本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法。
背景技术：
棕榈油是一种热带木本植物油，由油棕树上的棕榈果压榨而成，是目前世界上生产量、消费量和国际贸易量最大的植物油品种。由于棕榈果中含有较多的解脂酶，所以对收获的棕榈果必须及时进行加工或杀酵处理。初级压榨之后的棕榈毛油容易自行水解而生成较多的游离脂肪酸，导致棕榈油的酸值增长很快。一般情况下，酸值略有升高的棕榈油不会对人体的健康产生损害，但棕榈油酸值过高（即发生严重的变质），所产生的醛、酮、酸会泡坏脂溶性维生素，可能对人体健康产生不利影响，因此要对初级压榨之后的棕榈毛油及时进行精炼或分提。酸值是衡量油品质量的重要参数，目前对酸值过高的棕榈废油进行精炼的方法有化学精炼和物理精炼二种，化学精炼的中和工艺会产生大量皂脚，这不仅会导致中性油的大量损失，还会产生严峻的环保压力；而物理精炼虽能提高得率，减轻环保压力，但存在能耗高、脱臭时间长、油品颜色深等缺点。此外，棕榈油生产工艺脱酸、脱臭过程中会产生大量颜色深、酸值高的馏出物，其成分中含有游离脂肪酸、甘油酯、甾醇等，成分复杂，处理繁琐。
单细胞蛋白，也叫微生物蛋白，是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。单细胞蛋白是一类凝缩的蛋白类产品，含粗蛋白50%~85%，其中氨基酸组分齐全，可利用率高，还含维生素、无机盐、脂肪和糖类等，其营养价值高、用途广泛。尽管单细胞蛋白具有上述优点，但目前单细胞的生产成本中，原料成本仍占总生产成本的60%以上，其中原料中的碳源成本最高，且单细胞蛋白产出率也不是很理想。
技术实现要素：
本发明所需解决的技术问题是：提供一种能有效利用棕榈废油、降低生产成本、并高效产出单细胞蛋白的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法。
为解决上述问题，本发明所述的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法，具体为：在无菌发酵培养基中接入微生物种子液和无菌棕榈废油后，以棕榈废油为碳源在好氧条件下进行发酵；发酵期间往发酵液中流加无菌棕榈废油。批次发酵培养周期通常为24～96小时。
无菌棕榈废油可通过对棕榈废油进行高温高压灭菌获得。所述的棕榈废油可以采用以下（1）、（2）、（3）、（4）、（5）中的一种或多种混合：
（1）有酸值或酸值过高的棕榈毛油；
（2）不符合国家质量标准的棕榈毛油；
（3）用于油炸食品后废弃的棕榈油；
（4）工业棕榈废油及棕榈油生产工艺经脱酸、脱臭过程中产生的馏出物；
（5）棕榈油脂、棕榈油渣。
好氧条件是指微生物发酵环境中存在氧气，可以用本领域常规的方法获得好氧条件，例如可在发酵过程中通过设置搅拌转速和通气量保证一定的溶氧。
本发明用棕榈废油替换碳源，不仅降低原料成本，而且还能利用棕榈废油、开拓棕榈废油的应用领域。这里发酵培养基可以采用含碳源的发酵培养基，也可以采用完全不含碳源的发酵培养基。除用棕榈废油替代碳源外，本发明中的发酵培养基中除碳源（这里碳源含量可以为零）以外的其他成分可与常规的用于微生物发酵的发酵培养基中除碳源以外的其他成分相同。
进一步地，前述的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法，其中，当发酵培养基中不含碳源时，棕榈废油的初始添加量为5～100g/l。发酵培养基中棕榈废油的初始添加量还可以是5～20g/l、10～20g/l、5～10g/l、5～15g/l，其中发酵培养基中棕榈废油的初始添加量优选10g/l。
微生物种子液是通过将微生物接入种子培养基中进行发酵制备得到，微生物接入种子培养基中的接种量为种子培养基体积的1%～10%。种子培养基是本领域技术人员根据待接种的微生物可常规选择，例如葡萄糖酵母蛋白胨培养基。微生物种子液的发酵条件可以是本领域常规的适合种子液的发酵条件。
进一步地，前述的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法，其中，所述的微生物种子液中的微生物包括：酵母、微藻、紫色非硫光合细菌、青霉菌中的一种或多种。
进一步地，前述的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法，其中，所述的酵母包括：产朊假丝酵母、热带假丝酵母、园拟酵母、球拟酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶罗酵母、产油油酯酵母中的一种或多种；所述的微藻包括：沼泽红假单胞菌、类球红假单胞菌、嗜酸红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、红螺菌中的一种或多种。
进一步地，前述的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法，其中，所述的发酵培养基为酵母发酵培养基，所述的酵母发酵培养基的组成成分包括：酵母抽提物0.5～2.5g/l、硫酸镁1～3g/l、氮源5～20g/l、磷酸二氢钾2～5g/l、磷酸氢二钾2～5g/l、微量元素0.002～0.08g/l中的一种或多种。
进一步地，前述的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法，其中，所述的氮源为硫酸铵；所述的微量元素包括：铁、锰、锌、铜、钼元素中的一种或多种。微量元素中各元素的含量可以参照本领域常规的适合微生物发酵的微量元素的含量。通常微量元素以化合物的形式提供，如微量元素的组成成分及各组成成分占发酵培养基的克数为：包括：氯化铁0.01～0.02g/l、硫酸锰0.01～0.02g/l、硫酸锌0.01～0.02g/l、硫酸铜2～4mg/l、钼酸钠2～4mg/l中的一种或多种。
进一步地，前述的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法，其中，微生物种子液的接种浓度为发酵培养基体积的1%～10%。其中，微生物种子液的接种浓度优选为发酵培养基体积的3%～5%。
进一步地，前述的以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法，其中，发酵期间发酵液的发酵温度为25～35℃；发酵期间的通气量为0.5～2.5vvm，发酵期间的通气量还可以是1.0～1.5vvm、1.5～2vvm、1.8～2.5vvm。发酵期间通过通气量和搅拌发酵液配合保证发酵液中的溶解氧为20%～60%；发酵期间往发酵液中流加无菌棕榈废油和氨水。
发酵期间往发酵液中流加无菌棕榈废油，从而使发酵液中的脂肪酸总量控制在0.1～0.5%。发酵液中的脂肪酸总量范围还可以是0.1%～0.4%或0.2%～0.5%。
发酵期间往发酵液中流加氨水，氨水可以选择浓度为20%～30%的浓氨水，氨水既可用作氮源，又可用以调节发酵液的ph值，从而使发酵液的ph值控制在7.2～8。0。发酵液的ph值的更优选范围为7.4～7.8。
本发明的有益效果是：①该方法以棕榈废油替换发酵培养基中的传统碳源，不仅降低原料成本，而且还能利用棕榈废油、开拓棕榈废油的应用领域；此外还能提高微生物的转化率，生产出具有高附加值的单细胞蛋白，极大地降低了生产成本、简化了生产工艺；②以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法相比传统对酸值过高的棕榈废油进行精炼的方法，大大减少了环境污染，对环境友好。
具体实施方式
下面结合优选实施例对本发明所述的技术方案作进一步详细的说明。
实施例一
本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5l发酵罐中分批发酵生产单细胞蛋白为例进行说明。
首先，将解脂耶罗酵母接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备微生物种子液。种子培养基通常采用葡萄糖酵母蛋白胨培养基，其组成成分通常包括：20%的葡萄糖、10%的酵母抽提物、20%的蛋白胨。发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，微生物种子液发酵温度控制在28℃。
在5l发酵罐内投入2l经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，发酵培养基的ph值为7.5。本实施例中所述的发酵培养基的组成成分包括：酵母抽提物1g/l、硫酸镁1g/l、硫酸铵20g/l、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钾3g/l、氯化铁0.01g/l、硫酸锰0.02g/l、硫酸锌0.02g/l、硫酸铜2mg/l、钼酸钠2mg/l。
无菌棕榈废油可以在接种前加入发酵培养基中，也可以与微生物种子液一起加入发酵培养基中。本实施例以无菌棕榈废油在接种前加入发酵培养基中为例进行说明，无菌棕榈废油的初始添加量为10g/l。
通常微生物种子液中含有一定的碳源，因而当将微生物种子接种到发酵培养基中时，发酵液中就含有非常低浓度的碳源，但这些碳源随着发酵的进行会被迅速消耗掉。但作为初始发酵培养基，即接种前的发酵培养基，以棕榈废油取代常规发酵碳源，因此该初始发酵培养基中基本不含有任何碳源。
获得微生物种子液后，按照5%的接种浓度将微生物种子液接入发酵培养基进行发酵培养，培养周期为72小时。其中，发酵罐内发酵液温度控制在28℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为200rpm，发酵罐内初始通气量为1vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%。
发酵培养开始后，往发酵液中流加氨水，本申请使用浓度为25%的浓氨水流加调控，使发酵液的ph值保持在7.5。当发酵液中的脂肪酸总量低于0.1%时，往发酵液中流加无菌棕榈废油，通过添加棕榈废油来调整发酵液中的脂肪酸总量，使发酵液中的脂肪酸总量维持在0.1%～0.5%。
发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀在80℃过滤烘干后称重，测得发酵液中细胞干重为68g/kg。
在发酵过程中，一共使用棕榈废油为56g/kg，得到细胞干重为68g/kg，转化率高达121.4%。
对发酵液进行粗蛋白测定，得到如下结果：1克细胞干重中可以得到56.8%的粗蛋白。粗蛋白测定是一种常规测定方法，因而这里不再赘述具体粗蛋白测定的步骤。
对比实施例一
以市场上常见碳源作为发酵原料进行发酵培养对比，其中碳源采用葡萄糖：
首先，将解脂耶罗酵母接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备微生物种子液。种子培养基通常采用葡萄糖酵母蛋白胨培养基，其组成成分通常包括：20%的葡萄糖、10%的酵母抽提物、20%的蛋白胨。发酵过程可在摇床中进行，摇瓶的转速通常在100～200rpm，微生物种子液发酵温度控制在28℃。
在5l发酵罐内投入2l经121℃高压灭菌的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，发酵培养基的ph值为7.5。本实施例中所述的发酵培养基的组成成分包括：酵母抽提物1g/l、硫酸镁1g/l、硫酸铵20g/l、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钾3g/l、氯化铁0.01g/l、硫酸锰0.02g/l、硫酸锌0.02g/l、硫酸铜2mg/l、钼酸钠2mg/l。
获得微生物种子液后，按照5%的接种浓度将微生物种子液接入发酵培养基进行发酵培养，培养周期为72小时，初始向发酵罐内按照10g/l投入浓度为20%的无菌葡萄糖溶液。发酵罐内发酵液温度控制在28℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为200rpm，发酵罐内初始通气量为1vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%。
发酵培养开始后，往发酵液中流加氨水，这里使用浓度为25%的浓氨水流加调控，使酵液的ph值保持在7.5。当发酵液中的葡萄糖浓度低于1g/l时，往发酵液中补充无菌葡萄糖溶液，控制发酵液中的葡萄糖浓度在1～5g/l。
发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀在80℃过滤烘干后称重，测得发酵液中细胞干重为35.2g/kg。
在发酵过程中，一共使用葡萄糖为66.3g/kg，得到细胞干重为35.2g/kg，转化率为53.09%。
对发酵液进行粗蛋白测定，得到如下结果：1克细胞干重中可以得到54.6%的粗蛋白。
由上述实施例一和对比实施例一可知：本发明以棕榈废油替换发酵培养基中的传统碳源，不仅降低原料成本，而且还能利用棕榈废油、开拓棕榈废油的应用领域；此外还能提高微生物的转化率，生产出具有高附加值的单细胞蛋白，极大地降低了生产成本、简化了生产工艺。
以上所述仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明作任何其他形式的限制，而依据本发明的技术实质所作的任何修改或等同变化，仍属于本发明要求保护的范围。
实施例二
本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以二级连续发酵生产单细胞蛋白为例进行说明，在实际生产中可根据实际需求进行多级连续发酵生产单细胞蛋白。
首先，将解脂耶罗酵母接入1l的种子培养基中进行发酵、制备微生物种子液。种子培养基的组成成分通常包括：葡萄糖10g/l、酵母抽提物1g/l、硫酸镁1g/l、硫酸铵20g/l、硫酸二氢钾3g/l和磷酸氢二钾3g/l。发酵过程可在摇瓶中进行，摇床的转速为200rpm，微生物种子液发酵温度控制在28℃、发酵培养时间为16小时。
在10l发酵罐内投入7l经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，发酵培养基的ph值为7。本实施例中所述的发酵培养基的组成成分包括：酵母抽提物1g/l、硫酸镁1g/l、硫酸铵20g/l、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钾3g/l、氯化铁0.01g/l、硫酸锰0.02g/l、硫酸锌0.02g/l、硫酸铜2mg/l、钼酸钠2mg/l。
一级发酵：获得微生物种子液后，按照10%的接种浓度将微生物种子液接入发酵培养基进行发酵培养，培养时间为24小时。发酵罐内发酵液温度控制在28℃，发酵罐中的搅拌设备的搅拌转速为300rpm，发酵罐内初始通气量为1vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%。发酵罐内发酵液的ph值为7.0。
发酵培养开始后，往发酵液中流加氨水，本申请使用浓度为25%的浓氨水流加调控，使酵液的ph值保持在7.5。初始向发酵罐内按照10g/l投入无菌棕榈废油，当发酵液中的脂肪酸总量低于0.1%时，往发酵液中流加无菌棕榈废油，通过添加棕榈废油来调整发酵液中的脂肪酸总量，使发酵液中的脂肪酸总量维持在0.1%～0.5%。
二级发酵：将一级发酵中的发酵液作为二级发酵中的微生物种子液，按照10%的接种浓度将一级发酵中的发酵液投入100l发酵罐的发酵培养基中进行发酵培育，培养时间为72小时。发酵罐内发酵液温度控制在28℃，发酵罐中的搅拌设备的搅拌转速为200rpm，发酵罐内初始通气量为1.5vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%。发酵罐内发酵液的ph值为7.5。
其中，100l发酵罐内装有70l的发酵培养基。本实施例中所述的发酵培养基的组成成分包括：酵母抽提物1g/l、硫酸镁1g/l、硫酸铵20g/l、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钾3g/l、氯化铁0.01g/l、硫酸锰0.02g/l、硫酸锌0.02g/l、硫酸铜2mg/l、钼酸钠2mg/l。
发酵培养开始后，往发酵液中流加氨水，本申请使用浓度为25%的浓氨水流加调控，使酵液的ph值保持在7.5。初始向发酵罐内按照10g/l投入无菌棕榈废油，当发酵液中的脂肪酸总量低于0.1%时，往发酵液中流加无菌棕榈废油，通过添加棕榈废油来调整发酵液中的脂肪酸总量，使发酵液中的脂肪酸总量维持在0.1%～0.5%。在流加氨水和棕榈废油的过程中，当发酵罐内的发酵液超过80l时需要对发酵罐内的发酵液进行泄放作业，以控制发酵罐内的发酵液不超过80l。
发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀在80℃过滤烘干后称重，测得发酵液中细胞干重为60.8g/kg。
在发酵过程中，一共使用棕榈废油为51.2g/kg，得到细胞干重为60.8g/kg，转化率高达118.75%。
对发酵液进行粗蛋白测定，粗蛋白测定是一种常规测定方法，得到如下结果：1克细胞干重中可以得到58.1%的粗蛋白。
以上所述仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明作任何其他形式的限制，而依据本发明的技术实质所作的任何修改或等同变化，仍属于本发明要求保护的范围。
本发明的优点是：①该方法以棕榈废油替换发酵培养基中的传统碳源，不仅降低原料成本，而且还能利用棕榈废油、开拓棕榈废油的应用领域；此外还能提高微生物的转化率，生产出具有高附加值的单细胞蛋白，极大地降低了生产成本、简化了生产工艺；②以棕榈废油为原料生产单细胞蛋白的发酵方法相比传统对酸值过高的棕榈废油进行精炼的方法，大大减少了环境污染，对环境友好。