特异结合DDX24解旋酶的多肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一系列特异性结合DDX24解旋酶的多肽及其应用。

背景技术：

DDX24是一种ATP依赖的RNA 解旋酶，由DDX24基因所编辑，它属于DDX蛋白家族。该家族的蛋白涉及RNA二级结构改变的细胞过程，如蛋白翻译启动，线粒体RNA的剪切，以及核糖体和剪接体的组装过程 (Staley and Guthrie 1998, Cell 92: 315-325; Berthelot, Muldoon et al， 2004 Molecular Microbiology 51(4): 987-1001; Linder 2006,Gene & Development 19: 2122-2137)。DDX24在人类多种癌细胞中过表达。还有文章指出DDX24与多脏器静脉、淋巴管畸形的联系，提示DDX24在内皮细胞中的重要作用，参与血管畸形的形成 (Pang, Hu et al， 2019, Hepatology 69(2): 803-816)。因此，找出特异性结合DDX24解旋酶的探针对于了解DDX24在疾病发生发展过程中的作用，进而应用于疾病的早期检测、分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。

目前研究表明， DDX24可能是抑癌基因p53的一种负调控分子(Shi, Dai et al，2016, Oncogene 35(4): 528-536)。DDX24通过抑制p300介导的p53乙酰化，进而促进p53介导的转录靶点p21，上调凋亡调节剂(PUMA)的激活。,DDX24在人类乳腺癌细胞中过表达，如果以RNA干扰导致DDX24蛋白水平降低，会使细胞周期阻滞和衰老，而且这种作用呈p53依赖性 (Shi, Dai et al， 2016, Oncogene 35(4): 528-536)。这些结果表明，DDX24和p53在病变细胞中可能有密切的相互作用，并且这种相互作用对疾病的发生发展有重要影响。根据以上的一些背景，我们设计了具有高度特异性结合DDX24解旋酶的系列多肽。本专利首次发现衍生于p53转录活性区域的多肽 (Kussie, Gorina et al. 1996, Science 274: 948-953)可以在体外直接结合重组的DDX24蛋白。此外，我们首次发现磷酸化修饰的基于p53的多肽 (Feng, Jenkins et al. 2009, Structure 17(2): 202-210) 也可以可以用来特异性识别DDX24解旋酶。另外我们首次测试发现由噬菌体展示实验针对Mdm2/Mdmx-p53 筛选出的多肽（Hu, Gilkes et al. 2007, Cancer Res 67(18): 8810-8817）可以用来特异性识别DDX24解旋酶。。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种具有高度特异性结合DDX24解旋酶的多肽及其应用，该多肽能特异性识别DDX24解旋酶。

特异性识别DDX24解旋酶的多肽，所述多肽的氨基酸序列包括如下所示的特征序列部分：

1.氮端-SQETFSDLWKLLPEN-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸；

2.氮端-S(p)QET(p)FSDLWKLLPEN-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，（p)代表S或者T的羟基被磷酸化修饰；

3.氮端-LTFEHYWAQLTS-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸；

4.氮端-SGQHSHGYDDCWHQP-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，这一序列的多肽具有和上述1-3相同长度， 在实验中做为阴性对照。

进一步的，所述肿瘤细胞选自DDX24 高表达的SMMC-7721肝癌细胞株。

所述p53多肽衍生于p53蛋白转录活性区域，通过常规多肽化学合成或者特异化学修饰得到。所述p53多肽可以结合、封闭、拮抗DDX24解旋酶。所述p53多肽经过化学发光、荧光、核素等标记，应用于制备DDX24解旋酶相关的药物或检测试剂中。

本发明的有益效果在于：本发明的多肽能特异性识别DDX24解旋酶，对于了解DDX24在疾病发生发展过程中的作用，进而应用于疾病的早期检测、分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。

本发明还包括将上述p53多肽应用于设计、制备与DDX24相关疾病的药物或检测试剂中。

附图说明

图1：对上述荧光标记多肽序列以SPR表面等离子共振分析技术测定体外与DDX24的结合力。测试条件：pH：10 mM Acetate 5.5，流速：10μl/min，流速：30μl/min， 多肽浓度：0.78125/1.5625/6.25/12.5/25/50μg/ml，结合时间：120 s，解离时间：120 s。结果显示：多肽1的Kd = 7.15 + 3.6μM，多肽2的Kd = 1.83 + 0.2μM，多肽3的Kd= 0.069 + 0.03μM，而对比多肽4无可测量的结合活性。

图2：2A图中1-3多肽及对照多肽4标绿色FITC荧光。在96黑色荧光孔板内接种SMCC-7721细胞（标记为DDX24H）97L细胞（标记为DDX24L）。用细胞培养液将实验多肽1-3与对照多肽4稀释至终浓度10 μM，孵育及洗脱后荧光检测仪读取细胞内特异结合多肽的信号（EM：528， EX：485）。结果显示，1-3多肽与对照多肽4对比，活细胞内摄取1-3多肽的量明显多于对照多肽4。DDX24高表达的SMMC-7721细胞与DDX24低表达的97L细胞对比，DDX24高表达的SMMC-7721细胞内摄取的1-3多肽明显多于DDX24低表达的97L细胞。2B、2C图中对96孔板内细胞冰上孵育30 min，再次读数荧光信号以观察和37℃孵育结合情况下的区别。读数后，细胞重新放回37℃孵育2个小时，再次读取荧光信号。 结果显示，SMMC-7721细胞（DDX24H）的荧光强度变化较97L细胞（DDX24L）更为明显，表现在低温环境时荧光强度增高，而恢复37℃时荧光强度又降低。

图3：在SMCC-7721细胞选择标上绿色荧光（FITC）多肽3，加入40μM（终浓度）所述多肽3的培养液中，于37ºC孵育 4 h，0.1%BSA/PBS洗板三次，每次5分钟，后分别在37ºC或者4ºC固定（4%多聚甲醛）30分钟。然后洗板，室温封闭（3%BSA、PBS）30分钟，孵育DDX24抗体（ThermoFisher, PA5-51721），及红色荧光二抗（ThermoFisher, A21428），室温避光孵育1小时，并DAPI染核。最后荧光显微镜下观察并采集图像。结果显示：多肽3与细胞内DDX24结合后显示的相转移现象（黄色箭头表示的核内或者胞内颗粒状聚集在4ºC更加明显）与用DDX24特异性抗体染色结果完全一致。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详细予以说明。

本发明实施例为：一种可以特异性结合DDX24解旋酶的p53多肽及其应用，所述p53多肽的序列包括：

1.氮端-SQETFSDLWKLLPEN-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸；

2.氮端-S(p)QET(p)FSDLWKLLPEN-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，（p)代表S或者T的羟基被磷酸化修饰；

3.氮端-LTFEHYWAQLTS-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸；

4.氮端-SGQHSHGYDDCWHQP-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，这一序列的多肽具有和上述1-3相同长度， 在实验中做为阴性对照。

具体实施方式1：多肽直接结合DDX24重组蛋白 （SPR 体外结合实验）。

DDX24蛋白的纯化：为了体外获得重组的DDX24蛋白，装有DDX24基因（28-859aa， 基于57062 Pubmed 序列文库号）经Bamh I和Hind III酶切位点连接到pSumo载体，在DH5α菌获得重组质粒，经测序验证无误，转入表达菌：BL21（DE3）进行蛋白纯化。将质粒转化至BL21(DE3)，37度200转摇至吸光度0.6-0.8，加入终浓度0.1mM IPTG（索莱宝，SBJ-F2160），16度诱导表达，4度/5000g/15分钟收菌，每升培养基用30毫升A液重悬。高压低温破碎仪（JNBIO，JN-mini）破菌，14000g/35分钟/4度收菌，取上清液用镍柱（南京森贝伽生物科技有限公司，SBJ-FL2160）纯化，B液洗脱。洗脱蛋白加ulp1酶切16小时/4度，C液透析（索莱宝，ya1043透析袋）过夜。透析蛋白反挂镍柱（南京森贝伽生物科技有限公司，货号SBJ-FL2160），收集流穿， 流穿液超滤浓缩（Millipore，货号UFC903096）后过HiLoad 16/600 superdex 200 prep grade柱子（GE，货号28-9920-17AC），D液洗脱，收集目的蛋白，浓缩后冻干（冻干设备厂家：广州智祥生物科技有限公司，型号：TF-LFD-1）。其中溶液A: 50 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazole；B: 50 mM Tris-HCl pH8.0, 500mM NaCl, 300 mM Imidazole； C: 50 mM Tris-HCl pH8.0, 150mM NaCl；D: PBS。最后，通常情况下抽提蛋白的产率为10升表达菌液，可以获得90%纯度DDX24蛋白0.1mg。

对上述荧光标记多肽序列以SPR表面等离子共振分析技术测定体外与DDX24的结合力。SPR结合分析：在Biacore T200仪器上测定DDX24与多肽的离解常数(Kd)。利用生物素(Pierce)对靶肽进行生物素化处理。传感器芯片SA表面结合链霉亲和素，进行条件调节，然后将生物素化的多肽固定在表面。将DDX24注入传感器芯片。然后根据蛋白浓度绘制平衡结合条件下的最大响应，以确定Kd值。测试条件：pH：10 mM Acetate 5.5，流速：10 μl/min，流速：30 μl/min， 多肽浓度：0.78125/1.5625/6.25/12.5/25/50μg/ml，结合时间：120 s，解离时间：120 s。结果为图1所示，多肽1的Kd= 7.15 + 3.6μM，多肽2的Kd= 1.83 + 0.2μM，多肽3的Kd= 0.069 + 0.03μM，而对比多肽4无可测量的结合。结果表明，多肽1-3在体外能特异性结合DDX24。

具体实施方式2：多肽与DDX24高表达活细胞选择性结合 （活细胞荧光结合实验）。

为了进一步验证所列多肽能够在活细胞结合胞内DDX24，所述1-3多肽及对照多肽4标上绿色FITC荧光（上海波泰公司合成）。在96孔黑色荧光板内（Corning公司，354640）接种每孔相同数量（1×10⁵）的DDX24 高表达的SMCC-7721细胞（标记为DDX24H），和DDX24 低表达97L细胞（标记为DDX24L）。用细胞培养液将实验多肽1-3与对照多肽4稀释至相同终浓度（10 μM），每个相同浓度重复2孔，加样后荧光读取机（Synergy HTX公司）测量各孔总荧光强度（EM：528， EX：485）确定每孔总荧光信号持平，记录后，放入37ºC培养箱孵育12小时。然后吸去含多肽的培养液，用不含多肽的新鲜培养液轻轻浸洗细胞2次，每次5min，最后荧光检测仪读取细胞内特异结合多肽的信号（EM：528， EX：485）。实验结果如图2A所示，1-3多肽与对照多肽4对比，活细胞内摄取1-3多肽的量明显多于对照多肽4。DDX24高表达的SMMC-7721细胞与DDX24低表达的97L细胞对比，DDX24高表达的SMMC-7721细胞内摄取的1-3多肽明显多于DDX24低表达的97L细胞。

为了进一步验证DDX24家族蛋白易产生的胞内相转移，且低温促进其相转移现象的特性 (Nott, Petsalaki et al. 2015, Mol Cell 57(5): 936-947), 对96孔板内细胞冰上孵育30 分钟，再次读数荧光信号以观察和37℃孵育结合情况下的区别。读完数据后，细胞重新放回37℃孵育2个小时，再次读取荧光信号。 实验结果如图 2 B，C 所示， SMMC-7721细胞（DDX24H）的荧光强度变化较97L细胞（DDX24L）更为明显，表现在低温环境时荧光强度增高，而恢复37℃时荧光强度又降低。提示特异结合的多肽1-3示踪的荧光信号可以准确反映细胞内的DDX24在低温时易于出现相转移的独特生物物理性质。

具体实施方式3：多肽与DDX24高表达细胞选择性结合（免疫荧光）。

为了进一步验证上述多肽能否特异结合活细胞内DDX24，利用DDX24高表达的肝癌细胞进行多肽细胞结合实验。在所述多肽标上绿色荧光（FITC），取DDX24 高表达SMCC 7721细胞 （1×10⁵/well, 8孔腔室玻片（ThermoFisher，154941），加入40μM终浓度所述多肽3的培养液中，然后用0.1%BSA/PBS 溶液洗脱 3 次，每次 5分钟。然后加入4%多聚甲醛于37ºC 或者4ºC 固定30 分钟。洗脱后用3% BSA/PBS溶液封闭30分钟。滴加DDX24抗体（ThermoFisher, PA5-51721），4℃湿盒内孵育过夜。洗脱后滴加红色荧光二抗（ThermoFisher, A21428），室温避光孵育1小时。洗脱后向玻片上滴加DAPI，避光孵育5分钟。在荧光显微镜下观察并采集图像。 如图3所示，通过观察发现本发明多肽3（本实施例用多肽3， 但本发明实施不仅限于多肽3）与细胞内DDX24结合后显示的相转移现象（黄色箭头表示的核内或者胞内颗粒状聚集在4ºC更加明显）与用DDX24特异性抗体染色结果完全一致。