一种RGD环肽合成方法与流程

本发明涉及环肽合成方法，具体涉及一种RGD环肽合成方法。

背景技术：

RGD序列是细胞外基质与整合素的通用识别位点，可增加肽的生物稳定性。RGD序列肽具有广泛的生物活性，可用于心血管疾病、骨质疏松和炎症等疾病的治疗，还可以预防和治疗由细胞粘附异常而导致的肿瘤，尤其是发展性肿瘤的转移；另一方面，RGD序列肽又可作为兴奋剂，促进损伤的器官与组织的再生、伤口的愈合等等，RGD作为某些整合素的受体，其选择性部分依赖于RGD的构象以及RGD周围的氨基酸残基。传统的液相成环合成方法，合成过程中需要添加缩合试剂，而缩合试剂会带来副产物及杂质，产品收益率低，成本高。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种RGD环肽合成方法，其操作简单，产品纯净，收益率高，消旋率低。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种RGD环肽合成方法，包括以下步骤：

S1，获取全保护直链肽

1)以Mtt-Lys(Boc)-OH为起始原料，使用活化试剂在Mtt-Lys(Boc)-OH的C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-NHS；

2)碱性环境下，在Mtt-Lys(Boc)-NHS中加入氨基酸，使Mtt-Lys(Boc)-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接；

3)将氨基酸的羧基以步骤S1的条件活化形成活化酯，并以步骤S2的条件将下一氨基酸的N端连接到上一氨基酸的C端；

4)以H-D-Phe-OMe为终端原料，按照步骤3)将其N端连接到上一氨基酸的C端，获得全保护直链肽；

S2，获取全保护环肽

将全保护直链肽直链肽旋蒸、冻干后，用加入了TFA的DCM溶解，形成酰胺环，获得全保护环肽，按重量份数计，DCM：TFA＝20：1，而后在50℃的条件下油浴回流过夜，最后将全保护环肽旋干；

S3，切割提纯

5)按重量份数计，以TFA：苯甲硫醚：EDT：苯甲醚＝90：5：3：2配置切割液，并将全保护环肽置入其中切割2小时；

6)用冰乙醚析出，离心得到多肽粗肽，而后再用冰乙醚洗3次，去除部分杂质，减压抽干，最后用HPLC纯化得到纯品。

作为优选的，步骤S2中，获取全保护环肽的方法包括以下步骤：

将全保护直链肽旋蒸、冻干后，用加入了TFA的DCM溶解，TFA在去掉N端Mtt裸露氨酸的同时，能够催化C端甲酯与氨基的反应，形成酰胺环，获得全保护环肽，按重量份数计，DCM：TFA＝20：1，每mmol全保护直链肽溶解在0.5L溶剂中，而后在50℃的条件下油浴回流过夜，最后将全保护环肽减压旋干。

作为优选的，步骤1)中，包括以下步骤：

将原料、活化试剂HOSU和活化试剂DCC以1：1.01：1.02的重量份数在DCM中反应过夜，合原料的C端形成活化酯，而后抽滤去掉不溶物，并将溶液减压旋干。

作为优选的，步骤2)中，包括以下步骤：

在碱性环境下，以DCM为溶剂，将步骤1)中的产物与新原料以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使上一步的产物的活化酯与新原料的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到片段，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干。

作为优选的，包括以下步骤：

S1，获取全保护直链肽Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-D-Phe-OMe

1)以Mtt-Lys(Boc)-OH为起始原料，与活化试剂HOSU和DCC以1：1.01：1.02在DCM中反应过夜，使Mtt-Lys(Boc)-OH在C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-NHS，而后抽滤去掉不溶物，溶液减压旋干得到纯净的Mtt-Lys(Boc)-NHS；

2)在碱性环境下，以DCM为溶剂，将Mtt-Lys(Boc)-NHS与NH2-Arg(Pbf)-OH以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使Mtt-Lys(Boc)-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到片段Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-OH，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干；

3)将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-OH与活化试剂HOSU、DCC以1：1.01：1.02在DCM中反应过夜，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-OH在C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-NHS，而后抽滤去掉不溶物，溶液减压旋干得到纯净的Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-NHS；

在碱性环境下，以DCM为溶剂，将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-NHS与NH2-Gly-OH以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到片段Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OH，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干；

将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OH与活化试剂HOSU、DCC以1：1.01：1.02在DCM中反应过夜，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OH在C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-NHS，而后抽滤去掉不溶物，溶液减压旋干得到纯净的Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-NHS；

在碱性环境下，以DCM为溶剂，将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-NHS与NH2-Asp(Otbu)-OH以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到片段Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-OH，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干；

4)将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-OH与活化试剂HOSU、DCC以1：1.01：1.02在DCM中反应过夜，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-OH在C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-NHS，而后抽滤去掉不溶物，溶液减压旋干得到纯净的Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-NHS；

在碱性环境下，以DCM为溶剂，将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-NHS与H-D-Phe-OMe以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到全保护直链肽Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-D-Phe-OMe，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干；

S2，获取全保护环肽

将全保护直链肽Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-D-Phe-OMe旋蒸、冻干后，用加入了TFA的DCM溶解，TFA在去掉N端Mtt裸露氨酸的同时，能够催化C端甲酯与氨基的反应，形成酰胺环，获得全保护环肽，按重量份数计，DCM：TFA＝20：1，每mmol全保护直链肽溶解在0.5L溶剂中，而后在50℃的条件下油浴回流过夜，最后将全保护环肽减压旋干；

S3，切割提纯

5)按重量份数计，以TFA：苯甲硫醚：EDT：苯甲醚＝90：5：3：2配置切割液，并将全保护环肽置入其中切割2小时；

6)用冰乙醚析出，离心得到多肽粗肽，而后再用冰乙醚洗3次，去除部分杂质，减压抽干，最后用HPLC纯化得到纯品的RGD全肽，其结构式如下：。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的合成方法，操作简单，成环过程中不需要缩合试剂，减少了缩合试剂带来的副产物及杂质，产品收率高，消旋率低。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还能够根据这些附图获得其他的附图。

图1为高效液相色谱分析报告；

图2为质谱分析报告。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用型中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本发明公开了一种RGD环肽合成方法，包括以下步骤：

S1，获取全保护直链肽

1)以Mtt-Lys(Boc)-OH为起始原料，使用活化试剂在Mtt-Lys(Boc)-OH的C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-NHS；

2)碱性环境下，在Mtt-Lys(Boc)-NHS中加入氨基酸，使Mtt-Lys(Boc)-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接；

3)将氨基酸的羧基以步骤S1的条件活化形成活化酯，并以步骤S2的条件将下一氨基酸的N端连接到上一氨基酸的C端；

4)以H-D-Phe-OMe为终端原料，按照步骤3)将其N端连接到上一氨基酸的C端，获得全保护直链肽；

S2，获取全保护环肽

将全保护直链肽直链肽旋蒸、冻干后，用加入了TFA的DCM溶解，形成酰胺环，获得全保护环肽，按重量份数计，DCM：TFA＝20：1，而后在50℃的条件下油浴回流过夜，最后将全保护环肽旋干；

S3，切割提纯

5)按重量份数计，以TFA：苯甲硫醚：EDT：苯甲醚＝90：5：3：2配置切割液，并将全保护环肽置入其中切割2小时；

6)用冰乙醚析出，离心得到多肽粗肽，而后再用冰乙醚洗3次，去除部分杂质，减压抽干，最后用HPLC纯化得到纯品。

作为实施例一个优选的实施方式，包括以下步骤：

S1，获取全保护直链肽Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-D-Phe-OMe

4)以Mtt-Lys(Boc)-OH为起始原料，与活化试剂HOSU和DCC以1：1.01：1.02在DCM中反应过夜，使Mtt-Lys(Boc)-OH在C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-NHS，而后抽滤去掉不溶物，溶液减压旋干得到纯净的Mtt-Lys(Boc)-NHS；

5)在碱性环境下，以DCM为溶剂，将Mtt-Lys(Boc)-NHS与NH2-Arg(Pbf)-OH以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使Mtt-Lys(Boc)-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到片段Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-OH，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干；

6)将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-OH与活化试剂HOSU、DCC以1：1.01：1.02在DCM中反应过夜，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-OH在C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-NHS，而后抽滤去掉不溶物，溶液减压旋干得到纯净的Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-NHS；

在碱性环境下，以DCM为溶剂，将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-NHS与NH2-Gly-OH以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到片段Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OH，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干；

将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OH与活化试剂HOSU、DCC以1：1.01：1.02在DCM中反应过夜，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OH在C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-NHS，而后抽滤去掉不溶物，溶液减压旋干得到纯净的Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-NHS；

在碱性环境下，以DCM为溶剂，将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-NHS与NH2-Asp(Otbu)-OH以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到片段Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-OH，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干；

4)将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-OH与活化试剂HOSU、DCC以1：1.01：1.02在DCM中反应过夜，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-OH在C端形成活化酯，获得Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-NHS，而后抽滤去掉不溶物，溶液减压旋干得到纯净的Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-NHS；

在碱性环境下，以DCM为溶剂，将Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-NHS与H-D-Phe-OMe以1：1溶解，滴加PH为8的TEA反应4小时，使Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-NHS的活化酯与氨基酸的N端的氨基反应，并形成连接，HPLC液相分析为单主峰，减压旋干后得到全保护直链肽Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-D-Phe-OMe，而后将其加入乙醚搅拌成浊状物，布氏漏斗抽滤，乙醚洗两遍去掉杂质，抽干；

S2，获取全保护环肽

将全保护直链肽Mtt-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(Otbu)-D-Phe-OMe旋蒸、冻干后，用加入了TFA的DCM溶解，TFA在去掉N端Mtt裸露氨酸的同时，能够催化C端甲酯与氨基的反应，形成酰胺环，获得全保护环肽，按重量份数计，DCM：TFA＝20：1，每mmol全保护直链肽溶解在0.5L溶剂中，而后在50℃的条件下油浴回流过夜，最后将全保护环肽减压旋干；

S3，切割提纯

5)按重量份数计，以TFA：苯甲硫醚：EDT：苯甲醚＝90：5：3：2配置切割液，并将全保护环肽置入其中切割2小时；

6)用冰乙醚析出，离心得到多肽粗肽，而后再用冰乙醚洗3次，去除部分杂质，减压抽干，最后用HPLC纯化得到纯品的RGD全肽，其结构式如下：

需要说明的是，本发明的比例均按重量份数计，一些常用缩写具有以下含义：

Mtt：4-甲基三苯基

Lys：赖氨酸

Boc：叔丁氧羰基

Arg：精氨酸

Gly：甘氨酸

Asp：天冬氨酸

Phe：苯丙氨酸

H-D-Phe-OMe：D-苯丙氨酸甲酯

HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺

DCC：二环己基碳二亚胺

DCM：二氯甲烷

TFA：三氟乙酸

EDT：1,2-乙二硫醇

Pbf：2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基

Otbu：叔丁酯

Acetonitrile：乙腈

性能分析

参照图1所示，其为RGD全肽的HPLC分析报告，表1.为HPLC的分析条件，表2.为HPLC的分析结果。可以看到，生成的RGD全肽的峰面积占比为98.27％，杂质的峰面积仅占有1.724％，相比于传统的RGD全肽的合成方法，本发明的合成方法合成的RGD全肽具有极高的纯净度。

参照图2所示，其为RGD全肽的MS分析报告，表3.为MS分析条件。可以看到，合成产物的离子团的种类和数量与该种RGD全肽内的离子团的种类和数量基本一致，进一步说明合成的RGD全肽的纯净度较高。表1.HPLC分析条件

表2.HPLC分析结果

表3.MS分析条件

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理能够在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。