同时提供了该单域抗体的氨基酸序列，核苷酸序列和含有该编码序列的载体和宿主细胞。

本发明的技术方案如下：

一种抗BAP31单域抗体，为针对BAP31特定区域的单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码SEQ ID NO.8的核苷酸序列为以下序列之一：

(1)如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

(2)由(1)限定的核苷酸序列中经过添加、取代、缺失或插入一个或两个以上核苷酸的序列；

(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(4)由于遗传密码子的简并性，区别于(1)、(2)、(3)限定的核苷酸序列。

SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列包含3个框架区和3个抗原识别区，其中3个框架区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，3个抗原识别区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

核苷酸和氨基酸序列：

SEQ ID NO.1 FR1：atggcccaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgcgtctctcctgtgcagcctcc

SEQ ID NO.2 FR2：atgggctgggtccgccaggctccagggaagggtctagagtgggtatcaagc

SEQ ID NO.3 FR3：tactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctcccgtgacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgccgaggacaccgcggtatattattgc

SEQ ID NO.4 CDR1：ggatttatgattagcgataagatt

SEQ ID NO.5 CDR2：attgataacaatgacggtagcaca

SEQ ID NO.6 CDR3：gcgactagtgcgccgggtattgtg

SEQ ID NO.7：atggcccaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtcc ctgcgtctctcctgtgcagcctcc ggatttatgattagcgataagatt atgggctgggtccgccaggctccagggaag ggtctagagtgggtatcaagc attgataacaatgacggtagcaca tactacgcagactccgtgaagggccggttcacc atctcccgtgacaattccaagaa cacgctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgccgaggacaccgcggtatattattgcgcgactagtgcgccgggtattgtgcagccggagtccgacgagctgccgttttggggtcagggaaccctggtcaccgtctcgtacccatacgacgtcccagactacgatgttccagattatgctagcgagaaggacgagctgtaa

SEQ ID NO.8:MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMISDKIMG

WVRQAPGKGLEWVSSIDNNDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSAPGIVQPESDELPFWGQGTLVTVSYPYDVPDYDVPDYA SEKDEL

本发明选取BAP31的特定区域(164-206aa)为抗原，其氨基酸序列为SEQ ID NO.9：DGGKLDVGNAEVKLEEENRSLKADLQKLKDELASTKQKLEKAE

本发明的核苷酸序列或至少部分序列可以通过合适的表达系统表达相应的蛋白质或多肽，这些表达系统包括：细菌、酵母菌、丝状真菌、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞或无细胞的表达系统。

本发明涉及一种针对上述BAP31编码的核苷酸序列的表达载体。

本发明涉及一种包含的上述表达载体的宿主细胞，其受体细胞是细菌细胞、酵母菌细胞、丝状真菌细胞、动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。

针对抗BAP31单域抗体在检测BAP31中的应用，采用免疫荧光法、酶联免疫吸附法、亲和层析法和免疫芯片法等对BAP31进行检测。

针对抗BAP31单域抗体在制备BAP31治疗性抗体药物中的应用，优选在抗肿瘤抗体药物中的应用。

针对抗BAP31单域抗体制备检测BAP31的试剂或试剂盒中的应用，所述检测BAP31的试剂或检测BAP31的试剂盒里含有BAP31的单域抗体。

本发明的有益效果为：

本发明首先以化学合成法合成BAP31特定区域，然后将BAP31多肽偶联在固相载体上，从人源噬菌体单域抗体库筛选与BAP31特异性结合的单域抗体，获得表达抗体的特定基因，将此基因连接到酵母表达载体中，转染毕赤酵母，筛选获得能够在毕赤酵母中高效表达的单域抗体株，本发明针对BAP31，在研发BAP31治疗性抗体，优选抗肿瘤抗体治疗中具有巨大潜力。

附图说明

图1为以BAP31为抗原，ELISA检测从人源噬菌体单域抗体库筛选获得的单域抗体与BAP31的结合情况。

图2为本发明抗体VH-F12在细胞内与BAP31的结合情况。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：针对BAP31单域抗体的筛选

利用人源噬菌体单域抗体库，以BAP31为抗原，从抗体库进行3轮筛选，每轮筛选按照“吸附-洗脱-扩增”的步骤进行。

1.BAP31化学多肽的合成

化学合成法合成含有43个氨基酸的BAP31多肽，其氨基酸区域为BAP31(164-206aa)。所合成多肽纯度>98.00％。

2.单克隆噬菌体抗体的筛选

(1)辅助噬菌体的扩增：将冻存的TG1菌在M9平板上划线复苏，培养36h后，挑取单菌落进行过夜培养。第二天稀释到5mL 2×TY培养基中，在37℃、250rpm的条件下培养至OD600＝0.5。吸取10μL的KM13原液进行系列稀释。加入42℃的H-top琼脂，混合均匀后，倒在无抗生素的TYE平板上，37℃培养过夜。第二天从双层平板上挑取单个噬菌斑，加入到5mL OD600＝0.5的TG1菌中，37℃、250rpm培养2h。加入到500mL 2×TY培养基中，37℃、250rpm继续培养1h，加入50μg/mL的Kan，30℃、250rpm培养过夜。将过夜的菌液10800g离心15min，弃沉淀，将上清加入体积比例为1/4的PEG/NaCl溶液中，冰上静置1h。10800g离心30min，弃上清。用8mL PBS重悬沉淀，加入2mL PEG/NaCl，冰上静置20min，3300g，离心30min，弃上清；用5mL的PBS重悬沉淀，11600g离心10min，将上清过0.45μm的滤膜，获得扩增的辅助噬菌体。

(2)VH单域抗体库的扩增：将冻存的噬菌体抗体库置于冰上融化，吸取400μL加入到预热的200mL的2×TY中，加入1％Glu和1％Amp。在37℃、250rpm的条件下培养至OD600＝0.4。取50mL的菌液加入2×10¹¹KM13辅助噬菌体，水浴37℃孵育30min。3000g离心10min弃上清，用100mL 2×TY重悬沉淀，添加100μg/mL Amp和50μg/mL Kan，30℃、250rpm培养过夜。第二天将过夜的菌液3300g离心30min，弃沉淀，将上清中加入体积比例为1/4的PEG/NaCl，冰上静置1h。3300g离心30min，弃上清；用4mLPBS重悬沉淀，11600g离心10min，去沉淀。

(3)抗BAP31单域抗体的筛选：抗体库为噬菌体表面呈现的人源单域抗体库，扩增后库容为1×10¹³。化学合成BAP31(164-206aa)作为抗原，以100μg/mL包被至抗原免疫管，按“吸附-洗脱-扩增”程序进行特异性抗体的筛选。噬菌体单域抗体库第一轮筛选具体过程如下：将4mL浓度为100μg/mL的抗原包被在免疫管中，置于4℃过夜。将免疫管用PBS洗3次，加入2％MPBS室温封闭2h。PBS洗3次，加入4mL含有10¹²个噬菌体文库的2％MPBS，室温孵育2h。用PBST洗10次，加入500μL Trypsin溶液(1mg/mL)，室温放置于摇床上洗脱10min。取出250μL噬菌体洗脱液，加入到1.75mL的OD600＝0.4的TG1菌液中，37℃水浴30min。将菌液按系列梯度进行稀释(10²、10³···10⁶)，取10μL稀释的菌液点在TYE平板上(含有1％Glu和1％Amp)，每组3个平行。将剩余的TG1菌液11600g离心5min。弃上清，沉淀用50μL 2×TY重悬，涂在TYE平板上，37℃培养过夜，作为第二轮筛选的噬菌体文库。将涂在TYE平板上的菌液用含有15％甘油的2mL 2×TY刮下来，取出50μL加入到50mL 2×TY中，含有100μg/mL Amp和1％Glu。37℃摇床上培养1-2h至菌液OD600＝0.4。取出10mL菌液，加入5×10¹⁰个KM13辅助噬菌体，37℃水浴孵育30min。将菌液3000g离心10min，用50mL 2×TY重悬沉淀，加入100μg/mL Amp、50μg/mL Kan和0.1％Glu，30℃，250rpm过夜培养。第二天将噬菌体文库进行PEG沉淀。第2、3轮过程与第1轮过程相同。

(4)ELISA法检测筛选抗体与BAP31的结合：筛选3轮后，在第3轮的TYE平板上随机挑取单菌落进行培养，37℃过夜培养后离心收集上清检测抗体活性，具体过程如下：将圆底96孔板中加入含有100μg/mL Amp和1％Glu的2×TY培养基，挑取第3轮的单菌落于96孔板中，37℃，250rpm过夜培养。取新的96孔板，加入200μL 2×TY培养基，含有100μg/mL Amp和0.1％Glu。吸出过夜培养的菌液5μL接种于新的96孔板中(每孔3个平行)，37℃、250rpm培养3h。加入25μL含有9mM IPTG、100μg/mL Amp的2×TY培养基，30℃、250rpm培养过夜。将100μL浓度为50μg/mL的抗原包被在96孔板中，以50μg/mL的BSA作为空白对照，置于4℃过夜。将96孔板用PBS洗3次，加入2％MPBS室温封闭2h。用PBS洗3次96孔板，将过夜的菌液离心10min，吸取上清25μL加入75μL含有3％BSA的PBS，将100μL混合液加入到96孔板中，室温孵育1h。用PBST洗5次，每次振荡10s。加入抗myc单克隆抗体(1:5000用2％MPBS稀释)，室温轻轻摇动孵育1h。用PBST洗5次，每次振荡10s。加入100μL辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(1:10000用2％MPBS稀释)，室温轻轻摇动孵育1h。用PBST洗3次，用PBS洗1次。加入50μL TMB溶液显色，用等体积的1M H2SO4终止反应。波长450nm和650nm测定吸光度，数值＝OD450nm-OD650nm，BSA作为空白对照。

30个克隆进行ELISA检测，共有7个阳性克隆可以与BAP31特异性结合(结果见图1)。

实施例2：阳性克隆DNA序列测定及单域抗体DNA序列分析

将7个阳性克隆进行测序分析，6个测序成功，通过VBASE2基因库进行比对，发现6个克隆包含2个不同的序列。其中2个序列有3次重复。选取测序成功序列之一VH-F12克隆至pPIC9酵母表达质粒，并转化到毕赤酵母GS115进行可溶性表达。VH-F12的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID：NO.7和SEQ ID：NO.8。

实施例3：抗BAP31单域抗体的表达和纯化

分别提取PIT2-BAP31-VH-F12重组质粒和pPIC9质粒，以PIT2-BAP31-VH-F12为模板PCR，进行目的片段VH-F12的扩增，使用EcoR I和Xho I进行双酶切，胶回收目的片段和酶切载体后，使用T4DNA连接酶连接目的基因片段和载体。乙醇沉淀DNA；将5-20μg的DNA线性化电转化至毕赤酵母GS115。选择转化子进行基因测序，挑取阳性克隆培养，每24h向培养基中加入甲醇诱导蛋白分泌表达。将诱导后的菌液12000g离心取上清，使用Ni柱亲和层析纯化His-VH-F12-HA重组蛋白。

得到的单域抗体产品真空冷冻干燥后，可以分装保存。

实施例4：单域抗体与抗原结合特异性检测

免疫荧光观察BAP31与单域抗体VH-F12在细胞内的共定位情况。S5作为阴性对照是以MDM2为抗原，从噬菌体单域抗体库筛选的单域抗体。将抗体基因VH-F12连接至真核表达质粒pcDNA3.1(-),转染胃癌细胞MKN-45，绿色荧光表征VH-F12在细胞内的表达情况，红色荧光表征BAP31在细胞内的表达，黄色表示VH-F12与BAP31的共定位情况，结果如图2所示，抗体VH-F12可以在细胞内稳定表达，且与BAP31在细胞内共定位。

以上所述为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换，改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 东北大学

<120> 一种抗BAP31单域抗体及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 1

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc c 81

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 2

atgggctggg tccgccaggc tccagggaag ggtctagagt gggtatcaag c 51

<210> 3

<211> 114

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 3

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 60

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgc 114

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 4

ggatttatga ttagcgataa gatt 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 5

attgataaca atgacggtag caca 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 6

gcgactagtg cgccgggtat tgtg 24

<210> 7

<211> 438

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 7

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggatttatg attagcgata agattatggg ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaagcattg ataacaatga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgact 300

agtgcgccgg gtattgtgca gccggagtcc gacgagctgc cgttttgggg tcagggaacc 360

ctggtcaccg tctcgtaccc atacgacgtc ccagactacg atgttccaga ttatgctagc 420

gagaaggacg agctgtaa 438

<210> 8

<211> 145

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 8

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Ile Ser

20 25 30

Asp Lys Ile Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ser Ile Asp Asn Asn Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Thr Ser Ala Pro Gly Ile Val Gln Pro Glu Ser Asp Glu

100 105 110

Leu Pro Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Tyr Pro Tyr

115 120 125

Asp Val Pro Asp Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Glu Lys Asp Glu

130 135 140

Leu

145

<210> 9

<211> 43

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 9

Asp Gly Gly Lys Leu Asp Val Gly Asn Ala Glu Val Lys Leu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Asn Arg Ser Leu Lys Ala Asp Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu Leu

20 25 30

Ala Ser Thr Lys Gln Lys Leu Glu Lys Ala Glu

35 40