本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离和纯化外泌体的方法。
背景技术：
外泌体是一种直径为30-200nm的具有双层脂质分子的包裹的囊性小泡，是由活细胞选择性包装并释放，在人体液中含量丰富，外泌体内含有种类不同的脂质、核酸以及蛋白质等，相关的研究也已经表明，外泌体在细胞间通讯以及生理和病理过程中均发挥着巨大的作用；目前，对于去除外泌体中的杂蛋白是需要迫切解决的问题，在现有的分离和纯化方法中，外泌体重悬液中仍含大量杂蛋白，并非为纯净的外泌体，纯化程度低、速率慢。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种分离和纯化外泌体的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种分离和纯化外泌体的方法，具体按照如下操作步骤：
s1：材料准备，生物体液30ml-100ml、差速离心管1个、纯化柱1个、亲和层析柱1个、羟基磷灰石5g-50g、磷酸二氢钠溶液20ml-80ml、凝集素10ml-40ml、蔗糖溶液40ml-110ml、磷酸缓冲盐溶液、储罐1个、磁力搅拌器1个、无菌过滤器1个；
s2：初次分离，把生物体液置入差速离心管中，依次在300g-500g下离心3min-5min、3000g-5000g下离心3min-5min和10000g-30000g下离心3min-5min分别去除细胞、死细胞和细胞碎片；再利用超高速离心得到外泌体的粗提取物，即在100000g-300000g下离心3min-5min，以去除污染蛋白质得到外泌体悬液；
s3：初次纯化，将凝集素加入外泌体悬液中，并使用磁力搅拌器搅拌混合3min-5min，加速较纯外泌体和杂质的分离沉淀，然后再把磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，稀释悬液杂质，得到较纯外泌体；
s4：过滤纯化，将蔗糖溶液加入差速离心管中，在100000g下离心1小时，蛋白质聚集体会进一步沉降于管底部，含脂类结构的外泌体会沉降到等密度区，从而获得较高纯度的外泌体，再使用无菌过滤器进行反复过滤2次，过滤杂质物得到高纯外泌体；
s5：加强纯化，把羟基磷灰石加入纯化柱中，再将过滤纯化过的外泌体加入纯化柱中，使用磁粒搅拌器进行混匀，摇动孵育后，转移至亲和层析柱中，再使用磷酸二氢钠溶液洗涤2次；
s6：静置混合，使用磁力搅拌器搅拌2min-4min混匀，并静置5min，即得到纯净的外泌体溶液；
s7：外泌体收集，把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存。
优选的，步骤s4中无菌过滤器的规格为0.55μm。
优选的，步骤s5中孵育的时间为10min-70min，摇动的转速为80rpm～150rpm。
优选的，步骤s5中磷酸二氢钠溶液的浓度10mm-60mm。
本发明的技术效果和优点：通过加入凝集素、磷酸缓冲盐溶液、蔗糖溶液与外泌体悬液液的配合反应，逐步加速了外泌体纯化程度，操作更为简单，纯化速度快，再通过无菌过滤器进行过滤，有效去除了外泌体中混合的杂质蛋白，保证了外泌体的纯度和得率，并且通过羟基磷灰石、磷酸二氢钠溶液，去除了外泌体中大量的污染蛋白质，进一步保证了纯化质量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种分离和纯化外泌体的方法，具体按照如下操作步骤：
s1：材料准备，生物体液30ml、差速离心管1个、纯化柱1个、亲和层析柱1个、羟基磷灰石5g、磷酸二氢钠溶液20ml、凝集素10ml、蔗糖溶液40ml、磷酸缓冲盐溶液、储罐1个、磁力搅拌器1个、无菌过滤器1个；
s2：初次分离，把生物体液置入差速离心管中，依次在300g下离心3min、3000g下离心3min和、10000g下离心3min分别去除细胞、死细胞和细胞碎片；再利用超高速离心得到外泌体的粗提取物，即在100000g下离心3min，以去除污染蛋白质得到外泌体悬液；使用差速离心法对外泌体进行分离；
s3：初次纯化，将凝集素加入外泌体悬液中，并使用磁力搅拌器搅拌混合3min，加速较纯外泌体和杂质的分离沉淀，然后再把磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，稀释悬液杂质，得到较纯外泌体；有效增强了杂质分离效率，便于纯化外泌体；
s4：过滤纯化，将蔗糖溶液加入差速离心管中，在100000g下离心1小时，蛋白质聚集体会进一步沉降于管底部，含脂类结构的外泌体会沉降到等密度区，从而获得较高纯度的外泌体，再使用无菌过滤器进行反复过滤2次，过滤杂质物得到高纯外泌体，无菌过滤器的规格为0.55μm；进一步增强了纯化效果，过滤杂质；
s5：加强纯化，把羟基磷灰石加入纯化柱中，再将过滤纯化过的外泌体加入纯化柱中，使用磁粒搅拌器进行混匀，摇动孵育后，转移至亲和层析柱中，再使用磷酸二氢钠溶液洗涤2次，孵育的时间为10min，摇动的转速为80rpm，磷酸二氢钠溶液的浓度10mm；再一次增强了纯化效果，使得外泌体得率高；
s6：静置混合，使用磁力搅拌器搅拌2min混匀，并静置5min，即得到纯净的外泌体溶液；
s7：外泌体收集，把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存；便于外泌体的存放。
实施例2
一种分离和纯化外泌体的方法，具体按照如下操作步骤：
s1：材料准备，生物体液60ml、差速离心管1个、纯化柱1个、亲和层析柱1个、羟基磷灰石35g、磷酸二氢钠溶液50ml、凝集素30ml、蔗糖溶液70ml、磷酸缓冲盐溶液、储罐1个、磁力搅拌器1个、无菌过滤器1个；
s2：初次分离，把生物体液置入差速离心管中，依次在400g下离心4min、4000g下离心4min和20000g下离心4min分别去除细胞、死细胞和细胞碎片；再利用超高速离心得到外泌体的粗提取物，即在200000g下离心4min，以去除污染蛋白质得到外泌体悬液；使用差速离心法对外泌体进行分离；
s3：初次纯化，将凝集素加入外泌体悬液中，并使用磁力搅拌器搅拌混合4min，加速较纯外泌体和杂质的分离沉淀，然后再把磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，稀释悬液杂质，得到较纯外泌体；有效增强了杂质分离效率，便于纯化外泌体；
s4：过滤纯化，将蔗糖溶液加入差速离心管中，在100000g下离心1小时，蛋白质聚集体会进一步沉降于管底部，含脂类结构的外泌体会沉降到等密度区，从而获得较高纯度的外泌体，再使用无菌过滤器进行反复过滤2次，过滤杂质物得到高纯外泌体，无菌过滤器的规格为0.55μm；进一步增强了纯化效果，过滤杂质；
s5：加强纯化，把羟基磷灰石加入纯化柱中，再将过滤纯化过的外泌体加入纯化柱中，使用磁粒搅拌器进行混匀，摇动孵育后，转移至亲和层析柱中，再使用磷酸二氢钠溶液洗涤2次，孵育的时间为50min，摇动的转速为100rpm，磷酸二氢钠溶液的浓度45mm；再一次增强了纯化效果，使得外泌体得率高；
s6：静置混合，使用磁力搅拌器搅拌3min混匀，并静置5min，即得到纯净的外泌体溶液；
s7：外泌体收集，把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存；便于外泌体的存放。
实施例3
一种分离和纯化外泌体的方法，具体按照如下操作步骤：
s1：材料准备，生物体液100ml、差速离心管1个、纯化柱1个、亲和层析柱1个、羟基磷灰石50g、磷酸二氢钠溶液80ml、凝集素40ml、蔗糖溶液110ml、磷酸缓冲盐溶液、储罐1个、磁力搅拌器1个、无菌过滤器1个；
s2：初次分离，把生物体液置入差速离心管中，依次在500g下离心5min、5000g下离心5min和30000g下离心5min分别去除细胞、死细胞和细胞碎片；再利用超高速离心得到外泌体的粗提取物，即在300000g下离心5min，以去除污染蛋白质得到外泌体悬液；使用差速离心法对外泌体进行分离；
s3：初次纯化，将凝集素加入外泌体悬液中，并使用磁力搅拌器搅拌混合5min，加速较纯外泌体和杂质的分离沉淀，然后再把磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，稀释悬液杂质，得到较纯外泌体；有效增强了杂质分离效率，便于纯化外泌体；
s4：过滤纯化，将蔗糖溶液加入差速离心管中，在100000g下离心1小时，蛋白质聚集体会进一步沉降于管底部，含脂类结构的外泌体会沉降到等密度区，从而获得较高纯度的外泌体，再使用无菌过滤器进行反复过滤2次，过滤杂质物得到高纯外泌体，无菌过滤器的规格为0.55μm；进一步增强了纯化效果，过滤杂质；
s5：加强纯化，把羟基磷灰石加入纯化柱中，再将过滤纯化过的外泌体加入纯化柱中，使用磁粒搅拌器进行混匀，摇动孵育后，转移至亲和层析柱中，再使用磷酸二氢钠溶液洗涤2次，孵育的时间为70min，摇动的转速为150rpm，磷酸二氢钠溶液的浓度60mm；再一次增强了纯化效果，使得外泌体得率高；
s6：静置混合，使用磁力搅拌器搅拌4min混匀，并静置5min，即得到纯净的外泌体溶液；
s7：外泌体收集，把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存；便于外泌体的存放。
本发明通过加入凝集素、磷酸缓冲盐溶液、蔗糖溶液与外泌体悬液液的配合反应，逐步加速了外泌体纯化程度，操作更为简单，纯化速度快，再通过无菌过滤器进行过滤，有效去除了外泌体中混合的杂质蛋白，保证了外泌体的纯度和得率，并且通过羟基磷灰石、磷酸二氢钠溶液，去除了外泌体中大量的污染蛋白质，进一步保证了纯化质量。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。