草莓植株萃取物、萃取方法及其用于免疫调节及抗发炎的用途与流程

本发明是有关于一种草莓植株萃取物，且特别是一种与nf-κb蛋白的抑制区结合的草莓植株萃取物及其用于免疫调节及抗发炎的用途。

背景技术：

“植物化合物”(phytochemical)是指植物生长过程中产生对人体健康具特殊作用的有机化学物质，通过一定的手段方法可以将这些有机化学物质分离提纯出来，用于食品、医疗等目的。

过去，人们仅仅知道植物是人类食物的主要来源，一般的植物食物都含有碳水化合物、维生素、微量元素以及其它营养物质，而对植物中还含有其他对人体健康具特殊作用的化合物却了解甚微。植物化合物可统称的为“植物化学物质”，每一种植物都如同一座小型的生化工厂。例如，仅仅在常食用的西红柿中，就含有多达1万种以上的植物化学物质，通过一定手段将它们分离出来，就相当于1万种新的“药物”。

nf-κb(nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedbcells)是一种蛋白复合体，其能控制生物细胞内dna的转录工作，在所有的动物细胞中都可以找到它的存在，它的工作是应付诸如压力、细胞激素、自由基、紫外线辐射、已氧化的低密度蛋白、细菌或病毒的抗原等因素对细胞的刺激，与调节身体免疫系统有关。nf-κb的不正常调节则跟癌症、发炎、自身免疫疾病、败血症、病毒感染有关。

目前有多种药物被证实藉由影响nf-κb的活性，可以抑制癌症早期的发炎反应。例如，nf-κb被阿司匹林(aspirin)或其他非类固醇性抗发炎药物(nsaid)作用而抑制，阻断部分肿瘤的进展，特别是大肠直肠癌。而其他如用于治疗肠发炎和气喘等疾病的类固醇治疗，也极有可能是藉由抑制nf-κb的活性来达成。另外，过去常使用于头颈部癌症患者的化学治剂，5-fu(fluorouracil)，也被证实和抑制nf-κb的表现有关。

因此，nf-κb可作为一个选择性的识别标把，用以改善多种炎症疾病，包含关节炎、气喘和自身免疫疾病，在过去的医学研究报导中，多以药物合成的方式致力于寻找能干扰nf-κb调控途径的化合物。

技术实现要素：

综上所述，本发明的一个目的为提供一种草莓植株萃取物的萃取方法，藉由控制植物生长环境条件促进植物化合物的表现，萃取得到含高量植物化合物的草莓植株萃取物。

根据本发明的一个实施方式，提供一种草莓植株萃取物的萃取方法，包括于始花期(anthesis)至初果期(firstharvest)的期间，暗培养(darklyincubation)4-7天后，以草莓果实呈绿-白色、白色或白-红色为采收标准，采收全植株后进行乙醇萃取。

根据本实施方式的一个实施例，所述草莓植株包含60％-95％的草莓根、茎、叶、花萼的总和，以及5％-40％的草莓果实。

根据本实施方式的一个实施例，其中乙醇为95％的乙醇。

根据本实施方式的实施例，其中草莓植株为选自由fragaria×ananass、fragariahayataimakino、fragariachiloensis、fragarianilgerrensis、fragarianipponica、fragarianilgerrensisschlecht、fragariavirginiana、fragaria×vesca、fragariaiturupensisstaudt及其任意组合所组成的群组。

根据本实施方式的一个实施例，其中该草莓植株萃取物包含可与nf-κb的抑制区结合的化合物(a)：

本发明的另一个目的为提供一种草莓植株萃取物的用途，包括用于制备具有免疫调节与抑制细胞促发炎介质的分泌功效的组合物的医药产品、食品或营养补充品的用途。

根据本发明的一个实施方式，提供一种组合物，包含草莓植株萃取物及视需要的可食用载剂。

根据本实施方式的实施例，其中食品组合物为一种健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品或特殊营养食品。

根据本实施方式的实施例，其中食品组合物为饮料、锭剂、丸剂、胶囊、药锭糖(lozenge)、颗粒、粉剂、悬浮剂、小药囊、软锭剂、糖果、棒或糖浆的形式。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1是根据本发明一个实施例的fischer’scross-validation测试结果图；

图2是nf-κb三维立体空间的轮廓讯息型态；

图3是抑制化合物ksa与nf-κb蛋白结合的二维平面状态图；

图4是抑制化合物ksa的解晶构型与嵌合构型重迭结果；

图5(a)及图5(b)分别为本发明的植物化合物式(1)与nf-κb蛋白嵌合的三维状态图与二维状态图；

图6(a)及图6(b)分别为本发明的植物化合物式(2)与nf-κb蛋白嵌合的三维状态图与二维状态图；

图7(a)及图7(b)分别为本发明的植物化合物式(3)与nf-κb蛋白嵌合的三维状态图与二维状态图；

图8(a)及图8(b)分别为本发明的植物化合物式(4)与nf-κb蛋白嵌合的三维状态图与二维状态图；以及

图9(a)及图9(b)分别为本发明的植物化合物式(5)与nf-κb蛋白嵌合的三维状态图与二维状态图。

图10(a)、(b)分别为本发明不同成熟条件下的草莓植株萃取物(sbe)进行免疫细胞抗发炎测试的结果。

图11(a)、(b)、(c)分别为本发明不同萃取条件下的草莓植株萃取物(sbe)进行免疫细胞抗发炎测试的结果。

图12为草莓植株萃取物的分离流程图。

图13为草莓植株萃取物的正丁醇层萃取物样品的高效能液相层析图。

具体实施方式

本发明利用计算机辅助药物设计(computer-aideddrugdesign，cadd)于农用植物化合物数据库中筛选出与nf-κb抑制区结合的植物化合物，经由植物萃取技术后将其用于制备增强免疫调节及/或抗发炎活性的医药产品、食品或营养补充品。藉此将药物设计与上游农业产业相结合，进而提升农业经济价值。

根据本发明一个实施方式，利用计算机辅助药物设计于农用植物化合物中筛选出下列式(1)、式(2)、式(3)、式(4)、或式(5)的化合物：

其中植物来源为草莓(strawberry)、梨(pyrusbourgaeana)、草苁蓉(boschniakiarossica)、罗汉果(siraitiagrosvenorii)、或甜椒(sweetpepperfruitsofcapsicumannuuml)。

根据本发明一个实施例，上述植物化合物可与视需要的可食用载剂形成组合物。组合物可以是饮料、锭剂、丸剂、胶囊、药锭糖(lozenge)、颗粒、粉剂、悬浮剂、小药囊、软锭剂、糖果、棒或糖浆的形式。

根据本发明另一个实施例，上述植物化合物与组合物可用于制备增强免疫调节及/或抗发炎活性的医药产品、食品或营养补充品。

本发明的营养补充品包括食品补充品及机能性食品。“食品补充品”指从通常食品中使用的化合物制成的产品，但其为锭剂，粉剂，胶囊，药剂或通常不与滋养品有关且具有对人的健康具有益效果的其他任何形式。“机能性食品”是滋养品，其也对人的健康具有益效果，例如，商品名为nucleiclavem^tm的营养补充品。

如根据本发明的组合物是膳食补充品，其可与合适的可饮用液体混合，例如水、酸奶酪、牛奶或果汁、或可与固体或液体食品进行混合。膳食补充品的形式可为锭剂、丸剂、胶囊、药锭糖(lozenge)、颗粒、粉剂、悬浮剂、小药囊、软锭剂、糖果、棒、糖浆及相应的投予形式，通常为单位剂量的形式。较佳地，包含本发明组合物的膳食补充品以锭剂、药锭糖(lozenge)、胶囊或粉末的形式投予，以制备膳食补充品的常规方法制造。

实验例1-1筛选系统建置

根据天然物探索架构(naturalproductindexapproach，npia)流程，建立了具有高准确度的筛选系统以进行后续植物化合物筛选。于6000组训练组中找到其中一组训练组，并利用fischer’scross-validation来检测这组训练组是否具有充足的信心水平。

在检测中将训练组中的分子结构随机分配生物活性产生药效基团，执行次数为99次，观察在随机重组中所产生出来的药效基团是否会与原始所产生出来的数据相同。请参照图1，其是本发明一个实施例的fischer’scross-validation测试结果，其显示执行99次中的最后10次的结果，发现利用随机方法(random01～random10)所产生出来的结果都无法达到与原始训练组(cost)产生相同的数据，代表所选择的训练组具有高度信心水平，无法以随机产生。

接着，利用所产生的药效基团作为迭合条件，将前述训练组化合物的三维构型透过药效基团于三维空间中的化学特性作为基准点迭合，再将迭合好的训练组化合物加上gasteiger-hückel电荷，并施加charmm(chemistryatharvardmacromolecularmechanics)力场，以sp³混成的碳原子(sp³-hybridizedcarbonatom)当作探针于立体空间计算nf-κb的轮廓讯息(contourinformation)。

图2是nf-κb三维立体空间的轮廓讯息型态。经过计算，得到r²ncv系数为0.99，估计标准误差(standarderroroftheestimate，see)为0.16，nf-κb的轮廓讯息的组成为立体性(steric)、静电性(electrostatic)、疏水性(hydrophobic)、氢施者(hydrogendonor)、氢接受者(hydrogenacceptor)，其比例为0.16、0.18、0.20、0.21、0.25，如图2所示。

实验例1-2植物化合物探索

将农业植物化合物数据库中的所有植物化合物分别产生出三维构型，并将每个植物化合物皆迭合至药效基团上，且记录迭合后的三维构型。接着，将迭合好的每一个植物化合物结果以化学轮廓进行生物活性预测，找到如下列式(1)、式(2)、式(3)、式(4)、式(5)的植物化合物：

其中植物来源为草莓、罗汉果、草苁蓉、梨、或甜椒。

实验例1-3嵌合参数设定与测试

nf-κb的蛋白质结构采用2013年发表于生物化学期刊(journalofbiologicalchemistry)的蛋白质结晶结构，其在蛋白质数据库(proteindatabank)中代号为4kik，分辨率为nf-κb为三聚体结构，其结构中包含一个抑制化合物ksa。图3是抑制化合物ksa与nf-κb蛋白结合的的二维平面状态图，藉此了解nf-κb抑制区域的氨基酸信息。

利用charmm-basedmoleculardynamicsdocking计算方法，进行nf-κb与植物化合物结合后的结构预测。为确定此计算方法能有效将植物化合物嵌合至nf-κb蛋白结构内，并使嵌合后的三维构型与实际解晶构型接近，先利用抑制化合物ksa找出嵌合参数。图4是抑制化合物ksa的解晶构型与嵌合构型(绿色)重迭结果，其方均根差(root-mean-squaredeviation，rmsd)为0，显示所找出的嵌合参数可使欲嵌入nf-b蛋白结构内的化合物有效仿真出其解晶状态。

图5a、5b至图9a、9b分别为本发明的植物化合物式(1)、式(2)、式(3)、式(4)、及式(5)与nf-b蛋白嵌合的三维状态图与二维状态图。各图中分别显示本发明的植物化合物式(1)、式(2)、式(3)、式(4)、及式(5)嵌合于nf-κb蛋白中与氨基酸产生交互作用的状态，皆符合nf-κb蛋白抑制区的空间大小，可达到藉由抑制nf-κb蛋白活性进而具有增强免疫调节及/或抗发炎活性的功效。

实验例2-1植物化合物萃取

利用计算机辅助药物设计于植物化合物中筛选出的化合物(a)，经数据库比对后，取得合适的植株进行萃取，以实测其活性：

经数据库搜索，其植物化合物来源可为草莓，草莓品种可包含但不仅限于fragaria×ananass、fragariahayataimakino、fragariachiloensis、fragarianilgerrensis、fragarianipponica、fragarianilgerrensisschlecht、fragariavirginiana、fragaria×vesca或fragariaiturupensisstaudt。

化合物(a)属于一种萜类化合物(terpenes)，根据kim等人(2013)的研究，草莓所含的挥发性萜类化合物包含单萜(monoterpenoids)、倍半萜(sesquiterpenoids)、双萜(diterpenes)、三萜(triterpenes)等，广泛存在于草莓植株的各个部位，特别是根、茎、叶、花萼等绿色部分含量最多。

选择草莓品种fragaria×ananass为例，萃取部位为整株，以不同溶剂进行萃取，并计算其萃取率后，选择95％乙醇为最适溶剂，并以水萃取为对照组。95％乙醇使用热回流萃取装置加热萃取样品，从沸腾开始计算加热3小时，取出加热容器静置冷却。静置放凉后，使用筛网初步过滤样品废弃残渣。接着以布氏漏斗过滤样品，将完成过滤的液体妥善保存于4℃，待浓缩。使用减压浓缩系统进行浓缩(样品加热温度53～56℃，抽真空)后再将所有浓缩的浓稠液体混合均匀，进行真空冷冻干燥并刮取干燥样品。

实验例2-2草莓植株萃取物用于免疫细胞抗发炎测试(一)

由于式1的化合物属于具挥发性的萜类化合物，在草莓成熟过程中扮演提供特殊风味的角色，已知果实在不同环境下熟成，可能诱导植物化合物基因表现而产生不同的风味及外观，因此于始花期(anthesis)至初果期(firstharvest)的期间，以不同温度及光周期作为试验条件，观察草莓成熟过程的环境因素对于草莓植株萃取物的免疫细胞抗发炎效果差异。

在本说明书中所述“始花期”(anthesisstage)是指开花期的开始至花完全开放和具有功能的时期；所述“初果期”(firstharveststage)是指草莓果实长成开始，至完全成熟过程中的初始阶段。

样品于始花期至初果期的期间，分别于25℃及15℃环境、自然光周期(16/8，naturallight)及暗室(darkincubation)条件下，培养2-7天后采收全植株，进行95％乙醇/或水萃取。

95％乙醇萃取的草莓植株萃取物(sbe)以浓度50μg/ml进行初步测试，以鼠类外围巨噬细胞细胞株raw264.7、肺脏巨噬细胞细胞株mhs及神经巨噬细胞细胞株bv2，进行lps刺激模式来测试。lps会诱发刺激no表现释出，将受到lps刺激的细胞培养液进行no(nitrite/nitrate)产量分析。

图10是分别为本发明的不同成熟条件下的草莓植株萃取物(sbe)进行免疫细胞抗发炎测试的结果。图10(a)为在自然光周期(16/8，naturallight)25℃及15℃条件下，培养4天或7天后采收的植株的草莓植株萃取物(sbe)的免疫细胞抗发炎测试结果；图10(b)为于暗室(darkroom)25℃及15℃条件下，培养4天或7天后采收植株的草莓植株萃取物(sbe)的免疫细胞抗发炎测试结果。本发明所有实施例中所述的“草莓植株”包含全株植物，且草莓根、茎、叶的总和占60％-95％、草莓果实占5％-40％。

结果如图10(a)、(b)所示，于暗室(dark)25℃及15℃条件下，处理4天或7天后采收植株的草莓植株萃取物(sbe)，其抗发炎效果明显优于在自然光周期(16/8，naturallight)25℃及15℃条件下，培养4天或7天后采收的植株的草莓植株萃取物(sbe)。

因此，依照本发明的实施方式，欲得到较佳抗发炎功效的草莓植株萃取物(sbe)，于始花期至初果期的期间进行暗培养4-7天，并控制温度于15℃-25℃以下，可促进草莓植株萃取物(sbe)的抗发炎效果，其中以暗培养熟成的草莓果实为绿-白色、白色或白-红色。依照本发明的一实施例，欲得到较佳抗发炎功效的草莓植株萃取物(sbe)，于始花期至初果期的期间进行暗培养4天，并控制温度为15℃以下，可促进草莓植株萃取物(sbe)的抗发炎效果，其中以暗培养熟成的草莓果实为绿-白色、白色或白-红色。

实验例2-3草莓植株萃取物于免疫细胞抗发炎测试(二)

根据上述，将草莓植株于暗室(dark)15℃条件下，处理4-7天后以草莓果实呈现绿-白色、白色或白-红色为采收标准，整株采收进行萃取。其中以95％乙醇(95％etoh)为实验组，以水(h2o)为对照组，分别以草莓植株的95％乙醇萃取物(10ug/ml,50ug/ml,100ug/ml)、草莓植株的水萃取物(10ug/ml,50ug/ml,100ug/ml)处理鼠类外围巨噬细胞细胞株raw264.7、肺脏巨噬细胞细胞株mhs和神经巨噬细胞细胞株bv2细胞株，观察其抑制细胞促发炎介质分泌的效果。

图11为本发明的不同萃取条件下的草莓植株萃取物(sbe)进行免疫细胞抗发炎测试的结果。图11(a)为以细胞株raw264.7进行lps刺激模式的测试结果；图11(b)为以细胞株mhs进行lps刺激模式的测试结果；图11(c)为以细胞株bv2进行lps刺激模式的测试结果。

结果如图11(a)所示，以浓度50、100ug/ml的95％乙醇萃取物处理细胞株raw264.7，具有降低lps刺激no表现的功效，且呈现剂量依赖性；而以草莓植株水萃取物处理的细胞株raw264.7，除了高剂量(100ug/ml)组的外，效果不甚明显。

如图11(b)所示，以浓度10、50、100ug/ml的95％乙醇萃取物处理细胞株mhs，具有降低lps刺激no表现的功效，且呈现剂量依赖性；而以草莓植株水萃取物处理的细胞株mhs，则效果不甚明显。

再参照图11(c)，以浓度10、50、100ug/ml的95％乙醇萃取物处理细胞株bv2，显著降低了lps刺激no的表现，且呈现剂量依赖性；而以草莓植株水萃取物处理的细胞株mhs，于浓度10、50、100ug/ml均呈现出抑制细胞促发炎介质分泌的功效。

因此，依照本发明的实施方式，欲得到较佳抗发炎功效的草莓植株萃取物(sbe)，于始花期至初果期的期间控制温度于15℃-25℃以下并进行暗培养4-7天后采收，再以95％乙醇萃取，可促进草莓植株萃取物(sbe)的抗发炎效果。依照本发明的一实施例，欲得到较佳抗发炎功效的草莓植株萃取物(sbe)，于始花期至初果期的期间控制于温度15℃以下进行暗培养4天，再以95％乙醇萃取，可促进草莓植株萃取物(sbe)的抗发炎效果。

实验例3草莓植株萃取物活性成分的纯化与定量分析

图12为草莓植株萃取物的分离流程图。草莓植株的乙醇萃取物使用分配萃取分离法，分成乙酸乙酯层、正丁醇层及水层。

图13为草莓植株萃取物的正丁醇层萃取物样品的高效能液相层析图。样品制备取10mg草莓植株正丁醇层萃取物，加入1ml二甲基亚砜(dmso)，以0.45μm针筒过滤器过滤，于4℃冷藏备用。以高效能液相层析(highperformanceliquidchromatography；hplc)，进一步进行成分纯化与结构鉴定，纯化formula(1)的化合物。使用c-18液相层析管柱(phenomenexlunac-18column)，移动相(mobilephase)为water/acetonitrile＝0min:93/7,3min:93/7,70min:83/17,75min:38/17)，流速(flowrate)为1ml/min，hplc-uv侦测波长227nm。化合物(a)结构鉴定如下表一。powder；1h-nmr(400mhz,cd3od)and13c-nmr(100mhz,cd3od)。

表一、化合物(a)结构鉴定

根据上述，草莓植株的乙醇萃取物可纯化出化合物(a)，依照本发明的实施例化合物(a)嵌合于nf-κb蛋白中与氨基酸产生交互作用的状态，符合nf-κb蛋白抑制区的空间大小，可达到藉由抑制nf-κb蛋白活性进而具有增强免疫调节及/或抗发炎活性的功效。

根据本发明一实施例，草莓植株萃取物可与视需要的可食用载剂形成组合物。组合物可以是饮料、锭剂、丸剂、胶囊、药锭糖(lozenge)、颗粒、粉剂、悬浮剂、小药囊、软锭剂、糖果、棒或糖浆的形式。

根据本发明另一实施例，上述植物化合物与组合物可用于制备增强免疫调节及/或抗发炎活性的医药产品、食品或营养补充品。本发明的营养补充品包括食品补充品及机能性食品。“食品补充品”指从通常食品中使用的化合物制成的产品，但其为锭剂，粉剂，胶囊，药剂或通常不与滋养品有关且具有对人的健康具有益效果的其他任何形式。“机能性食品”是滋养品，其也对人的健康具有益效果，例如，商品名nucleiclavem^tm的营养补充品。

如根据本发明的组合物是膳食补充品，其可与合适的可饮用液体混合，例如水，酸奶酪，牛奶或果汁，或可与固体或液体食品进行混合。膳食补充品的形式可为锭剂，丸剂，胶囊，药锭糖(lozenge)，颗粒、粉剂、悬浮剂、小药囊、软锭剂、糖果、棒、糖浆及相应的投予形式，通常为单位剂量的形式。较佳地，包含本发明组合物的膳食补充品以锭剂，药锭糖(lozenge)，胶囊或粉末的形式投予，以制备膳食补充品的常规方法制造。

可将上述一种或多种植物化合物与视需要的可食用载剂形成组合物。组合物可以是饮料、锭剂、丸剂、胶囊、药锭糖(lozenge)、颗粒、粉剂、悬浮剂、小药囊、软锭剂、糖果、棒或糖浆的形式。并进而将上述植物化合物或其组合物用于制备增强免疫调节及/或抗发炎活性的医药产品、食品或营养补充品。