沙门菌fimW基因新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒的制作方法

本发明属于微生物检测领域，具体地说，涉及一种靶向沙门菌fimw基因的新型可视化lamp快速检测引物组与试剂盒。

背景技术：

沙门菌(salmonella)作为临床常见的食源性人兽共患病原菌，是一种无荚膜的革兰氏阴性直杆菌。目前沙门菌已报道至少2500个血清型，国内报道有300多种，不同血清型沙门氏菌的侵袭力与致病力显著不同，其所引起的疾病都是和宿主相互对应的。感染沙门菌可见发热、败血、恶心、食欲不振、下痢等症状。除了能够通过污染食物引起人类食物中毒感染外，沙门菌感染在畜禽生产中也很常见，在猪生产中造成仔猪副伤寒、在家禽生产中可引发鸡白痢、鸡伤寒，鸡副伤寒等疾病，往往对生产生活造成很大损失。

沙门菌菌毛类型众多，主要有ⅰ型～ⅳ型等，ⅰ型菌毛蛋白由fima、fimi、fimc、fimd、fimh、fimf、fimz、fimy和fimw9个基因编码，其中主要菌毛亚单位蛋白fima的调控基因主要有fimz、fimy和fimw。众多菌毛类型中只有ⅰ型菌毛广泛分布在各血清型的沙门菌中，其他型菌毛分布的血清型均有限。将fimw序列在gen-bank上进行比对，结果显示含有fimw基因的都为沙门菌，而且在其它肠道杆菌的基因组中未发现与fimw同源的序列，说明fimw基因是沙门菌特有的基因。

目前，对沙门氏菌的检测主要是以传统的细菌分离和生化鉴定等方法为主，存在操作繁琐、灵敏度低和准确率不高等缺陷，不能满足及时有效的质量监测和疾病控制需求。随着分子生物学技术的发展，新的诊断技术如酶联免疫、免疫荧光、pcr、荧光定量pcr等检测病原核酸和蛋白质等生物大分子的方法已经广泛应用到沙门氏菌的检测中。然而，这些技术在应用过程中或需要熟练的操作人员，或需要昂贵的仪器设备，不适合在出入境口岸或兽医基层进行广泛的推广应用。

环介导等温扩增(lamp)技术作为一种新颖的恒温核酸扩增方法，具有操作简便、高特异性、高敏感性等特点。其原理是针对靶基因的多个区域设计多种特异引物，利用一种具有链置换活性的dna聚合酶(bstdnaploymerase)，在恒温条件(60℃-65℃)下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。由于其对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果通过肉眼观察即可判断，简便快捷，适合基层快速诊断，近年来已被广泛应用于病原体检测。

目前lamp的结果判别方法包括电泳、添加sybrgreenⅰ荧光染料或金属离子指示剂进行可视化判别，如钙黄绿素(黄绿色-橙红色)、羟基萘酚蓝(蓝紫色-天蓝色)等。然而，这些试剂或需开盖添加、或色差变化较小不易分辨。研究表明，当dna聚合酶将一个脱氧核苷酸分子结合到新的dna双链上时，会产生一个氢离子作为副产物，氢离子浓度的增加造成反应体系ph值的降低，基于此，本发明采用了甲酚红作为ph指示剂用于结果的判定，反应结果色差易分辨(黄色为阳性，红色为阴性)，无需开盖。其特异性强，敏感性比常规pcr方法高1000倍。临床检测表明，该试剂盒符合率高，取预增菌的菌液可直接作为模板进行检测，不会发生漏检。

如中国专利cn201711409788.1公开了一种快速检测猪圆环病毒3型的lamp引物组、试剂盒及应用。该引物组包含核苷酸序列如seqidno.1～6所示的引物组；试剂盒包括上述的引物组、反应试剂；该试剂盒的使用方法如下：首先配制扩增反应体系；恒温反应所得产物直接进行肉眼判读：阳性结果为黄色，阴性结果为红色，该试剂盒操作简单、成本低廉，结果易于观察，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，但该发明仅针对猪圆环病毒3型。

本发明根据沙门菌fimw基因，发明了沙门菌新型可视化lamp快速检测引物组和试剂盒，用以沙门氏菌的检测。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明的目的在于提供一种靶向沙门菌fimw基因的新型可视化lamp快速检测引物组与试剂盒。

首先，本发明提供一种靶向沙门菌fimw基因的lamp引物组。

本发明按照沙门菌fimw基因，设计了lamp引物组，如表1所示，同时根据沙门菌国家检测标准，标准号为gb/t28642-2012，合成沙门菌pcr国标检测引物，如表2所示；

表1

表2

本发明还提供一种靶向沙门菌fimw基因的试剂盒，包括上述的靶向沙门菌fimw基因的lamp引物组。

本发明公开了一种用上述引物组或试剂盒在检测待测样品是否感染沙门菌的应用。

本发明还公开了一种检测待测样品是否感染沙门菌的方法，包括如下步骤：

(3)用引物组或试剂盒对待测样品进行lamp扩增，得到扩增产物；

(2)结果判断：肉眼即可判断；阴性：若扩增产物呈现红色，证明待测样品没有感染沙门菌；阳性：若扩增产物呈现黄色，证明待测样品感染了沙门菌；

进一步的，步骤(1)lamp扩增反应体系为25μl，其中lampmix12.5μl、fip、bip引物(10μmol/l)3μl，f3、b3引物(10μlmol/l)0.5μl，lf引物(10μlmol/l)1μl，模板2.5μl，其余用超纯水补齐；

进一步的，lampmix包括(nh4)2so4、kcl、tween-20、甲酚红溶液、koh、dntp、甜菜碱、mgso4和bst酶；

优选地，外引物、内引物和环引物的比例为1:6:2；

优选地，步骤(1)lamp反应体系，反应温度62℃，反应时间40min。

本发明有益效果

(1)本发明首次针对沙门菌fimw基因建立沙门菌的lamp方法；

(2)本发明的检测敏感性极高，是常规pcr检测的1000倍，明显高于现有技术；

(3)本发明简化了检验流程，预增菌的菌液可直接作为模板进行检测，不发生漏检。

(4)指示剂通过甲酚红显色，实验结果实现可视化观察，不用开盖，非常适合在出入境口岸或兽医基层进行广泛的推广应用。

附图说明

图1为实施例2的最佳反应温度筛选结果图；

图2为实验例1lamp特异性试验结果图；

图3为实验例2pcr特异性试验结果图；

图4为实验例3pcr检测方法敏感性结果图；

图5为实验例3lamp敏感性试验结果图；

图6为实验例4临床样本lamp检测结果图。

具体实施方式

为了使本领域人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

本发明的鼠伤寒标准菌atcc14028购自美国菌株保藏中心(atcc)、沙门菌菌株、铜绿假单胞菌株、鸭疫里默氏杆菌菌株、空肠弯曲菌菌株、结肠弯曲菌菌株由华南农业大学实验室鉴定保存。

本发明的lb肉汤、lb琼脂、xlt4琼脂基础、缓冲蛋白胨水溶液(bpw)和四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(ttb)均购自广东环凯微生物科技有限公司；磷酸盐缓冲剂(pbs)购自鼎国昌盛生物技术有限公司；细菌基因组dna快速抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

实施例1细菌基因组dna的提取

取4株不同血清型沙门菌，即鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡伤寒沙门菌；5株非沙门菌，即空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、铜绿假单胞菌(2株)和鸭疫里默氏杆菌在营养琼脂或血琼脂平板上划线接种，按各自所需条件培养到相应时间，筛选取单菌落接种到营养肉汤后，在摇床振摇培养，然后培养物用水煮裂解法或按细菌基因组dna快速抽提试剂盒的说明进行，制得各菌株dna模板。

实施例2沙门菌lamp检测方法的建立

按梯度设置15min～75min的反应时间，确定最佳反应时间。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成后用lamp引物用灭菌超纯水稀释为10μm，pcr引物稀释为20μm，放﹣20℃保存。

lamp反应体系为25μl，其中lampmix12.5μl、fip、bip引物(10μmol/l)3μl，f3、b3引物(10μlmol/l)0.5μl，lf引物(10μlmol/l)1μl，模板2.5μl，其余用超纯水补齐。lampmix包括(nh4)2so4、kcl、tween-20、甲酚红溶液、koh、dntp、甜菜碱、mgso4和bst酶。

其中最优外引物、内引物、环引物比例为1:6:2，最优反应温度62℃，最优反应时间40min，结果如图1所示，图1中，1、反应15min(红色)；2、反应20min(红色)；3、反应25min(红色)；4、反应30min(红色)；5、反应40min(黄色)；6、反应45min(黄色)；7、反应60min(黄色)；8、反应75min(黄色)，可见反应时间为40分钟时，即可显示黄色。

实验例1lamp特异性试验

(1)提取dna模板：取4株不同血清型沙门菌，即鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡伤寒沙门菌，5株非沙门菌，即空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、铜绿假单胞菌(2株)以及鸭疫里默氏杆菌的dna模板。

(2)按照实施例2进行lamp特异性检测，结果通过肉眼对颜色判读，可见鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡伤寒沙门菌等沙门菌模板为扩增显阳性，颜色为黄色，空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、铜绿假单胞菌、鸭疫里默氏杆菌等其他非沙门菌模板为阴性，颜色为红色，结果如图2所示，重复试验后结果相符。

图2中1、阴性对照；2、鸡白痢沙门菌；3、肠炎沙门菌；4、鼠伤寒沙门菌；5、鸡伤寒沙门菌；6、结肠弯曲菌；7、空肠弯曲菌；8-9、铜绿假单胞菌；10、鸭疫里默氏杆菌。

实验例2pcr特异性试验

使用国标引物，pcr反应体系为50μl：premixtaq缓冲液25μl，模板4μl，浓度为20μmol/l的上下游引物各1μl，去离子水19μl。

反应程序为：94℃预变性2min，30个循环：94℃变形1min，58.4℃退火40s，72℃延伸30s；72℃终延伸7min后跑胶，扩增条带331bp。

pcr扩增结果符合预期，只有鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡伤寒等模板进行扩增，其他模板不扩增，与lamp结果一致，结果如图3所示。

图3中，m:dnamarker；1、鸡白痢沙门菌；2、肠炎沙门菌；3、鼠伤寒沙门菌；4、鸡伤寒沙门菌；5、结肠弯曲菌；6、空肠弯曲菌；7-8、铜绿假单胞菌；9、鸭疫里默氏杆菌；10、阴性对照)

实验例3lamp方法与pcr方法敏感性比较

选用鼠伤寒标准菌14028，划xlt4板，挑取单菌落于1mllb肉汤，37℃摇床摇荡4.5h，使用稀释平板计数法对其进行计数，每个稀释度做3个重复，确定其菌液浓度，然后将其用无菌pbs进行10倍倍比稀释，得到最终浓度分别为7.3×10⁷cfu/ml、7.3×10⁶cfu/ml、7.3×10⁵cfu/ml、7.3×10⁴cfu/ml、7.3×10³cfu/ml、7.3×10²cfu/ml、7.3×10¹cfu/ml、7.3×10⁰cfu/ml的菌液用于敏感性测试。

结果如下：

pcr检测方法

菌液终浓度为7.3×10⁷cfu/ml、7.3×10⁶cfu/ml、7.3×10⁵cfu/ml、7.3×10⁴cfu/ml时，可扩增到目的片段，目的条带大小331bp，说明使用国标检测方法的检出下限为7.3×10⁴cfu/ml，结果如图4所示，图4中，1-8.7.3×10⁷cfu/ml-7.3×10⁰cfu/ml，m：dnamarker。

lamp检测方法

菌液浓度为7.3×10⁷cfu/ml-7.3×10¹cfu/ml时，扩增结果显阳性黄色，7.3×10⁰cfu/ml为阴性红色，结果如图5所示,图5中，1、阴性对照(红色)；2-9、7.3×10⁷cfu/ml-7.3×10⁰cfu/ml,9显示红色，将lamp产物跑1％琼脂糖凝胶，结果相符。

重复试验后结果相符，使用lamp检测方法的检出下限为7.3×10¹cfu/ml，与pcr方法相比，检测下限提升了3个数量级。

本实验例说明，本发明建立的lamp方法的敏感性是常规pcr方法的1000倍，此敏感性明显高于现有水平，证明本发明靶向沙门菌fimw基因建立的lamp方法敏感性极高。

实验例4临床样本检测

采集30份市场样本(鸭10份，鸡10份，猪10份)，用缓冲蛋白胨水溶液(bpw)进行预增菌后，用lamp方法进行检测；采用国标方法，先用bpw进行预增菌，然后用改良的方法使用ttb进行选择性增菌，取选择性增菌后菌液，提取dna模板，使用pcr方法进行检测。以通过传统细菌分离鉴定流程的结果为标准，比较得出lamp方法和pcr方法的检测符合率。

本实验例结果如下：对于30份样品中，传统的细菌分离鉴定流程检测出28份阳性，2份阴性；lamp方法检测出27份阳性，1份阴性(c1，红色)，2份弱阳性，结果如图6所示，弱阳性与bpw预增菌后菌液浓度还较低有关；pcr方法检测出24份阳性，6份阴性，这与pcr检测的敏感性有关，即使是ttb选择性增菌后提取的细菌dna模板，部分模板浓度也还较低，pcr结果无法跑出条带，图6为临床样本lamp检测结果，p代表猪，c代表鸡，d代表鸭，上方为对应编号。临床样本检测对比结果如表3所示。

表3

本发明针对沙门菌菌毛特异基因fimw设计了一对lamp引物，通过调整体系、确定最佳反应温度，筛选最佳反应时间，测试特异性和敏感性、检测临床样本等发明了一种靶向沙门菌fimw基因的新型可视化lamp快速检测引物组与试剂盒。

传统细菌分离鉴定流程步骤多，耗时长，往往需要3-5天才能出结果；国标沙门菌pcr检测方法需要经过预增菌、选择性增菌、提取dna模板进行pcr检测等步骤，因pcr方法的敏感性较低容易造成漏检，实验设备也比较昂贵。而本发明靶向沙门菌fimw基因的lamp快速检测引物组与试剂盒。特异性强，敏感性比pcr方法高1000倍，预增菌后的菌液可直接作为模板进行检测。以传统细菌分离鉴定流程为标准，检测符合率达到96.7％，结果如表3所示，结果表明不会发生漏检。

目前已有的观察实验结果的技术是在lamp反应结束时对反应结果进行电泳，或在反应完成后添加sybrgreenⅰ荧光染料，这些都需要将反应产物暴露着在空气中，形成气溶胶，污染试验环境造成假阳性。也有技术是在lamp体系中加入金属离子指示剂，如钙黄绿素(黄绿色-橙红色)、羟基萘酚蓝(蓝紫色-天蓝色)等，通过反应颜色的变化来观察结果，但这些方法都存在肉眼观察颜色差异不大，反应时间较长等缺点。本发明采用了甲酚红作为新型ph指示剂用于结果的判定，反应结果仅通过颜色差异就能很好分辨，无需开盖，其中黄色为阳性，红色为阴性。其可视化判定的特点具有防止气溶胶污染，避免假阳性，简化操作流程的优点。

本发明沙门菌fimw基因新型可视化lamp快速检测引物组与试剂盒具有特异性强，敏感性极高的优点。预增菌后的菌液可直接作为模板进行检测，其仅需在62℃通过普通水浴锅反应40min即可完成对沙门菌的检出，无需开盖，实验结果实现可视化观察，通过肉眼即可判定，大大缩短了检测时间，非常适合在出入境口岸或兽医基层进行广泛的推广应用。