一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽及其制备方法与应用与流程

本发明属于水产功能性肽技术领域，具体涉及一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽及其制备方法与应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，对具有维持机体健康，预防疾病发生的抗氧化产品的需求越来越大。以食物蛋白源为原料，采用生物酶解法制备的抗氧化肽由于具有天然、安全、无毒副作用的特点，越来越受到人们的青睐。鸢乌贼是一种高蛋白低脂肪海洋生物，具有较高的营养价值。我国南海鸢乌贼的生物量巨大，年捕捞量可达到两百万吨，资源极为丰富，但由于其肉质较硬，不符合大众消费口味，从而导致该蛋白资源目前未得到充分开发与利用，其精深加工水平与高值化利用程度较低。前期研究发现，鸢乌贼蛋白酶解产物具有较好的抗氧化性，但由于高活性抗氧化肽通常具有分子量小、肽链短、线性结构等特点，难以在油/水界面形成稳定的吸附膜，因此其乳化等功能特性较差，难以应用到乳液、奶油等产品中。因此，采用生物酶法等技术，以海洋中资源极为丰富的鸢乌贼为原料，制备兼具乳化活性与抗氧化活性的蛋白肽将具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽及其制备方法与应用。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明提供的一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明公开了以鸢乌贼为原料，制备一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽的方法，包括以下步骤:(1)鸢乌贼蛋白提取；(2)鸢乌贼蛋白预处理及控制酶解；(3)鸢乌贼蛋白肽的分离富集；(4)鸢乌贼蛋白肽的限制性酶法交联；采用本发明方法制备的鸢乌贼蛋白肽兼具较好的乳化活性与抗氧化活性，此外，本发明中公开的上述鸢乌贼蛋白肽的制备方法，工艺较为简单，产品安全，可应用于实际生产中。

本发明提供的一种制备上述的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽的方法，包括如下步骤：

(1)鸢乌贼蛋白提取

将鸢乌贼去除头、内脏后洗净、沥干，用绞肉机绞成肉糜，将肉糜加入水中，混合均匀，得到肉糜液，调节肉糜液的ph为碱性(优选用0.1-1mol/lnaoh溶液调节)，搅拌处理(常温)，离心取上清液，将上清液的ph调节为酸性(可以用0.1-1mol/lhcl溶液调节)，离心取沉淀，加水，混合均匀得到混合液，调节混合液的ph值为中性(可以用0.1-1mol/lnaoh溶液调节)，去离子水进行透析至透析液中检测不出盐离子，浓缩，干燥得到鸢乌贼蛋白；

(2)鸢乌贼蛋白预处理及控制酶解

将步骤(1)所述鸢乌贼蛋白加入水中，高压均质处理，混合均匀得到鸢乌贼蛋白的水溶液，调节鸢乌贼蛋白的水溶液ph值为6.5-8.0，升温，加入蛋白酶进行酶解反应，然后进行灭酶处理，离心取上清液，得到酶解液；

(3)鸢乌贼蛋白肽的分离富集

将步骤(2)所述酶解液通过超滤膜，取滤过液；将所述滤过液通过葡聚糖凝胶层析柱，用洗脱液洗脱，收集分子量为300da-900da的组分，浓缩，干燥，得到纯化后的蛋白肽；

(4)鸢乌贼蛋白肽的限制性酶法交联

将步骤(3)所述纯化后的蛋白肽加入水中，混合均匀，得到蛋白溶液，调节所述蛋白溶液的ph值为7.0-8.0，然后加入谷氨酰胺转胺酶(tgase)，水浴加热，然后进行灭酶处理，离心取上清液，浓缩，干燥得到所述具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽。

进一步地，步骤(1)所述肉糜与水的质量比为1:5-1:20；所述调节肉糜液的ph为碱性，是使调节后的肉糜液ph值为8.0-11.0；所述搅拌处理的搅拌速率为60-1200r/min，搅拌处理的时间为0.5-3h；所述将上清液的ph调节为酸性，使调节后的上清液的ph值为4.0-6.0。

进一步地，步骤(1)所述沉淀与水的质量比为1:1-1:5；所述透析处理的时间为24h，所述透析处理的透析膜孔径为200-1000da。

进一步地，步骤(2)所述鸢乌贼蛋白的水溶液的质量百分比浓度为1-10wt％；所述均质处理的压力为20-80mpa；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、复合蛋白酶及中性蛋白酶中的两种以上，所述蛋白酶的质量为鸢乌贼蛋白质量的0.2wt％-0.5wt％；所述酶解反应的温度为50-65摄氏度，酶解反应的时间为3-8h；所述灭酶处理的温度为90-95摄氏度，灭酶处理的时间为20-40min。

优选地，步骤(2)所述均质处理的次数为1-3次。

进一步地，步骤(3)所述超滤膜的截留分子量为1-10kda，所述洗脱液为超纯水。

进一步地，步骤(4)所述蛋白溶液的质量百分比浓度为1-5wt％；所述谷氨酰胺转胺酶的添加量为纯化后的蛋白肽质量的0.1-1.0wt％；所述水浴加热的温度为35-45摄氏度，所述水浴加热的时间为30-240min；所述灭酶处理的温度为90-95摄氏度，所述灭酶处理的时间为20-40min。

进一步地，步骤(1)、步骤(3)及步骤(4)所述浓缩的方式包括真空浓缩，步骤(1)、步骤(3)及步骤(4)所述干燥的方式包括冷冻干燥及喷雾干燥。

优选地，步骤(1)所述离心的离心速率为4000-12000rpm，离心的时间为15-40min；步骤(2)及步骤(4)所述离心的离心速率为4000-10000r/min；离心的时间为15-30min，离心的温度为4-25摄氏度。

进一步优选地，步骤(2)及步骤(4)所述离心的温度为4摄氏度。

本发明提供的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽能够应用在制备乳液和奶油中。

本发明在前期筛选抗氧化性最好的组分(具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽)时，在步骤(3)所述收集洗脱液的步骤中，分段收集洗脱液各组分，同时检测收集的各组分的dpph自由基清除率和oh自由基清除率，根据dpph自由基清除率和oh自由基清除率检测结果，收集dpph自由基清除率和oh自由基清除率最高的组分即为抗氧化性最好的组分。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供的制备方法，采用生物酶法等技术，以鸢乌贼为原料，制备出具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽；所述具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽，其乳化活性好，eai能达140-200m²/g，乳化稳定性高，在室温条件下esi为70-120min，抗氧化活性高，在样品蛋白浓度为1mg/ml时dpph自由基清除率60-80％，羟自由基清除率50-70％；

(2)本发明提供的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽的制备方法，具有工艺简便、产品安全及可应用于实际生产等优点。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)将鸢乌贼去除头、内脏后洗净、沥干，用绞肉机绞成肉糜，取肉糜200g将其与水按1:10(w/w)混合，用1mol/lnaoh溶液调节ph值至9.5，常温搅拌1.5h(转速为60r/min)，在离心速率为4000rpm，温度为常温条件下离心20min，取上清液，用1mol/lhcl溶液调节ph值至5.0，在离心力为10000g，温度为常温条件下离心40min，取沉淀物，加去离子水20ml，用0.5mol/lnaoh溶液调节ph值至7.0使其充分溶解，用去离子水透析(透析袋截留分子量为1000da)24h，取未滤过部分，真空浓缩、冷冻干燥后制备得到鸢乌贼蛋白；

(2)将步骤(1)所述鸢乌贼蛋白配成质量百分比浓度为5.0wt％的蛋白水溶液，用高压均质机在压力为80mpa下处理2次，混合均匀，调节溶液ph值为7.0、温度为55℃，加入木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶(2:1:1，w/w/w)，加酶量为0.2％(w/w)底物蛋白(即所述鸢乌贼蛋白)，酶解5h，在温度为90℃下灭酶30min，在离心力为4000g，温度为4℃下，离心20min，过滤取上清液，得酶解液；

(3)将步骤(2)所述酶解液过截留分子量为1kda的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过葡聚糖凝胶层析柱，分段收集洗脱液各组分，收集分子量为900-500da组分，真空浓缩、喷雾干燥，得到纯化后的肽粉；

(4)将步骤(3)所述纯化后的肽粉加入水中，混合均匀，配成蛋白质量百分比浓度为3wt％的溶液，调节溶液ph值至7，添加tgase，加酶量为0.5％(w/w)底物蛋白，在40℃水浴下反应90min，再在温度为95℃下灭酶30min，在离心速率为4000rpm，温度为4℃下，离心20min，过滤取上清液，经真空浓缩、喷雾干燥后得到所述具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽。

实施例2

一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)将鸢乌贼去除头、内脏后洗净、沥干，用绞肉机绞成肉糜，取肉糜400g将其与水按1:5(w/w)混合，用0.8mol/lnaoh溶液调节ph值至8.5，常温搅拌2h(转速为1200r/min)，在离心速率为8000rpm，温度为常温条件下离心30min，取上清液，用0.8mol/lhcl溶液调节ph值至5.5，在离心力为8000g，温度为常温条件下离心25min，取沉淀物，加去离子水200ml，用0.4mol/lnaoh溶液调节ph值至7.0使其充分溶解，用去离子水透析(透析袋截留分子量为100da)24h，取未滤过部分，真空浓缩、冷冻干燥后制备得鸢乌贼蛋白；

(2)将步骤(1)所述鸢乌贼蛋白加入水中，混合均匀，配成质量百分比浓度为8.0wt％的蛋白水溶液，用高压均质机在压力为60mpa下处理3次，调节溶液ph值为7.5、温度为60℃，加入木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶(1:1:2，w/w/w)，加酶量为0.5％(w/w)底物蛋白(即所述鸢乌贼蛋白)，酶解4h，在温度为95℃下灭酶20min，在离心力为5000g，温度为4℃下，离心25min，过滤取上清液，得酶解液；

(3)将步骤(2)所述酶解液过截留分子量为3kda的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过葡聚糖凝胶层析柱，分段收集洗脱液各组分，收集分子量为300-700da的组分，真空浓缩、喷雾干燥，得到纯化后的肽粉；

(4)将步骤(3)所述纯化后的肽粉加入水中，混合均匀，配成质量浓度为2％的蛋白溶液，调节溶液ph值至7.5，添加tgase，加酶量为0.2％(w/w)底物蛋白，在45℃水浴下反应70min，再在温度为95℃下灭酶20min，在离心速率为8000rpm，温度为4℃下，离心30min，过滤取上清液，经真空浓缩、喷雾干燥后得具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽。

实施例3

一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)将鸢乌贼去除头、内脏后洗净、沥干，用绞肉机绞成肉糜，取肉糜100g将其与水按1:20(w/w)混合，用0.6mol/lnaoh调节ph值至10，常温搅拌1h(600r/min)，在离心力为7000g，温度为常温条件下离心25min，取上清液，用0.6mol/lhcl调节ph值至4.5，在离心速率为10000rpm，温度为常温条件下离心30min，取沉淀物，加去离子水50ml，用0.8mol/lnaoh调节ph值至7.0使其充分溶解，用去离子水透析24h(透析袋截留分子量为500da)，真空浓缩、冷冻干燥后制备得到鸢乌贼蛋白；

(2)将步骤(1)所述鸢乌贼蛋白加入水中，混合均匀，配成质量浓度为3％的蛋白水溶液，用高压均质机在压力为40mpa下处理2次，调节溶液ph值为8、温度为55℃，加入木瓜蛋白酶、复合蛋白酶(1:1，w/w)，加酶量为0.4％(w/w)底物蛋白，酶解8h，在温度为95℃下灭酶20min，在离心力为8000g，温度为4℃下，离心15min，过滤取上清液，得酶解液；

(3)将步骤(2)所述酶解液过截留分子量为5kda的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过葡聚糖凝胶层析柱，分段收集洗脱液各组分，收集分子量为400-800da组分，真空浓缩、喷雾干燥，得到纯化后的肽粉；

(4)将步骤(3)所述纯化后的肽粉加入水中，混合均匀，配成质量浓度为5％的蛋白溶液，调节溶液ph值至7.5，添加tgase，加酶量为0.4％(w/w)底物蛋白，在35℃水浴下反应200min，再在温度为95℃下灭酶30min，在离心速率为10000rpm，温度为4℃下，离心30min，过滤取上清液，经真空浓缩、喷雾干燥后得具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽。

实施例4

一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)将鸢乌贼去除头、内脏后洗净、沥干，用绞肉机绞成肉糜，取肉糜300g将其与水按1:10(w/w)混合，用0.4mol/lnaoh调节ph值至11，常温搅拌1h(800r/min)，在离心力为10000g，温度为常温条件下离心20min，取上清液，用0.4mol/lhcl调节ph值至4，在离心速率为10000rpm，温度为常温条件下离心20min，取沉淀物，加去离子水100ml，用0.4mol/lnaoh调节ph值至7.0使其充分溶解，用去离子水透析24h(透析袋截留分子量为800da)，真空浓缩、冷冻干燥后制备得到鸢乌贼蛋白；

(2)将步骤(1)所述鸢乌贼蛋白配成质量浓度为4％的蛋白水溶液，用高压均质机在压力为70mpa下处理1次，调节溶液ph值为7、温度为50℃，加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶(1:1，w/w)，加酶量为0.2％(w/w)底物蛋白，酶解5h，在温度为95℃下灭酶20min，在离心力为6000g，温度为4℃下，离心20min，过滤取上清液，得酶解液；

(3)将步骤(2)所述酶解液过截留分子量为10kda的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过葡聚糖凝胶层析柱，分段收集洗脱液各组分，收集分子量为600-300da组分，真空浓缩、喷雾干燥，得到纯化后的肽粉；

(4)将步骤(3)所述纯化后的肽粉加入水中，混合均匀，配成质量浓度为3％的蛋白溶液，调节溶液ph值至7，添加tgase，加酶量为0.5％(w/w)底物蛋白，在40℃水浴下反应45min，再在温度为95℃下灭酶20min，在离心速率为12000rpm，温度为4℃下，离心30min，过滤取上清液，经真空浓缩、喷雾干燥后得具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽。

效果验证

dpph自由基清除率的测定方法，包括如下步骤：

(1)实验组：分别取实施例1制得的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽以及实施例1中步骤(1)得到的鸢乌贼蛋白加入水中，分别混合均匀配制成样液(鸢乌贼蛋白肽样液及鸢乌贼蛋白肽交联物样液)；然后将2ml样液与2ml浓度为0.15mmdpph溶液(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼与体积分数为95％乙醇混合均匀制得的)，混匀后于室温下避光反应30min，在517nm处测得其吸光值，此吸光值用ai表示；

(2)空白组：取2ml体积分数为95％乙醇溶液与2ml步骤(1)所述样液混合均匀，在517nm处测得其吸光值，此吸光值用aj表示；

(3)对照组：取2mldpph溶液(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼与体积分数为95％乙醇混合均匀制得的)加入2ml体积分数为95％乙醇溶液中，混合均匀，然后在517nm处测得其吸光值，此吸光值用a0表示；

(4)对步骤(1)所述样液做梯度稀释，测定其不同浓度下的自由基清除率，经线性回归后计算出自由基清除率为50％时的浓度，即ic50值；清除率按以下公式进行计算：清除率(％)＝[1-(aj-ai)/a0]×100％，式中：a0为对照组吸光值；ai为样品组吸光值；aj为空白组吸光值。

oh自由基清除率的测定方法，包括如下步骤：

(1)样品组：取0.6ml浓度为5mmol/l邻二氮菲的无水乙醇溶液，先加入0.4ml浓度为0.15mol/l的磷酸盐缓冲液(ph7.40)和0.6ml0.75mmol/l的feso4，再加入2ml样液混匀后，最后加入0.4ml0.1％(v/v)的h2o2摇匀，37℃下水浴60min后在536nm处测定得吸光值，此吸光值表示为a样品；所述样液为dpph自由基清除率的测定方法的步骤(1)中配制的样液(鸢乌贼蛋白肽样液及鸢乌贼蛋白肽交联物样液)，两种样液分别采用上述的方法测定；

(2)未损伤组：与步骤(1)的操作相同，唯一不同的是用去离子水代替样液和h2o2溶液重复上述操作，在536nm处测得其吸光值，此吸光值表示为a未损伤；

(3)损伤组：与步骤(1)的操作相同，唯一不同的是用去离子水代替样液来重复以上操作，在536nm处测得吸光值，此吸光值表示为a损伤。

(4)将对样液做梯度稀释，测定其不同浓度下的自由基清除率，经线性回归后计算出自由基清除率为50％时的蛋白浓度，即ic50值；清除率按如下公式进行计算：清除率(％)＝(a样品–a损伤)/(a未损伤–a损伤)×100％，式中：a样品为样品组的吸光值；a损伤为损伤管的吸光值；a未损伤为未损伤管的吸光值。

图1为实施例1制得的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽以及实施例1中步骤(1)得到的鸢乌贼蛋白的抗氧化活性的柱状图。图1中的鸢乌贼蛋白肽表示步骤(1)得到的鸢乌贼蛋白，图1中的鸢乌贼蛋白肽交联物表示具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽；由图1可知，实施例1中步骤(1)得到的鸢乌贼蛋白具有很好的抗氧化活性，其浓度为1mg/ml时，dpph自由基清除率在65％以上，羟自由基清除率在50％以上，交联后制得的蛋白肽(实施例1制得的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽)的抗氧化活性并无显著性下降。其他实施例制得的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽同样具有很好的抗氧化活性，可参照图1所示。

乳化活性和乳化稳定性测定，包括如下步骤：

分别取0.5g实施例1制得的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽(鸢乌贼蛋白肽交联物)以及0.5g实施例1中步骤(1)得到的鸢乌贼蛋白加入30ml去离子水中，混合均匀，得到蛋白液(鸢乌贼蛋白液与鸢乌贼蛋白肽交联物蛋白液)，分别将所述蛋白液的ph值调到7，加10ml的花生油后以15000r/min的速度高速搅拌1min，立刻从中取出200μl乳浊液待测，待均质的样品静置10min后，再次取样。将两批样品中分别加入质量百分比浓度为0.1wt％的sds溶液(十二烷基硫酸钠溶液)5ml，测其在500nm处的吸收，并以质量百分比浓度为0.1％sds溶液作为空白调零。乳化能力eai和乳化稳定性esi可按照以下公式计算:

乳化活性用乳化活性指数(eai)表示：

乳化稳定性用乳化稳定性指数(esi)表示：

esi(min)＝(a0×δt)/(a0-a10)；

式中：n-稀释倍数100；ρ-样品质量浓度(g/ml)；-植物油的体积分数(25％)；a0-第一批样品的吸光度值；a10-均质10min后的样品吸光度；δt-静置时间(10min)。

图2为鸢乌贼蛋白肽交联前后的乳化性柱状图。图2中的鸢乌贼蛋白肽表示实施例1步骤(1)得到的鸢乌贼蛋白，图2中的鸢乌贼蛋白肽交联物表示实施例1制得的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽；由图2可知，实施例1制得的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白具有一定的乳化活性(eai)与乳化稳定性(esi)，但数值偏低，经交联后，制得的鸢乌贼蛋白肽交联物(即所述具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽)，其乳化活性提升3倍左右，乳化稳定性提升2倍左右。其他实施例制得的具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽同样具有很好的乳化活性和乳化稳定性，可参照图2所示。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110>中国水产科学研究院南海水产研究所

<120>一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽及其制备方法与应用

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<170>siposequencelisting1.0

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<213>鸢乌贼(symplectoteuthisoualaniensis)

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