本申请涉及医疗用品领域，具体涉及一种胶原蛋白交联剂组合物及其应用。
背景技术：
胶原蛋白是哺乳动物体内分布最广的蛋白质，易于提取获得，并且具有良好的生物降解性和生物相容性。胶原蛋白是细胞生长的支架材料，具有促进细胞黏附和诱导细胞生长分化的作用，被广泛用于组织工程学研究，在医疗领域广泛应用。
胶原因其优良的低免疫活性、良好的生物相容性和可生物降解性等特性而得到了广泛地应用,但未改性的胶原往往存在热稳定性差、降解速率过快和机械强度低、易变性等缺点,在很多情况下不能满足使用要求。因此,通常采用对其进行改性的方法来有效提高胶原的热稳定性和机械性能,降低胶原的降解速率。目前对胶原蛋白的改性研究大概可以分为三类:交联改性、对活性基团改性及引入聚合物改性。
物理交联方法主要有光氧化法、热脱氢法和紫外辐射法。物理改性一般不涉及蛋白质的一级结构,主要用于胶原蛋白的增溶和凝胶。物理交联法的缺点是胶原交联度低,且难以获得均匀一致的交联。胶原溶液如被紫外线照射,将在分子间产生交联,粘度增加,生成凝胶。
化学交联法是采用有机交联剂或无机交联剂实施交联,比物理方法改性交联度高,且能获得均匀一致的交联,对调节、控制胶原的各种性质均有良好的效果。但是，外源性有毒化学物质进入胶原内。
随着应用研究的深入,单一交联剂交联胶原蛋白的性能表现出一定的局限性,迫切需要具有更优异的交联效果，且克服传统交联方法缺陷的新型交联剂问世。在用胶原蛋白生产生物支架材料的领域，也需要具有提高的交联效率，降低的毒副作用和免疫原性，以及良好的组织相容性的支架材料问世。通过对交联剂的研发来改进胶原蛋白的综合性能，为医疗生物材料的发展提供了新的动力。
技术实现要素：
本发明的目的是开发具有改进性能的交联剂组合物，用于胶原蛋白的改性反应，进而应用于医用生物材料的制备。
为达到该目的，本发明的一个方面提供一种交联剂组合物，所述组合物中包含光敏交联剂、化学交联剂、柠檬酸盐、以及咪唑。
所述交联剂组合物优选进一步含有缓冲体系，例如磷酸盐缓冲体系。
优选的，所述光敏交联剂选自5-氨基乙酰丙酸、亚甲苯兰等。
优选的，所述化学交联剂选自醛类(戊二醛)、二羧酸类、京尼平、氧化海藻酸钠、碳化二亚胺、柠檬酸衍生物、壳聚糖和聚乙烯醇等。更优选为京尼平和氧化海藻酸钠。
所述柠檬酸盐优选为柠檬酸钠、柠檬酸钾等。
在一种具体的实施方案中，本发明的胶原蛋白交联剂组合物具有如下组成：光敏交联剂0.05-100mg/ml，化学交联剂0.05-100mg/ml，柠檬酸盐0.05-1mol/l，咪唑0.05-100mg/ml。
在本发明的另一方面，权利要求1-5任一项的交联剂组合物在胶原蛋白交联反应中的应用。
优选的，所述应用实际为一种胶原蛋白的交联方法，按如下方式进行：将去细胞胶原蛋白浸泡在溶液形式的交联剂组合物中；维持平衡体系温度在10-40℃，ph为4～9，预浸泡。随后，在310-330osm的渗透压下在白炽灯光照及通入氧气条件下，进行交联反应；最后，用na2co3/nahco3缓冲液调整ph为6.8-7.2，浸泡振荡，密封保存备用。所述预浸泡的ph优选为7.2-8.2。
优选的，所述预浸泡的时间为0.5-10h，所述交联反应时间为0.5-10h。
在本发明的再一方面，提供一种生产去细胞生物材料的方法，包括如下步骤：
(1)对含细胞生物材料进行去细胞处理；
(2)用权利要求1-5任一项的交联剂组合物在溶液中进行胶原蛋白交联反应；
(3)收获所述胶原蛋白。
优选的，使用去垢剂-酶消化法进行去细胞处理，所述酶为胰蛋白酶或胃蛋白酶。
区别于现有技术，柠檬酸盐是本发明交联组合物的重要成分。根据发明人的研究，组合物中柠檬酸盐的存在可以提高京尼平等化学交联剂在碱性溶液中的稳定性，从而促进化学交联剂和光敏交联剂协同作用的发挥。此外，本发明的交联剂组合物还含有咪唑。根据发明人的研究，该成分的用量可以显著影响胶原蛋白改性效果。
本发明的应用领域
止血材料
胶原蛋白因具有生物相容性、血液可吸收性、低免疫原性等性能而被广泛用作止血材料。胶原蛋白止血材料具有多孔网状结构，与出血创面接触时，利用其毛细作用迅速吸附伤口处血液，促使血小板凝聚，产生凝血酶，而凝血酶通过再催化过程将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血液凝固，达到止血的目的。
药物释放载体材料
胶原蛋白是一种结缔组织蛋白，具有生物相容性、生物可降解性和低免疫原性，可以作为理想的药物载体材料；可以通过控制胶原蛋白的结构来实现对药物的缓慢释放，将胶原蛋白交联成高度多孔的网状结构，使其机械强度提高，载药量增加，生物降解速率减慢，以此来延长药物的释放时间。
组织工程支架材料
组织、器官缺损的修复和功能的重建是人们面临的巨大挑战，组织工程学的发展为组织的再生和重建提供了一项新的技术。胶原蛋白常被作为组织工程支架材料，从体内提取种子细胞并通过体外扩增后接种到胶原蛋白支架上，经过体外培养形成功能化组织后再植入体内，可修复相关组织缺损。
皮肤替代物
皮肤损伤严重时会导致死亡，特别是烫伤或烧伤皮肤很难自发修复。胶原蛋白常被用于培养皮肤细胞，作为皮肤损伤治疗的载体。
骨移植材料
胶原蛋白是骨细胞外基质的重要组成成分，骨组织工程的发展为骨缺损修复提供了新的技术。
角膜移植材料
胶原蛋白约占眼角膜干重的70％，胶原纤维在眼角膜中以规整有序的结构排列。角膜受损后很难修复或重建，有研究发现将体外培养扩增的正常角膜干细胞植入胶原蛋白支架上，形成组织工程人工角膜，能修复受损角膜。
有益效果
本发明的交联剂组合物不同于以往单一的光敏交联剂以及化学交联剂，集光氧化交联和化学交联的优势于一身。本发明出人预料的发现，光氧化交联和化学交联可以同时进行并产生相互之间的协同效果，进而大大提高了交联效率，节省了原料及反应时间。以化学交联方法通常需要较长的交联时间，而结合光氧化交联后，该时间被大大缩短。特别是在柠檬酸盐的存在之下，光氧化交联剂与化学交联剂的协同效果最为明显。
此外，本发明采用去污剂与蛋白酶等结合能将组织中细胞成分完全去除，从而较为完整地保留了细胞外主要间质成分(软骨支架、胶原纤维和弹力纤维等)的支架结构，避免了由细胞引起的钙化和免疫反应:在此基础上，进行光氧化交联处理，可以调整去细胞支架的交联程度，可防止组织的过早降解，从而形成一种在体外被种子细胞种植或在体内被自体组织附着、增生，原有的结构被降解，最后被重塑成机体一部分并能生长的生物材料:另外交联处理还可以进一步减轻结构蛋白引起的异种间的反应。本发明的方法为构建具有生理机能的组织工程化气管基质支架，提供了一种新的方法和来源。
具体实施方式
实施例1交联剂组合物的配制
本实施例配制了如下组方的交联剂组合物溶液
组合物1：
京尼平0.1mg/ml、0.1mg/ml5-氨基乙酰丙酸、0.05mol/l柠檬酸钠，0.02mg/ml咪唑，以pbs为缓冲体系，ph8.0。
组合物2：
0.1mg/ml氧化海藻酸钠、0.1mg/ml亚甲苯兰，0.05mol/l柠檬酸钠，0.02mg/ml咪唑，以pbs为缓冲体系,ph7.5。
组合物3：
50mg/ml氧化海藻酸钠、20mg/ml亚甲苯兰，0.8mol/l柠檬酸钾，以pbs为缓冲体系,ph7.0。
对照1：
京尼平0.2mg/ml，以pbs为缓冲体系，ph7.5。
对照2：
0.2mg/ml5-氨基乙酰丙酸，以pbs为缓冲体系，ph7.0。
对照3：
0.1mg/ml氧化海藻酸钠、0.1mg/ml亚甲苯兰，以pbs为缓冲体系，ph7.5。
实施例2胶原蛋白生物材料的获得
2.1巩膜
用空气栓塞法处死新西兰大白兔，将眼球取出，分离巩膜。随后置于十二烷基二甲基苄基溴化铵溶液中浸泡后，再依次置于聚乙二醇辛基苯基醚溶液中孵育，置于胰蛋白酶和edta混合溶液中孵育，以及置于dnase-1和rnase-a混合溶液中孵育，即得去细胞的巩膜组织。切片制成1cm×1cm。得到去细胞材料。
2.2血管组织
选取新鲜合适的牛静脉，采用多步骤去垢剂-酶消化法脱细胞。0.25％胰蛋白酶溶液中浸泡18小时，随后置于0.1％sds中12小时，再将组织浸入0.25％胰蛋白酶溶液中12小时，最后在25℃的dispase中处理12小时，最后将去细胞牛颈静脉血管片裁剪为每片面积约1.6cm2。得到去细胞材料2。
2.3气管
取成年健康新西兰大白兔，耳缘静脉泣入空气致死，切取全段气管。用含1％抗生素、抗真菌药物的pbs缓冲液冲洗3-4min，置于4℃蒸馏水渗透溶解48h；在4％脱氧胆酸钠蒸馏水溶液浸泡37℃孵育4h，40r/min连续摇动；然后用蒸馏水冲洗两遍去除细胞碎屑；将气管在室温下置2000ku/ldnase-i的生理盐水中浸泡3h，40r/min连续摇动，以溶解细胞核并降解dna；将气管裁剪为每片面积约1.6cm2，置于1％抗生素、抗真菌的pbs缓冲液中4℃保存。得到去细胞材料3。
实施例3交联反应
将实施例2获得的去细胞材料切片分别浸泡在20ml实施例1的溶液中，装入80ml的容器中。维持平衡体系温度在15℃，ph为7.5～7.8，浸泡60min。随后，在310-330osm的渗透压下在1000w白炽灯光照及通入氧气条件下，进行交联反应60min。最后，用0.25m的na2co3/nahco3缓冲液来调整反应体系的ph为7，浸泡振荡1h，密封保存备用。
实施例4细胞粘性和细胞生长实验(生物相容性)
将实施例3获得的交联后切片每片种植人脐静脉内皮细胞株细胞(crl-2480)5×105，静态培养7天，取1，4，7天标本消化血管片表面细胞记数，标本切片he染色，扫描电镜和透射电镜检测，比较各处理组血管片表面细胞黏附数目，结合程度，对比不同交联剂预处理对增强细胞黏附性和促进生长情况的影响。
(1)细胞记数：细胞培养第4-7天，实验组细胞数目多于对照组(p<o.05)，实验理组间无明显差别。
(2)标本石蜡包埋后切片he染色结果：第l天各组血管片表面细胞排列密集，紊乱，细胞核有堆积，部分呈双层排布；第4天，对照组血管表面细胞疏松，实验组细胞均连接成片，呈单层排布。第7天，对照组细胞仍相对较少，实验组细胞铺连成片。
(3)取7天标本扫描电镜显示：对照组血管片表面细胞稀疏，细胞间无桥接，与下方的纤维结构联结不明显。试验组铺连成片，细胞间长梭形有桥接和突起，与去细胞的血管片纤维之间形成连接。
(4)透射电镜：可观察到表面生长内皮细胞与下方纤维成分有空白带存在。对照组的细胞支架可生长内皮细胞。实验组的细胞支架表面，可增强内皮细胞黏附和贴壁生长。实验组比对照组在增强细胞黏附性及贴壁生长方面效果更好。
测定结果如表1、2所示。其中，细胞形态评分：考察是否成片，细胞间桥接。以+++为最佳，-为最差。
表1去细胞材料1的生物相容性
表2去细胞材料2的生物相容性
由实验结果可知，交联剂组合物的使用相对于单一交联剂而言，可以进一步的提高去细胞材料的生物相容性，特别是对细胞的粘附性产生了较强的协同作用。其中，使用柠檬酸盐和咪唑作为辅助成分可以较为明显的体现该协同效果。
实施例5机械强度实验
热皱缩温度测定
将实施例3制备获得的材料置于皮革温度仪内，两端固定，让交联切片处于自然状态，不受张力牵拉，用双蒸水作为媒介，以2℃/min的速度升温，测量胶原材料的收缩率，所测定的热皱缩温度为收缩变化速率最大时的温度。
最大抗张强度及最大拉伸距离测定
将实施例3制备获得的交联切片置入拉伸材料测力仪(instron-3433)中，用vidas图像分析系统记录切片厚度，拉伸速率设定为5mm/min，将血管断裂时的拉伸长度和应力导入vidas系统，计算得到标本的最大抗张强度。数据采用均数±标准差(x±s)表示；组间比较采用两样本的t检验；以p<0.05为差异具有统计学意义。结果如表3和表4所示。
表3去细胞材料1的机械性能比较(n＝20，x±s)
表4去细胞材料3的机械性能比较(n＝20，x±s)
由实验结果可知，交联剂组合物的使用相对于单一交联剂而言，可以进一步的提高去细胞材料的机械强度，在热皱缩温度、最大抗张强度以及最大拉伸距离方面都产生了较强的协同作用。其中，使用柠檬酸盐和咪唑作为辅助成分可以较为明显的体现该协同效果。
实施例6酶降解稳定性
交联的脱细胞材料可以在体外评价抗酶降解，抗酶降解的能力越强，交联材料降解率越低。取实施例3制备的三种去细胞材料分别进行体外酶降解的测试，采如下方法：在测定了样品的最初质量(w0)之后，将样品浸在1.8mg/mlii型胶原酶的d-hanks溶液中(酶活力单位为1000u/ml，ph7.4)，在37℃、持续温和摇动(60rpm)的条件下持续降解4小时。加入50微升10mmol/ledta终止降解，剩余样品干燥至恒重，再次测定质量(wt)。降解率或质量损失百分率可以通过下式计算：
△w％-(w0-wt)/w0×100％
式中w0表示每个样品的初始质量，wt表示相应的每个样品酶降解后的质量。
空白对照表示未进行交联的去细胞材料。
表5去细胞材料的抗酶解能力比较
由实验结果可知，交联剂组合物使得去细胞材料的抗酶解能力进一步提高，发挥了不同交联剂之间的协同效应。