一种全细胞催化生产PAPS的方法

本发明涉及一种全细胞催化生产paps的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(paps)是gag硫酸转移酶催化肝素、硫酸软骨素等合成过程中直接的硫酸基供体。paps的生产方法包括发酵法和生物催化法。发酵法以细胞自身代谢途径为基础，通过引入外源基因实现从atp到paps的合成。然而，在正常条件下，细胞内的atp浓度较低，且其中绝大部分的atp用于细胞自身的能量代谢，导致最终产量极低。而且发酵过程会产生不同种类的副产物，不利于后期产品的分离纯化。

目前，研究人员一般采用体外酶法制备paps。体外酶法催化制备paps主要包括两种方法：酰基磺酸转移酶催化3,5-二磷酸腺苷(pap)合成paps、atp硫酸化酶和aps激酶催化atp制备paps。然而，3,5-二磷酸腺苷价格昂贵，酰基磺酸转移酶催化合成paps仅在实验室进行小规模试验，不适合工业化生产。atp硫酸化酶和aps激酶催化存在酶纯化过程复杂，产物抑制等问题，导致paps规模化生产受限。目前商品化试剂paps采用酶法合成，价格非常昂贵(20559.40元/25mg，纯度仅60％)，远高于硫酸软骨素和肝素。因此，而还缺乏高效、简便、价格低廉的制备paps的方法。

技术实现要素：

目前制备paps的方法还是局限于利用纯化后的酶进行转化，过程复杂、转化成本高，不利于paps的工业化制备。

为实现paps的高效合成，本发明在atp硫酸化酶和aps激酶的基础上，引入辅酶ppa和ppk，实现了四种酶在微生物细胞内的同时合成。这不仅消除了反应副产物抑制，而且提高了底物利用效率。其次，通过提高细胞膜的通透性，实现全细胞转化生产paps。这种生产方式，对设备要求低，只需一步反应，简便快捷，效率高。转化的过程中不用额外添加其他化学物质或者生物辅因子，降低了成本，减轻了对环境的污染。反应具有高选择性，产品纯度高，方便后期的分离与纯化，有利于大规模的工业化生产。

本发明提供了一种重组菌，所述重组菌将腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶(atps)、5’-磷酸腺苷硫酸激酶(apsk)、无机焦磷酸水解酶(ppa)、多聚磷酸激酶(ppk)同时在宿主菌中表达。

在一种实施方式中，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶来源于酿酒酵母；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶来源于产黄青霉菌；所述无机焦磷酸水解酶来源于大肠杆菌；所述多聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒状杆菌。

在一种实施方式中，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶的编码基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶的编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述无机焦磷酸水解酶的编码基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述多聚磷酸激酶的编码基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。

在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主。

在一种实施方式中，利用petduet-1载体表达atps和apsk、利用prsfduet-1载体表达ppa和ppk

在一种实施方式中，利用pcdfduet-1载体表达atps和apsk、利用petduet-1载体表达ppa和ppk。

在一种实施方式中，利用prsfduet-1载体表达atps和apsk、利用pacycduet-1载体表达ppa和ppk。

在一种实施方式中，pacycduet-1载体表达atps和apsk、利用petduet-1载体表达ppa和ppk。

在一种实施方式中，利用pcdfduet-1载体表达atps和apsk、利用prsfduet-1载体表达ppa和ppk。

在一种实施方式中，利用petduet-1载体表达atps和apsk，利用pacycduet-1载体表达ppa和ppk。

本发明提供了一种生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的方法，以atp为底物，利用所述重组菌全细胞转化生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸。

在一种实施方式中，底物atp优选为atp二钠盐。

在一种实施方式中，将重组菌培养至od600为0.6-0.8，利用iptg诱导10-15h后，收集菌体，在利用曲拉通对菌体处理20-40min。

在一种实施方式中，将曲拉通处理过后的菌体加入转化体系中，使其在转化体系中的浓度为15-30g/l。

在一种实施方式中，转化体系中底物浓度为40-80mm，或初始底物浓度为10-20mm。

在一种实施方式中，当底物浓度为10-20mm时，在反应过程中需进行补料50-60mm。

在一种实施方式中，底物浓度为10mm时，在反应第1～3h，每1h一次性补料浓度为10mm，后每2～3h一次性补料浓度为10mm，反应共消耗底物70mm。

在一种实施方式中，转化温度为30-45℃。

在一种实施方式中，转化体系中还含有10-20mm(napo3)6，100-150mmlicl，50-100mmmgso4。

在一种实施方式中，转化体系初始ph为7.5。

在一种实施方式中，反应时间为13-16h。

本发明还提供了所述重组菌，或所述方法在制备3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸中的应用。

有益效果：本发明引入催化模块和辅酶模块，实现了四种酶在大肠杆菌中的同时表达，并且以此重组菌株实现了全细胞转化atp生产paps。利用重组菌进行全细胞催化生产paps，并通过优化催化条件，催化反应15h后转化率达到96.12％；在反应过程中优化补料条件，催化16h后转化率可达97.8％。与现有的技术相比，本发明产量高，且采用的方法反应条件温和，过程简单，便于后期的提取分离，适合工业化生产。

附图说明

图1为全细胞催化合成paps的合成路径示意图；

图2为12种重组菌株转化生产paps结果；

图3为菌体量对转化效率响图；

图4为底物浓度对转化效率响图；

图5为转化温度对转化效率响图；

图6为补料转化生产paps图。

具体实施方式

种子培养基(g/l)：蛋白胨10g，酵母粉3g，nacl10g，蒸馏水定容。

发酵培养基：葡萄糖4g/l，胰蛋白胨24g/l，酵母膏12g/l，磷酸二氢钾2.3g/l，磷酸氢二钾16.4g/l。

实施例1：密码子优化与载体的构建

本发明所用的atp硫化酶atps来源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的、5’-磷酸腺苷硫酸激酶apsk源于产黄青霉菌(penicilliumchrysogenum)的、无机焦磷酸水解酶酶ppa源于大肠杆菌(escherichiacoli)、多聚磷酸激酶基因ppk源于谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)，分别进行密码子优化和人工合成，序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4所示。

构建催化模块表达载体：将atps和apsk的编码基因，分别连接至载体pacycduet-1、petduet-1、prsfduet-1、pcdfduet-1上，使得atps和apsk由t7启动子分别启动，构建四种双酶表达载体pacycduet-atps-apsk、petduet-atps-apsk、prsfduet-atps-apsk、pcdfduet-atps-apsk。

构建辅酶模块表达载体：将ppa和ppk的编码基因，分别连接至载体pacycduet-1、petduet-1、prsfduet-1、pcdfduet-1上，使得ppa和ppk由t7启动子分别启动，构建四种双酶表达菌株pacycduet-ppa-ppk、petduet-ppa-ppk、prsfduet-ppa-ppk、pcdfduet-ppa-ppk。

实施例2：重组大肠杆菌的构建

将实施例1中的4种主要催化模块和4种辅酶模块进行组合，组合结果如表1所示。将12种组合的双质粒组合转化到e.colibl21(de3)，挑取在lb抗性平板上生长的单菌落，进行菌落pcr验证，验证正确后送去测序，获得序列正确的转化表达宿主共12株，标号为1～12，具体菌株如表1所示。

表1双载体表达菌株的组合优化

实施例3：重组大肠杆菌诱导表达酶与菌体处理

将实施例2中的12种重组大肠杆菌从平板上挑取单菌落，接种到种子培养基中，过夜培养，以5％(v/v)的接种量转接到50ml发酵培养基，37℃、200rpm/min培养至od600为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.6mm的iptg进行诱导，30℃下诱导12h后收集菌体，利用0.3mm曲拉通对活性细胞处理30min用于全细胞转化。

全细胞转化：以ph＝7.5的tris-hcl溶液作为全细胞转化的介质，加入10mm(napo3)6，100mmlicl，50mmmgso4，底物atp二钠盐浓度为40mm，加入菌体15g/l，30℃转化10h，转化结束后测定转化效率。

如图2所示，菌株编号为5e-r(petduet-atps-apsk&prsfduet-ppa-ppk)的转化效率可达75.3％。

实施例4：全细胞转化生产paps条件的优化

以ph＝7.5的tris-hcl溶液作为全细胞转化的介质，优化转化条件：

底物atp二钠盐浓度为40mm时，加入不同浓度的菌体(10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l)，30℃转化10h，研究细胞浓度对转化的影响，最优细胞浓度为20g/l，paps产量达到16.78，转化率为83.93％，结果如图3所示。

当细胞浓度为20g/l时，分别在不同浓度atp二钠盐(20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm)条件下，30℃转化10h，考察底物浓度对产量的影响，最优的atp二钠盐浓度为60mm，产量最大达到27.08m，转化率为90.27％，结果如图4所示。在最优菌体浓度和最优的底物浓度条件下，考察不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)对转化的影响，最优转化温度为35℃，发现此时最佳的转化时间为15h，产量最大可以达到28.83mm，转化率为96.12％，结果如图5所示随后产量不在增加，因此从经济的角度出发，设定最佳转化时间为15h。

实施例5：分批流加补料生产paps

为进一步提高产量，通过流加补料的方式优化催化过程。根据实施例3得到的优化后的转化条件进行全细胞催化，总反应体系1l。在反应过程中，发现保持投料总量不变的情况下，初始底物浓度与催化所用总时间成正比：底物10mm时，进行补料，需11.5h可将60mm的底物催化完成；底物20mm时，进行补料，需11.8h可将60mm的底物催化完成；底物30mm时，进行补料，需12.3h可将60mm的底物催化完成；底物40mm时，进行补料，需13.6h可将60mm的底物催化完成；底物50mm时，进行补料，需14.2h可将60mm的底物催化完成；底物60mm时需15h将底物催化完成。

因此，为加快反应进行，控制初始底物浓度为10mm。在此基础上进行补料催化：第1～3h底物消耗速率较快，每1h一次性补料10mmol。随着催化的进行底物消耗速率降低，每2～3h一次性补料10mmol。整个反应周期共16h，反应总过程共消耗atp70mmol，转化率为97.8％，paps产量为34.23mm，结果如图6所示。

对比例1

具体实施方式参见实施例2，在e.colibl21(de3)中仅导入petduet-atps-apsk质粒，仅表达atps和apsk两个酶，得到阳性转化子，按照实施例3中的全细胞转化法，转化生产paps，转化效率仅为62.78％。

在e.colibl21(de3)中仅导入pacycduet-atps-apsk质粒，得到阳性转化子，按照实施例3中的全细胞转化法，转化生产paps，转化率为47.23％。

在e.colibl21(de3)中仅导入prsfduet-atps-apsk质粒，得到阳性转化子，按照实施例3中的全细胞转化法，转化生产paps，转化率为52.61％。

在e.colibl21(de3)中仅导入petduet-atps-apsk质粒，得到阳性转化子，按照实施例3中的全细胞转化法，转化生产paps，转化率为61.03％。

对比例2

将所述的atp硫化酶atps、5’-磷酸腺苷硫酸激酶apsk、无机焦磷酸水解酶ppa、多聚磷酸激酶基因ppk，分别连接至pacycduet、petduet、prsfduet、pcdfduet，得到同时表达四种酶的重组质粒，将重组质粒转化至e.colibl21(de3)中，得到含有不同重组质粒的重组菌。按照实施例3中的方式，全细胞转化生产paps，结果由于导入质粒过多，菌体负载过重影响酶的表达，转化效率仅为9.7％～21.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种全细胞催化生产paps的方法

<130>baa201594a

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1536

<212>dna

<213>saccharomycescerevisiae

<400>1

atgccggcgccgcacggtggtatcctgcaggacctgatcgcgcgtgacgcgctgaaaaaa60

aacgaactgctgtctgaagcgcagtcttctgacatcctggtttggaacctgaccccgcgt120

cagctgtgcgacatcgaactgatcctgaacggtggtttctctccgctgaccggtttcctg180

aacgaaaacgactactcttctgttgttaccgactctcgtctggcggacggtaccctgtgg240

accatcccgatcaccctggacgttgacgaagcgttcgcgaaccagatcaaaccggacacc300

cgtatcgcgctgttccaggacgacgaaatcccgatcgcgatcctgaccgttcaggacgtt360

tacaaaccgaacaaaaccatcgaagcggaaaaagttttccgtggtgacccggaacacccg420

gcgatctcttacctgttcaacgttgcgggtgactactacgttggtggttctctggaagcg480

atccagctgccgcagcactacgactacccgggtctgcgtaaaaccccggcgcagctgcgt540

ctggaattccagtctcgtcagtgggaccgtgttgttgcgttccagacccgtaacccgatg600

caccgtgcgcaccgtgaactgaccgttcgtgcggcgcgtgaagcgaacgcgaaagttctg660

atccacccggttgttggtctgaccaaaccgggtgacatcgaccaccacacccgtgttcgt720

gtttaccaggaaatcatcaaacgttacccgaacggtatcgcgttcctgtctctgctgccg780

ctggcgatgcgtatgtctggtgaccgtgaagcggtttggcacgcgatcatccgtaaaaac840

tacggtgcgtctcacttcatcgttggtcgtgaccacgcgggtccgggtaaaaactctaaa900

ggtgttgacttctacggtccgtacgacgcgcaggaactggttgaatcttacaaacacgaa960

ctggacatcgaagttgttccgttccgtatggttacctacctgccggacgaagaccgttac1020

gcgccgatcgaccagatcgacaccaccaaaacccgtaccctgaacatctctggtaccgaa1080

ctgcgtcgtcgtctgcgtgttggtggtgaaatcccggaatggttctcttacccggaagtt1140

gttaaaatcctgcgtgaatctaacccgccgcgtccgaaacagggtttctctatcgttctg1200

ggtaactctctgaccgtttctcgtgaacagctgtctatcgcgctgctgtctaccttcctg1260

cagttcggtggtggtcgttactacaaaatcttcgaacacaacaacaaaaccgaactgctg1320

tctctgatccaggacttcatcggttctggttctggtctgatcatcccgaaccagtgggaa1380

gacgacaaagactctgttgttggtaaacagaacgtttacctgctggacacctcttcttct1440

gcggacatccagctggaatctgcggacgaaccgatctctcacatcgttcagaaagttgtt1500

ctgttcctggaagacaacggtttcttcgttttctaa1536

<210>2

<211>636

<212>dna

<213>penicilliumchrysogenum

<400>2

atgtctaccaacatcaccttccacgcgtctgcgctgacccgttctgaacgtaccgaactg60

cgtaaccagcgtggtctgaccatctggctgaccggtctgtctgcgtctggtaaatctacc120

ctggcggttgaactggaacaccagctggttcgtgaccgtggtgttcacgcgtaccgtctg180

gacggtgacaacatccgtttcggtctgaacaaagacctgggtttctctgaagcggaccgt240

aacgaaaacatccgtcgtatcgcggaagttgcgaaactgttcgcggactctaactctatc300

gcgatcacctctttcatctctccgtaccgtaaagaccgtgacaccgcgcgtcagctgcac360

gaagttgcgaccccgggtgaagaaaccggtctgccgttcgttgaagtttacgttgacgtt420

ccggttgaagttgcggaacagcgtgacccgaaaggtctgtacaaaaaagcgcgtgaaggt480

gttatcaaagaattcaccggtatctctgcgccgtacgaagcgccggcgaacccggaagtt540

cacgttaaaaactacgaactgccggttcaggacgcggttaaacagatcatcgactacctg600

gactctaaaggttacctgccggcgaaaaaagaataa636

<210>3

<211>531

<212>dna

<213>escherichiacoli

<400>3

atgagcttactcaacgtccctgcgggtaaagatctgccggaagacatctacgttgttatt60

gagatcccggctaacgcagatccgatcaaatacgaaatcgacaaagagagcggcgcactg120

ttcgttgaccgcttcatgtccaccgcgatgttctatccatgcaactacggttacatcaac180

cacaccctgtctctggacggtgacccggttgacgtactggtcccaactccgtacccgctg240

cagccgggttctgtgatccgttgccgtccggttggcgttctgaaaatgaccgacgaagcc300

ggtgaagatgcgaaactggttgcggttccgcacagcaagctgagcaaagaatacgatcac360

attaaagacgttaacgatctgcctgaactgctgaaagcgcaaatcgctcacttcttcgag420

cactacaaagacctcgaaaaaggcaagtgggtgaaagttgaaggttgggaaaacgcagaa480

gccgctaaagctgaaatcgttgcctccttcgagcgcgcaaagaataaataa531

<210>4

<211>921

<212>dna

<213>corynebacteriumglutamicum

<400>4

atggttggtaaactgccgatcatggcggaaaccaacgaaaacgacctgccggttatcgac60

ctggcgcagatcgaaggttacgttgttgacgactctgacgaagacgacccggttctgctg120

cgtccggacggtaccccgatcgaaacctggcgtgaagacttcccgtacgaagaacgtgtt180

acccgtgaagactacgaaaaagttaaacgttctctgcagatcgaactgctgaaatggcag240

aactggaccaaagaaaccggtcagcgtcacatcatcctgttcgaaggtcgtgacgcggcg300

ggtaaaggtggtaccatcaaacgtttcaacgaacacctgaacccgcgtggtgcgcgtacc360

gttgcgctggaaaaaccgtctccgcgtgaatctacctcttggtacttccagcgttacatc420

cagcacttcccggcggcgggtgaaatcgttttcttcgaccgttcttggtacaaccgttct480

ggtgttgaacgtgttatgggtttctgcaccgaatctcagcacgcggaattcctgcgtgaa540

gttccgatgctggaaaacatgatcctgggttctggtatctctctgaccaaattctggttc600

tctgttacccgtaaagaacagcgtacccgtttcgcgatccgtcaggttgacccggttcgt660

cagtggaaactgtctccgatggacctggcgtctctggaccgttgggacgactacacccgt720

gcgaaagaagaacagttccgttacaccgacaccgacgaatctccgtggatcaccatcaaa780

tctaacgacaaaaaacgtgcgcgtatcaacgcgatgcgttacgttctgtctaaattcgac840

tacaccgacaaagactacgaactggttggtgaaccggacccgaaagttgttctgcgtggt900

cgtgaccagatcggtgactaa921