一种甲烷氧化菌及其应用的制作方法

本发明涉及甲烷氧化菌及其应用，特别涉及一种以甲烷为碳源的甲烷氧化菌及其应用。

背景技术：

甲烷氧化菌(methanotroph)是一种能够以甲醇、甲烷、甲酸等作为生长所需的碳源以及能源的一种甲基氧化菌。据科学测定，湿地系统内产甲烷菌产生的90％以上的甲烷气体都会被甲烷氧化菌进行氧化利用，用于合成自身细胞中的组成成分。有研究表明甲烷氧化菌能够用以生产单细胞蛋白(singlecellprotein，scp)。单细胞蛋白又称微生物蛋白，是指从纯培养的微生物细胞中提取得到的总蛋白，可作为人及动物蛋白的补充。研究已经表明，使用微生物产生的单细胞蛋白安全无毒，含有丰富的蛋白质、氨基酸和多种维生素，可以用作饲料促进畜禽生产，提高饲料利用率，代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类和脱脂奶粉等蛋白补充饲料，具有较高的附加值。由细菌以甲烷为原料生产的新型单细胞蛋白的蛋白含量69％-80％，远远高于工业生产饲料15％-20％的蛋白含量，具有较高的经济效益和广阔的市场空间，因此分离出能以甲烷为碳源生长的甲烷氧化细菌有着重要的意义。

技术实现要素：

发明目的：本发明目的是提供一种甲烷氧化菌。

本发明的另一目的是提供所述甲烷氧化菌在生产单细胞蛋白中的应用。

技术方案：本发明提供一种甲烷氧化菌，其拉丁文学名为甲基杆菌(methylobacteriumsp.)，于2019年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号：cgmccno.17719，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

甲烷氧化菌菌株mo-1701细菌学特性描述如下：

对菌株mo-1701形态学和生理生化试验，该菌在以甲醇为碳源的琼脂平板上经48h培养后菌落为粉红色，表面光滑，菌落边缘整齐，直径0.8-1.2mm，革兰氏阴性短杆菌、无芽孢、无荚膜，在液体培养基中呈粉红色菌液(图1和图2)。甲烷氧化菌mo-1701产h2s试验、吲哚试验为阴性；甲基红试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验和明胶液化试验均为阳性。

对甲烷氧化菌mo-1701进行16srdna序列扩增并测序，将测序结果与genbank中公开的细菌16srdna序列进行核苷酸同源性比较，并构建系统发育树。blast分析结果显示，mo-1701的16srrna基因序列与methylobacteriumzatmanii7211菌株的同源性最高，所以确定该菌为甲基杆菌属。基于16srrna序列、生化鉴定以及表征性状，将分离菌株mo-1701鉴定为甲基杆菌属。

一种权利要求1所述的甲烷氧化菌在生产单细胞蛋白中的应用。

进一步地，所述甲烷氧化菌利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、甲醇或甲烷作为碳源生产单细胞蛋白。

进一步地，所述甲烷氧化菌利用甲醇或甲烷作为碳源生产单细胞蛋白。

进一步地，所述甲烷氧化菌生产单细胞蛋白的生长条件为mgso4·7h2o0.2g/l、kh2po40.5g/l、k2hpo41.5g/l、(nh4)2so41.0g/l、nacl1.0g/l，连续通入体积比为2∶8的甲烷、空气混合气体。

本发明从污泥中分离了一株能够以甲醇等为碳源和能源的菌株，并对其生物学性状进行研究，利用16srdna技术对筛选的菌株进行鉴定，并利用单因子控制的方法对其培养条件进行优化，达成初步优化发酵工艺的目的，为甲烷单细胞蛋白的生产提供了良好基础。

有益效果：本发明的甲烷氧化菌mo-1701，可以以甲醇、甲烷、甲酸等作为生长所需的碳源以及能源，对甲醇的利用率最高。该甲烷氧化菌mo-1701用于生产单细胞蛋白。

附图说明

图1是甲烷氧化菌mo-1701菌落形态图；

图2是甲烷氧化菌mo-1701液体培养液状态图；

图3是ph值对甲烷氧化菌生长的影响线性图；

图4是温度对甲烷氧化菌mo-1701生长的影响线性图；

图5是铜离子浓度对甲烷氧化菌生长的影响线性图；

图6是不同碳源对甲烷氧化菌mo-1701生长的影响条形图。

具体实施方式

实施例1：甲烷氧化菌mo-1701的菌株来源、菌株分离

1、样品采集：土样采集于河床淤泥和生活垃圾填埋场5年以上填埋区土壤；每个样品(约100g)置于带有冰袋的无菌塑料袋中，10小时内运输至实验室，4℃低温保存备用；

2、菌株分离：称取土样10.0g，加入到带玻璃珠的装有100ml无菌蒸馏水的锥形瓶中，30℃摇床震荡30min，静置10min，得到土样浸出液；取1.0ml土样浸出液上清加入到装有90ml无机盐培养液的100ml盐水瓶中，胶塞封口，其中无机盐培养液为单一碳源无机盐培养液，每升培养液中无机盐配方含量如下：mgso4·7h2o0.2g、kh2po40.5g、k2hpo41.5g、(nh4)2so41.0g、nacl1.0g，用50升注射器注入甲烷气体；随后将盐水瓶置于恒温摇床中在150r/min，30℃条件下富集培养，直至锥形瓶中培养液明显红色浑浊。选取出现红色浑浊较快且浑浊度较高的样品组用于目的菌株的筛选；

3、纯化培养：甲烷氧化菌同样能利用甲醇，因此在分离纯化甲烷氧化菌时以甲醇代替甲烷制备固体培养基。以重复富集3次后获得的粉红色富集培养液为材料，采用平板分区划线的方法将富集培养液接种于含0.5％甲醇的无机盐固体培养基上培养5-10天，其中无机盐固体培养基为步骤2中所述的液体培养基中加入1.5％的琼脂制备获得，挑取平板上的粉红色的单菌落接种于新的固体培养基中培养，重复3次，获得的纯化的菌株即为甲烷氧化菌。

实施例2：甲烷氧化菌mo-1701的菌株鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》对获得的甲基氧化菌mo-1701进行形态学染色、运动性、生理生化鉴定。

16srdna鉴定：采用由天根生化科技有限公司细菌基因组dna提取试剂盒(离心柱型)提取细菌总dna，利用细菌16srrna通用引物27f(5′-agagtttgatcatggctcag-3′)和1492r(5′-tacggctaccttgttacgactt-3′)对提取纯化后的dna进行16srdna扩增。pcr产物交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)的blast，将测序结果(基因序列seqidno.1见序列表)与genbank中公开的16srdna序列进行核苷酸同源性分析，并使用mega7.0软件进行系统发育分析。

菌株mo-1701，革兰氏阴性，结合生理生化实验与16srdna鉴定，该菌属于methylobacterium属细菌，并命名为mo-1701。拉丁名称为甲基杆菌(methylobacteriumsp.)，于2019年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.17719。

实施例3：甲基氧化菌mo-1701培养条件优化

液体培养基为单一碳源无机盐培养液，每升培养液中无机盐配方含量如下：mgso4·7h2o0.2g、kh2po40.5g、k2hpo41.5g、(nh4)2so41.0g、nacl1.0g，再通入甲烷：空气(2∶8)混合气体。

初始ph值对甲基氧化菌mo-1701生长的影响：将目的菌株接种于无机盐液体培养基，设定初始ph分别为4、5、6、7、8、10，37℃摇床培养96h后570nm测定菌液od值。

温度对甲基氧化菌mo-1701生长的影响：将菌液接种于ph7.0的无机盐培养基，实验选取了20℃，25℃，30℃，37℃，40℃，45℃六个温度下对目的菌株进行摇床培养后测定菌液od570值。

铜离子浓度对甲基氧化菌mo-1701生长的影响：在无机盐培养基加入浓度为0、5、10、20、30、40umol/l的cuso4，37℃，150rpm摇床培养96h后测定菌液od570值。

不同碳源对甲基氧化菌mo-1701生长的影响：分别用麦芽糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，甲醇作为碳源，加入上述无机盐液体培养基中，37℃摇床培养96h后570nm测定菌液od值。

优化结果：

对不同ph值条件下甲烷氧化菌mo-1701生长情况进行测定，结果如图3所示，由图所示可见mo-1701在ph值4-5时几乎停滞生长，随着ph值升高，生物量增加，到达7.0时最高，随后随着ph值升高，生物量有所下降，表面菌株mo-1701最适生长ph值＝7.0。

在液体培养基ph值为7.0时，研究温度对mo-1701生长的影响，如图4所示，od值在37℃时为最高，说明甲烷氧化菌mo-1701的最适生长温度为37℃，在37℃-40℃温度范围内，细菌的生长量都比较高。

铜离子对生长影响的如图5所示，本实验所分离的菌株在加入微量铜离子时对菌株生长有较为明显的促进作用，在加入铜离子的培养液中，菌株在培养130小时后有最大od值0.316，而不加入铜离子培养的时候，菌液浓度明显较低。

分别用0.5％的麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉和甲醇作为碳源研究甲烷氧化菌mo-1701对碳源的利用能力，结果如图6所示，甲烷氧化菌mo-1701对所提供的碳源都能利用，但对甲醇的利用率最高。

实施例4：甲烷氧化菌m0-1701生产单细胞蛋白

甲烷氧化菌是一种能够以甲烷、甲醇或甲醛作为唯一碳源和能源物质进行生命活动和繁殖的甲基氧化菌。尽管甲烷氧化菌在单细胞蛋白生产方面有极大的前景，但是仍旧需要找到一个最佳的发酵工艺。现有技术中以甲醇为碳源对甲烷氧化菌进行高密度发酵，最终获得1.772g(drywt)/l的细胞。本研究对土壤中甲烷氧化菌进行了实验室分离、纯化和生物学鉴定，以及生长条件优化筛选，结果显示菌株mo-1701在以mgso4·7h2o0.2g/l、kh2po40.5g/l、k2hpo41.5g/l、(nh4)2so41.0g/l、nacl1.0g/l，通入20％甲烷气体，在37℃、ph值7.0、铜离子浓度30umol/l，经过30h培养，生物量达到最大，达6.7g干细胞/l升。本次试验结果为后期甲烷氧化菌的最佳条件分离、培养，以及后期单细胞蛋白的生产，奠定了良好的基础。

序列表

<110>中国药科大学

<120>一种甲烷氧化菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1358

<212>dna

<213>甲烷氧化菌(methylobacteriumsp.)

<400>1

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