本发明涉及一种通过连续发酵驯化丝状真菌的方法，具体涉及驯化可利用特定氮源的高山被孢霉的方法。
背景技术：
：菌株有其自己的特性，在发酵工程中需要通过长时间的尝试来找到菌株的最适发酵条件。随着工艺和需求的发展和成本的控制，需要对已有的发酵条件进行改变，例如改变碳源、氮源的添加量及碳氮比，改变无机盐的添加量等等。氮源对微生物生长及产物合成来说非常重要，氮源的改变很有可能使得微生物的生长代谢发生障碍，从而导致微生物生长缓慢或者产物产率偏低，所以就需要根据特有的条件对菌株进行特定氮源的驯化。生物合成过程中，培养基中氮的形式，对微生物的生长及代谢产物的大量合成有很大的影响。高山被孢霉是一株具有较强脂质合成能力的产油微生物，其脂质积累受培养基中碳、氮源调控，目前的工艺在生产ara时，多采用天然氮源，能够达到较好的发酵效果。但是天然氮源由于来源、加工方法不同，其质量不稳定，且微生物对有机氮源中的氨基酸的利用有选择性，常引起发酵波动。而采用无机或有机氮源的组合具有成本更低、工艺稳定性高等优势，是目前发酵行业研究的热点之一。目前驯化菌株采用的是从低程度的培养变化量开始，在平板行进行单独的初筛和精筛，再进行摇瓶选育。会花费大量的人力和时间进行驯化传代、验证的工作，而且即使在摇瓶中指标良好，放大以后又会出现不尽如人意的状况。技术实现要素：本发明的目的是提供一种快速高效驯化菌株利用特定原料发酵产生代谢产物的方法，能够减少传代繁琐的操作以及较长的驯化周期。为实现上述目的，本发明第一方面提供一种连续发酵驯化菌株的方法，包括以下步骤：(1)发酵至菌浓度稳定时，排出发酵液，同时补充碳源、氮源、维生素、无机盐，逐渐形成筛选发酵体系；(2)驯化过程中碳源(以葡萄糖计)维持在5-20g/l、氮源浓度(按总氮浓度计)为0.1-1g/l，ph为5.5-8.5，发酵液体积维持不变。其中所述补充的氮源包括磷酸氢二铵、氨水、硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、组氨酸中的一种或多种；所述维生素包括维生素b1、维生素b2、维生素b5、生物素、胆碱、肌醇、烟酸中的一种或多种；所述无机盐包括氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钠中的一种或多种。值得注意的是，出于成本及原料获得考虑，所述谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、组氨酸包括其相对应的盐，例如所添加的可以是谷氨酸也可以是谷氨酸钠，或其混合物。上述方法可以用于丝状真菌的菌株驯化，如高山被孢霉菌株驯化。本发明第二方面提供一种驯化高山被孢霉的方法包括以下步骤：(1)发酵至菌浓度稳定在40-60％时，排出发酵液，补料添加碳源、无机氮源、氨基酸、维生素、无机盐，逐渐形成筛选发酵体系；(2)驯化过程中以葡萄糖计，碳源维持在5-20g/l、以总氮量计，氮源浓度为0.1-1g/l，ph为5.5-8.5、且维持发酵液体积不变；(3)当发酵罐中发酵液菌浓度重新稳定在40-60％时，得到利用特定氮源的高山被孢霉菌株。其中，步骤(1)中所述筛选发酵体系中，所述无机氮源为磷酸氢二铵，优选地，所述氨基酸组分为0.01-0.3g/l谷氨酸或其盐、0.01-0.1g/l甘氨酸或其盐、0.01-0.1g/l缬氨酸或其盐、0.01-0.2g/l脯氨酸或其盐、0.01-0.2g/l色氨酸或其盐、0.01-0.2g/l组氨酸或其盐中的一种或多种；所述维生素为5-30ppm维生素b1、5-30ppm维生素b2、5-30ppm维生素b5、5-30ppm生物素、1500-3000ppm胆碱、1500-3000ppm肌醇、200-500ppm烟酸中的一种或多种，所述无机盐为0.1-1g/l氯化钙、0.1-1g/l硫酸镁、0.5-5g/l磷酸二氢钾、0.01-0.5g/l硫酸亚铁、0.01-0.5g/l硫酸锌、0.1-1g/l氯化钠中的一种或多种。具体地，一种利用无机氮源驯化高山被孢霉的方法包括：(1)孢子悬浮液的准备：将高山被孢霉菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基平板上，在25-28℃下培养6-9天至孢子生成并成熟，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成孢子悬液。(2)种子培养：孢子悬浮液接种到摇瓶中进行培养，接种量为10-20％(体积比)，培养温度25-30℃，培养时间36-48h，摇床振摇转速为120-300转/分钟；所述摇瓶中的种子培养基为含碳物质20-50g/l、含氮物质5-30g/l、ph5.5-8.5；更具体地，摇瓶培养基为葡萄糖30g/l、酵母粉15g/l、ph7.0。(3)发酵罐发酵：摇瓶培养的种子培养液接种到发酵罐中进行发酵培养，接种量为发酵培养基体积的1-10％(体积比)。发酵罐温度25-30℃，搅拌速度200-300转/分钟，通气量1-2vvm，即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1-2l，罐压0.05-0.15mpa，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在5-20g/l。初始发酵培养基的组分及条件为：葡萄糖30-60g/l、酵母粉15-30g/l、ph6.5。本发明中，发酵罐体积可选小试、中试、大试规模的发酵罐，例如，5l、50l、1m3能够更好的适应后续的规模化发酵。(4)培养过程取样，监测发酵罐中菌浓度(体积比)，在发酵液菌浓稳定且达到40％-60％，这个过程需要60-96h，匀速排出发酵液。发酵液排出的流速需根据菌体的生长速度进行选择，本发明在对高山被孢霉的研究中，充分考虑高山被孢霉的生长速度，发现流速保持在(v/1000-v/500)/h时，具有最好的驯化效果，菌种浓度可更快地达到稳定，其中v为发酵罐中发酵液的体积。在排出发酵液的同时，根据发酵罐中存留的发酵液体积，补料添加至包含碳源、特定无机氮源、特定氨基酸的筛选发酵体系。筛选发酵体系中的特定无机氮源可为：磷酸氢二铵、硝酸钾中的一种或多种；特定氨基酸包括：谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、组氨酸、及以上氨基酸所对应的盐中的一种或多种；筛选发酵体系中还包括维生素b1、维生素b2、维生素b5、生物素、胆碱、肌醇、烟酸中的一种或多种；氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钠中的一种或多种。另外根据需要补加水和酸或碱，确保培养液体积保持不变，ph维持在5.5-8.5。优选地，筛选发酵体系中无机氮源选为磷酸氢二铵、氨基酸包括0.01-0.3g/l谷氨酸或其盐、0.01-0.1g/l甘氨酸或其盐、0.01-0.1g/l缬氨酸或其盐、0.01-0.2g/l脯氨酸或其盐、0.01-0.2g/l色氨酸或其盐和0.01-0.2g/l组氨酸或其盐；维生素包括5-30ppm维生素b1、5-30ppm维生素b2、5-30ppm维生素b5、5-30ppm生物素、1500-3000ppm胆碱、1500-3000ppm肌醇和200-500ppm烟酸；无机盐包括0.1-1g/l氯化钙、0.1-1g/l硫酸镁、0.5-5g/l磷酸二氢钾、0.05-0.5g/l硫酸亚铁、0.05-0.5g/l硫酸锌和0.1-1g/l氯化钠。在补加各组分原料时需要按照设计的筛选发酵体系浓度提高10倍进行配置。其中无机盐与维生素成分补加至驯化所需浓度为止；氮源(总氮浓度)浓度持续维持在0.1-1g/l，碳源(以葡萄糖计)浓度维持在5-20g/l。需要指出的是，驯化过程为动态过程，此过程中各组分浓度会持续变化，但以上述范围为维持目的方案均应该受到保护。在驯化的过程中，菌浓会呈现先逐渐下降，并且在较低水平维持一段时间，然后逐渐上升并且达到甚至高于初始菌浓。这就是一个周期，此时发酵罐内的菌种即为筛选出来的无需有机氮源就能生产ara的高山被孢霉菌种。本发明第三方面提供一种培养基，所述培养基为高山被孢霉的无机氮源发酵培养基，包括30-60g/l碳源、10-40g/l无机氮源、0.15-1.5g/l氨基酸、1500-3200ppm维生素和0.8-9g/l无机盐。其中碳源可选为葡萄糖、糖蜜、甘油中的一种或几种；无机氮源可选为氨水、磷酸氢二铵、硝酸铵、硝酸钾、尿素中的一种或几种；氨基酸包括，谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和组氨酸；维生素包括维生素b1、维生素b2、维生素b5、生物素、胆碱、肌醇、烟酸中的一种或多种；无机盐包括氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钠中的一种或多种。值得注意的是，出于成本及原料获得考虑，所述谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、组氨酸包括其相对应的盐，例如所添加的可以是谷氨酸也可以是谷氨酸钠，或其混合物。作为一种优选地实施方式，发酵培养基包括30-60g/l葡萄糖；无机氮源为10-30g/l磷酸氢二铵；氨基酸包括0.05-0.4g/l谷氨酸或其盐、0.05-0.2g/l甘氨酸或其盐、0.05-0.2g/l缬氨酸或其盐、0.01-0.2g/l脯氨酸或其盐、0.01-0.2g/l色氨酸或其盐和0.01-0.2g/l组氨酸或其盐；维生素包括5-30ppm维生素b1、5-30ppm维生素b2、5-30ppm维生素b5、5-30ppm生物素、1500-3000ppm胆碱、1500-3000ppm肌醇和200-500ppm烟酸、无机盐为0.1-1g/l氯化钙、0.1-1g/l硫酸镁、0.5-5g/l磷酸二氢钾、0.01-0.5g/l硫酸亚铁、0.01-0.5g/l硫酸锌和0.1-1g/l氯化钠。根据本领域技术人员的理解，本发明提供的方法在菌种筛选中的应用、在驯化利用特定原料的高产ara菌株中的应用；以及本发明所提供的培养基在驯化无需有机氮源的高产ara菌株中的应用，也属于本发明所要求保护的范围。本发明的有益效果是：(1)采用本发明所述方法，减少传代繁琐的操作和较长的驯化周期，加快驯化成功的速率；(2)仅利用无机氮源作为氮源的高山被孢霉发酵产物成分更稳定可控，易于在工业生产中进行质量控制；(3)本发明在驯化时，使用的是接近中试发酵的发酵罐及发酵条件，驯化后得到的菌株能够快速适应工业上的放大生产。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若无特殊说明，本发明实施例中采用的试剂均为市售可得。本发明中生物量、菌体总油含量、花生四烯酸的含量与产量的检测方法如下：(1)生物量采用将发酵液取样后烘干称重进行测定；(2)发酵产物中菌体总油含量的测定方法为：称取湿菌体m0后，加入盐酸，消化样品；再加入石油醚混合，加入乙醚混合，静置分层；倒出上清液于称量好的平底烧瓶m1中，蒸干后，置于烘箱中干燥称重含菌体的平底烧瓶m2；总油含量(％)＝(m2-m1)/m0，式中：m0—试样的质量，g；m1—烘前平底烧瓶的质量，g；m2—烘后平底烧瓶的质量，g；(3)实施例和对比例所得发酵产物中花生四烯酸的含量的测定使用国标gb26400-2001。实施例1利用无机氮源对产ara高山被孢霉的驯化所用初始发酵培养基为：葡萄糖50g/l、酵母粉20g/l、ph6.5；本实施例所采用的高山被孢霉菌株为cctccno:m2015421筛选发酵体系中维生素与无机盐为：10ppm维生素b1、10ppm维生素b2、10ppm维生素b5、10ppm生物素、1500ppm胆碱、1500ppm肌醇、300ppm烟酸、1g/l氯化钙、0.1g/l硫酸镁、0.5g/l磷酸二氢钾、0.01g/l硫酸亚铁、0.01g/l硫酸锌和0.1g/l氯化钠；氮源为磷酸氢二铵；氨基酸为0.3g/l谷氨酸、0.1g/l甘氨酸、0.1g/l缬氨酸、0.1g/l脯氨酸、0.2g/l色氨酸和0.2g/l组氨酸；在补加各组分原料时需要按照设计的筛选发酵体系浓度提高10倍进行配置。(1)将摇瓶培养的种子培养液接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵罐体积为50l，培养基量为30l，接种量20％(体积比)。发酵罐温度28℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.2vvm即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1.2l，罐压0.05mpa，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/l。(2)发酵过程监测菌浓，80小时后，菌浓达到40％，已稳定。(3)以50ml/h的速度进行发酵液的排放，同时，持续补充筛选培养基中无机盐与维生素成分，直至发酵液中无机盐与维生素成分到达筛选发酵体系。持续补充磷酸二氢铵与氨基酸，并且控制氮源浓度维持在0.1-1g/l，持续补充葡萄糖，并控制碳源浓度维持在10g/l左右，根据系统监测补加水、酸或碱，且确保发酵液体积及ph保持不变，直至驯化结束。(4)驯化所需时间的确定。在补充筛选培养基的过程中，菌浓呈现先逐渐下降，并且在较低水平维持一段时间，然后逐渐上升并且达到甚至高于初始菌浓，见表1。此时发酵罐内的菌种即为筛选出来的无需有机氮源就能生产ara的菌种。表1驯化过程中菌浓度变化由表1可判断驯化624h后，菌浓已基本稳定，此时得到的菌株即为驯化后的菌株。(5)驯化后高山被孢霉产ara能力验证，将步骤(4)得到的菌株进行发酵培养，验证采用上述方法驯化得到的高山被孢霉是否达到利用无机氮源产ara的效果。发酵罐体积为50l，培养基量为30l，接种量1％(体积比)。发酵培养基为：葡萄糖50g/l、28g/l磷酸氢二铵、0.3g/l谷氨酸、0.2g/l甘氨酸、0.2g/l缬氨酸、0.2g/l脯氨酸、0.2g/l色氨酸、0.2g/l组氨酸、10ppm维生素b1、10ppm维生素b2、10ppm维生素b5、10ppm生物素、1500ppm胆碱、1500ppm肌醇、300ppm烟酸、1g/l氯化钙、0.1g/l硫酸镁、0.5g/l磷酸二氢钾、0.01g/l硫酸亚铁、0.01g/l硫酸锌和0.1g/l氯化钠。发酵罐温度28℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.2vvm(l/l.min)即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1.2l，罐压0.1mpa，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/l。得到的发酵液中生物量为45g/l、总油量为51％、ara产量为11.35g/l。(6)不同批次驯化后高山被孢霉产ara结果采用与步骤(5)相同方法对不同批次驯化后得到的高山被孢霉进行验证，结果见表2：表2：不同批次高山被孢霉驯化结果通过多次实验发现，每次驯化的菌株效果均提升一致，批次之间提升效果差异不显著。实施例1的结果显示，将无机氮源少量连续的加入到培养基中，与单独传代直接改变培养环境相比，优势在于能够给菌株一个逐渐适应的过程，并且在连续排放的过程中使得适应菌的浓度在不断提高，而不耐受环境压力的菌以及衰老期的菌在逐渐排出。霉菌的适应能力较差，培养基中某一个成分的微小的改变都会使发酵效果降低很多，高山被孢霉的发酵周期本身较长单独传代一般需要驯化5次以上，每次的传代验证的时间在240h以上，驯化时间较长。采用本发明的驯化方法，能够加快驯化成功的速率，并且得到的菌株能快速适应放大的生产。实施例2驯化后的高山被孢霉生产ara放大实验将实施例1得到的菌液进一步放大发酵50m3：依次选用容积为100l，1.7m3，12m3，的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％(体积比)，培养过程工艺控制为：温度30℃，搅拌速度300转/分钟，通气量1.5vvm(l/l.min)，培养时间48h，所用培养基为实施例1中的发酵培养基。发酵培养：待12m3种子罐中的菌浓达到30％(体积比)后，通过移种管道接入到装有30m3发酵培养基的50m3发酵罐中进行培养，接种量为发酵培养基体积的1％，发酵罐控制温度30℃，搅拌速度180转/分钟，通气量1.5vvm(l/l.min)，罐压0.10mpa，培养180h。发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在18g/l，检测50m3发酵罐中的生物量、总油、ara含量、高山被孢菌ara产量，见表3。表3驯化后高山被孢霉生产ara的放大实验结果实施例3本实施采用的高山被孢霉菌株为cctccno:m2013419，采用与实施例1的(1)-(4)完全相同的驯化方法。在624h时，菌浓达到稳定，平衡菌浓为40％。同样采用与实施例1的(5)相同的发酵方法进行效果验证。表4：不同批次高山被孢霉驯化结果批次驯化时间(h)菌浓生物量g/l总油％ara产量g/l162441％43.050.512.24262442％43.351.111.06362440％40.551.710.46实施例4本实施例采用的高山被孢霉菌株为cctccno:m2013419，采用实施例1的完全相同的驯化思路。不同之处在于：1.发酵液的排放速度为40ml/h；2.筛选培养环境为筛选发酵体系中维生素与无机盐为：30ppm维生素b1、30ppm维生素b2、30ppm维生素b5、30ppm生物素、3000ppm胆碱、3000ppm肌醇、500ppm烟酸、0.5g/l氯化钙、1g/l硫酸镁、2g/l磷酸二氢钾、0.5g/l硫酸亚铁、0.5g/l硫酸锌和1g/l氯化钠；氮源为磷酸氢二铵；氨基酸为0.1g/l谷氨酸、0.2g/l甘氨酸、0.2g/l缬氨酸、0.2g/l脯氨酸、0.2g/l色氨酸和0.1g/l组氨酸；3.驯化完成后的发酵培养基为：葡萄糖40g/l、28g/l磷酸氢二铵、0.1g/l谷氨酸、0.2g/l甘氨酸、0.2g/l缬氨酸、0.2g/l脯氨酸、0.2g/l色氨酸、0.1g/l组氨酸、维生素：30ppm维生素b1、30ppm维生素b2、30ppm维生素b5、30ppm生物素、3000ppm胆碱、3000ppm肌醇、500ppm烟酸、0.5g/l氯化钙、1g/l硫酸镁、2g/l磷酸二氢钾、0.5g/l硫酸亚铁、0.5g/l硫酸锌和0.1g/l氯化钠。本实施例得到的驯化和发酵结果见表5。表5高山被孢霉驯化结果批次驯化时间(h)菌浓生物量g/l总油％ara产量g/l179840％41.550.510.48277440％39.650.19.92377439％40.249.710.19实施例5采用不同无机氮源的驯化结果采用与实施例1相同的菌株及驯化方法，在驯化时将筛选发酵体系中的无机氮源由磷酸二氢钾调整为硝酸钾，结果显示，在624h的时候，菌浓达到稳定，平衡菌浓为41％。调整发酵培养基为：葡萄糖50g/l、34g/l硝酸钾、0.3g/l谷氨酸、0.2g/l甘氨酸、0.2g/l缬氨酸、0.2g/l脯氨酸、0.2g/l色氨酸、0.2g/l组氨酸、10ppm维生素b1、10ppm维生素b2、10ppm维生素b5、10ppm生物素、1500ppm胆碱、1500ppm肌醇、300ppm烟酸、1g/l氯化钙、0.1g/l硫酸镁、0.5g/l磷酸二氢钾、0.01g/l硫酸亚铁、0.01g/l硫酸锌和0.1g/l氯化钠。采用硝酸钾为无机氮源，在50l发酵罐上进行发酵，培养基量为30l，接种量1％(体积比)。发酵罐温度28℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.2vvm即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1.2l，罐压0.1mpa，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/l，得到的发酵结果为：发酵液中生物量为43g/l、总油量为49％、ara产量为9.50g/l。结果显示，使用硝酸钾作用无机氮源也可进行驯化得到高山被孢霉，但其ara产量低于以磷酸氢二铵为无机氮源进行驯化的高山被孢霉ara的产量。实施例6采用不同氮源的驯化采用与实施例1相同的菌株及驯化方法，仅在驯化过程中补料时省去氨基酸成分。结果显示，在624h的时候，菌浓达到稳定，但是平衡菌浓为32％，低于实施例1中驯化624h时，菌浓度稳定在41％。对比例1未驯化的高山被孢霉生产ara使用实施例1的高山被孢霉菌菌株，不进行驯化，进行发酵培养，培养基为葡萄糖50g/l、酵母粉20g/l、ph为6.5，发酵罐体积为50l，培养基量为30l，接种量1％(体积比)。发酵罐温度28℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.2vvm，即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1.2l，罐压0.1mpa。并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/l，得到的发酵液中生物量为45.7g/l、总油量为49.5％、ara产量为10.05g/l。结果表明，与对比例1相比，实施例1驯化后高山被孢霉的ara产量提高了11.2-21.8％。对比例2未驯化的高山被孢霉对无机氮源的利用使用实施例1的高山被孢霉菌株，不进行驯化，进行发酵培养，培养基为葡萄糖50g/l，28g/l磷酸氢二铵、0.3g/l谷氨酸、0.2g/l甘氨酸、0.2g/l缬氨酸、0.2g/l脯氨酸、0.2g/l色氨酸、0.2g/l组氨酸、10ppm维生素b1、10ppm维生素b2、10ppm维生素b5、10ppm生物素、1500ppm胆碱、1500ppm肌醇、300ppm烟酸、1g/l氯化钙、0.1g/l硫酸镁、0.5g/l磷酸二氢钾、0.01g/l硫酸亚铁、0.01g/l硫酸锌和0.1g/l氯化钠。发酵罐温度28℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.2vvm(l/l.min)即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1.2l，罐压0.1mpa。并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/l，得到的发酵液中生物量为35.7g/l，总油量为45.2％，ara产量为7.26g/l。对比例3驯化过程中培养基的排放速度流速的选择需要保证发酵液中的菌体不被排空。若流速快于霉菌适应期，发酵液会被排空，也就是生物量接近0；而流速太慢会增加驯化的周期。在实施例1驯化过程的步骤(3)中，调整培养基的排放速度为100ml/h其他发酵条件不变，检测发酵罐中菌浓度，结果显示：由于高山被孢霉的适应能力较弱，在240h左右检测菌浓在9％左右，480h检测菌浓在12％，即使生物量能够恢复到平衡，所花费的时间较长，所以此排放速率无法实现本发明的效果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12