1.一种分离和纯化外泌体的方法,其特征在于:具体按照如下操作步骤:
s1:材料准备,生物体液30ml-100ml、差速离心管1个、纯化柱1个、亲和层析柱1个、羟基磷灰石5g-50g、磷酸二氢钠溶液20ml-80ml、凝集素10ml-40ml、蔗糖溶液40ml-110ml、磷酸缓冲盐溶液、储罐1个、磁力搅拌器1个、无菌过滤器1个;
s2:初次分离,把生物体液置入差速离心管中,依次在300g-500g下离心3min-5min、3000g-5000g下离心3min-5min和10000g-30000g下离心3min-5min分别去除细胞、死细胞和细胞碎片;再利用超高速离心得到外泌体的粗提取物,即在100000g-300000g下离心3min-5min,以去除污染蛋白质得到外泌体悬液;
s3:初次纯化,将凝集素加入外泌体悬液中,并使用磁力搅拌器搅拌混合3min-5min,加速较纯外泌体和杂质的分离沉淀,然后再把磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中,使用磁力搅拌器混匀,稀释沉淀物,并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次,稀释悬液杂质,得到较纯外泌体;
s4:过滤纯化,将蔗糖溶液加入差速离心管中,在100000g下离心1小时,蛋白质聚集体会进一步沉降于管底部,含脂类结构的外泌体会沉降到等密度区,从而获得较高纯度的外泌体,再使用无菌过滤器进行反复过滤2次,过滤杂质物得到高纯外泌体;
s5:加强纯化,把羟基磷灰石加入纯化柱中,再将过滤纯化过的外泌体加入纯化柱中,使用磁粒搅拌器进行混匀,摇动孵育后,转移至亲和层析柱中,再使用磷酸二氢钠溶液洗涤2次;
s6:静置混合,使用磁力搅拌器搅拌2min-4min混匀,并静置5min,即得到纯净的外泌体溶液;
s7:外泌体收集,把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置,温度条件为-80℃低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种分离和纯化外泌体的方法,其特征在于:步骤s4中无菌过滤器的规格为0.55μm。
3.根据权利要求1所述的一种分离和纯化外泌体的方法,其特征在于:步骤s5中孵育的时间为10min-70min,摇动的转速为80rpm~150rpm。
4.根据权利要求1所述的一种分离和纯化外泌体的方法,其特征在于:步骤s5中磷酸二氢钠溶液的浓度10mm-60mm。