一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其在检测试剂盒方面的应用。
背景技术：
：炎症性肠病（InflammatoryBowelDisease，IBD），是一种具有自身免疫病特征的慢性肠道炎症性疾病，包括克隆恩氏病（Crohn病）和溃疡性结肠炎。炎症性肠病的症状严重影响消化道功能，有疼痛，腹泻，便血等主要症状，肠道组织有炎症病灶，溃疡，严重时有肠道穿孔。炎症性肠病难治愈，有反复发作的特点，并有癌变的风险。炎症性肠病常见于西方国家，近年来在国内的发病率呈现上升趋势。克隆恩氏病是一种慢性的、反复发作的肠道性疾病，发病部位可以从口腔到肛门整个胃肠道的任何部分，晚期回肠和结肠是受影响最多的区域。这种疾病通常表现有腹痛、能量损失、体重减轻、盗汗、口腔溃疡和关节疼痛等。克隆恩氏病发病的机制与病因一直不明确，与遗传、免疫、肠道微生态等均有关联。对于克隆恩氏病的诊断目前主要依靠临床表现、实验室常规检测、放射性检查、内镜及病理学检查等手段，其中内镜及病理学检查是临床主要的诊断依据。由于非IBD炎性肠病与IBD的许多临床表现和病理变化相似，内镜及病理学检查常难以确诊，且内镜及病理学检查操作复杂，属于有创性，因此存在一定的局限性。而对非IBD炎性肠病与IBD的治疗方法不同，预后也不一样，所以需要更特异的方法加以鉴别。此外，对于IBD中的溃疡性结肠炎与克隆恩氏病，目前临床诊断方法也存在一定的鉴别困难。鉴于此，建立一种简单、无创、经济、快速、价廉的方法来进行克隆恩氏病的诊断具有重要的临床价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其试剂盒，其中包括特异性结合克隆恩氏病血清抗体的多肽。本发明提供的的多肽对临床诊断为克隆恩氏病患者血清的结合显著高于对溃疡性结肠炎患者血清免疫球蛋白或健康人血清免疫球蛋白的结合，且本发明提供的试剂盒在检测克隆恩氏病血清抗体方面具有简单、无创、经济、快速、价廉、灵敏、特异性高的特点。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽，所述多肽包含SEQIDNo.1-16中所示的氨基酸序列中的一种或多种。优选的，所述多肽为SEQIDNo.2-16中所示的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列.优选的，所述克隆恩氏病血清抗体包括免疫球蛋白A抗体和/或免疫球蛋白G抗体。一种检测克隆恩氏病血清抗体的试剂盒，包括所述多肽。优选的，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒、免疫比浊法试剂盒、胶体金法试剂盒或免疫化学发光法试剂盒。优选的，所述酶联免疫试剂盒还包括酶标板、PBST洗涤缓冲液、样品稀释液、酶标二抗、PBST洗涤缓冲液、TMB显色液和硫酸终止液。本发明提供的多肽不仅能够与克隆恩氏病患者血清的抗体特异性结合，该多肽序列具有特殊而稳定的β－转角结构，并且该多肽位于三级结构的边缘位置，能够实现稳定结合，敏感性高。本发明提供的的多肽序列对临床诊断为克隆恩氏病患者血清的结合显著高于对溃疡性结肠炎患者血清免疫球蛋白或健康人血清免疫球蛋白的结合。并且本发明建立了检测克隆恩氏病患者血清抗体定量检测试剂与克隆恩氏病患者血清抗体检测试剂（酿酒酵母菌多糖抗原和大肠杆菌鞭毛蛋白CBir抗原）的联合检测方法，对于克隆恩氏病的诊断更具有临床意义。附图说明图1诺卡菌MCE蛋白与分枝杆菌MFS蛋白序列比对图。图2本发明的试剂盒检测克隆恩氏病血清抗体标准品的标准曲线。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的方案进行清楚完整的描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未知名生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1我们对分支杆菌转运蛋白（majorfacilitatorsuperfamily，MFS）和诺卡菌哺乳动物进入蛋白（Mammaliancellentryprotein，MCE）进行序列分析。根据图1所示的序列比对结果显示，诺卡菌MCE蛋白与分支杆菌MFS蛋白具有一段保守的序列，并通过人工合成的方法得到了这段保守区的氨基酸序列：IRGLFPN，该人工合成方法为常规的固相合成法。我们通过序列比对及结构预测结果得到的这个7肽符合β－转角这种特殊而稳定的结构表1.氨基酸极性分析结果对诺卡菌MCE蛋白与分枝杆菌MFS蛋白的保守序列7肽进行极性分析。表1a诺卡菌MCE蛋白MIRGLFPNMIRGLFPN蛋氨酸异亮氨酸精氨酸甘氨酸亮氨酸苯丙氨酸脯氨酸天冬酰胺极性、中性非极性、疏水碱性非极性、疏水非极性、疏水非极性、疏水非极性、疏水极性、中性表1b分枝杆菌MFS蛋白LIRGLFPNLIRGLFPN亮氨酸异亮氨酸精氨酸甘氨酸亮氨酸苯丙氨酸脯氨酸天冬酰胺非极性、疏水非极性、疏水碱性非极性、疏水非极性、疏水非极性、疏水非极性、疏水极性、中性根据诺卡菌MCE蛋白和分枝杆菌MFS蛋白三级结构预测结果显示，7肽的位置位于边缘无规则卷曲部位。将MCE蛋白与MFS蛋白靠近7肽附近的50个氨基酸进行二级结构预测，结果发现在7肽附近都有抗体结合位点。根据上述研究结果，发明人以具有克隆恩氏病血清抗体特异结合的多肽作为固定相，构建了能够选择性检测克隆恩氏病患者血清抗体的试剂盒，实现了对克隆恩氏病患者血清中抗体定性及定量的检测。实施例2制备酶联免疫试剂盒（1）试剂的准备：标准品：6个不同浓度的标准品溶液，标准品A为100U/mL、标准品B为50U/mL、标准品C为25U/mL、标准品D为12.5U/mL、标准品E为6.25U/mL、标准品F为0U/mL。对照品：需配置浓度为50-60U/ml的阳性对照品和浓度为5-10U/ml的阴性对照品。样品稀释液：按照一定比例将0.2M的PB缓冲液（PH=6.0±0.2）、NaCl、NH4Cl、酪蛋白、20%Tween-20、Triton-X100、灭活胎牛血清充分溶于水。1*PBST洗涤缓冲液:pH值为7.4，其中包括80mmol/L的Na2HPO4、20mmol/L的KH2PO4、100mmol/L的KCl、1400mmol/L的NaCl、体积分数为0.05%的Tween-20。TMB显色液：底物显色A液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30%双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml；底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，取0.15gTMB溶于30mlDMSO中，蒸馏水加至500ml，使用时，取底物显色A液与底物显色B液等体积混合，即得TMB显色液。硫酸终止液：配置浓度为2M的稀硫酸溶液。酶标二抗：用辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG和/或IgA抗体。封板膜：为耐思PCR封板膜。（2）包被多肽酶标板：配制含有多肽的包被液，在96孔酶标板的每孔内加100µL，置4℃，16～18h。弃去包被液，每孔加入300µL1×清洗液，静置2min后甩掉孔内溶液并拍干；每孔加入200µL封闭液，25℃恒温培养箱内静置1.5h；弃去封闭液后，每孔加入300µL1×清洗液，静置2分钟后甩掉孔内液体并拍干；置25℃鼓风干燥箱内干燥5h。（3）分装：取1*PBST洗涤缓冲液、标准品、对照品、样品稀释液、酶标二抗、TMB显色液、硫酸终止液和包被多肽的酶标板分别独立包装，即得。实施例3检测样品和绘制标准曲线用实施例1制备的酶联免疫试剂盒（1）加样：于微孔板中加入100µL不同浓度标准品及病人血清样品。标准品的浓度分别为100U/mL、50U/mL、25U/mL、12.5U/mL、6.25U/mL、0U/mL。（2）孵育：用封板膜封板后于室温（20℃-28℃）静置孵育30分钟。（3）洗涤：揭掉封板膜，弃去孔内液体，甩干后加入洗涤液，每孔300uL，静置2min后弃去孔内液体，重复3次。（4）加酶标二抗：每孔加入稀释好的酶标二抗液100µL。（5）孵育：操作同（4）。（6）洗涤：操作同（5）。（7）显色：将显色A液和B液按1：1比例混匀，得到TMB显色液，每孔加入100µL，室温避光静置15分钟。（8）终止：每孔加入终止液50µL，轻震混匀以终止反应。病人血清样品孔中颜色由蓝色变为黄色。（9）测定：在单波长450nm或双波长450/630nm下依序测量各孔的OD值。根据标准品的浓度：100U/mL、50U/mL、25U/mL、12.5U/mL、6.25U/mL、0U/mL。计算每个浓度标准品双复孔OD值的平均值，以标准品的浓度（U/mL）为横坐标，对应的OD值为纵坐标，使用数据分析软件（Origin8）绘制标准曲线，如图2所示。使用本发明方法和产品完成对大量的无相关疾病的健康人群的血清进行检测。所得到的样品浓度均值＋3SD为阳性判断值（cut-off值）为25U/ml。实施例4多肽抗原的特异性检测将人工合成的7肽做固定相，检测了129例临床诊断为克隆恩氏病，130例溃疡性结肠炎和200例正常人血清样本。判定克隆恩氏病和溃疡性结肠炎患者血清中是否存在结合肽段免疫球蛋白的方法是根据对正常人血清样本的测定，先计算出正常人群血清样本与固定在多孔板孔内肽段的免疫球蛋白的基础值，再根据基础值来确定患者血清中与肽段结合的抗体的量是否显著增加。在实验的三组血清样本中，该多肽特异性结合临床诊断为克隆恩氏病患者血清抗体。检测结果发现这个含有7个氨基酸的多肽片段能选择性识别克隆恩氏病患者血清免疫球蛋白A和免疫球蛋白G，而且不与临床诊断为溃疡性结肠炎或正常人血清样本中的免疫球蛋白结合。表2多肽抗原的敏感性、特异性实验结果实施例5建立多肽抗原与ASCA的联合检测多肽与ASCA联合检测了129例临床诊断为克隆恩氏病样本和200例正常人血清样本。具体方法是：将多肽与ASCA分别进行检测，最后根据两者的数据结果进行联合判定，两者中只要有一项超出判定值，即可判定为克罗恩氏病，其目的是提高克罗恩氏病检测的敏感性。该联合检测的方法还可以是制备成联合检测试剂盒，所述联合检测试剂盒包括多肽和抗原，该抗原是酿酒酵母菌多糖抗原和大肠杆菌鞭毛蛋白CBir抗原。表3多肽与ASCA联合检测结果通过检测结果可以得知，本发明提供的多肽的特异性最高，多肽与ASCA的联合检测，显著提高了临床诊断的敏感性，这对于克隆恩氏病的诊断更具有临床意义。以上所述，仅是本发明较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。。序列表<110>山西瑞豪生物科技有限公司<120>一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其应用<141>2019-05-15<160>16<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列()<400>1IleArgGlyLeuPheProAsn15<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列()<400>2IleArgGlyThrPheAlaAsn15<210>3<211>8<212>PRT<213>人工序列()<400>3MetIleArgGlyLeuPheProAsn15<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列()<400>4IleArgGlyLeuPheProAsnPro15<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列()<400>5AlaMetIleArgGlyLeuPheProAsn15<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列()<400>6IleArgGlyLeuPheProAsnProGln15<210>7<211>10<212>PRT<213>人工序列()<400>7AspAlaMetIleArgGlyLeuPheProAsn1510<210>8<211>10<212>PRT<213>人工序列()<400>8IleArgGlyLeuPheProAsnProGlnGlu1510<210>9<211>8<212>PRT<213>人工序列()<400>9LeuIleArgGlyLeuPheProAsn15<210>10<211>8<212>PRT<213>人工序列()<400>10IleArgGlyLeuPheProAsnGly15<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列()<400>11AlaLeuIleArgGlyLeuPheProAsn15<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列()<400>12IleArgGlyLeuPheProAsnGlyArg15<210>13<211>10<212>PRT<213>人工序列()<400>13LeuAlaLeuIleArgGlyLeuPheProAsn1510<210>14<211>10<212>PRT<213>人工序列()<400>14IleArgGlyLeuPheProAsnGlyArgGlu1510<210>15<211>14<212>PRT<213>人工序列()<400>15IleArgGlyLeuPheProAsnIleArgGlyLeuPheProAsn1510<210>16<211>21<212>PRT<213>人工序列()<400>16IleArgGlyLeuPheProAsnIleArgGlyLeuPheProAsnIleArg151015GlyLeuPheProAsn20当前第1页1 2 3