一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法。

背景技术：

随着畜禽养殖业集约化、产业化的发展，畜禽养殖过程中产生了大量废弃物。我国每年产生的养殖废弃物可达38亿吨，综合利用率不到60%，不仅严重污染环境，而且在一定程度上危害到人畜健康。在畜禽废弃物资源化利用中，堆肥是最有效的处理方法，却面临着异味气体带来的一系列污染和健康安全问题。畜禽养殖业所产生的异味气体成分较为复杂，一般分为：氨和挥发性胺类、挥发性低级脂肪酸类、挥发性含硫化合物、酚类和吲哚类。这些异味气体被人体吸入后会刺激黏膜，引起咳嗽等健康问题，而高浓度的异味气体会导致呼吸困难，甚至引起癌症和中枢神经系统的损害。

堆肥除臭的方法很多，其中微生物除臭法是目前治理臭气的一种简单有效的方法。微生物除臭法是指在堆肥中添加外源除臭菌剂，利用微生物在代谢过程中可利用某些臭气成分，或可抑制臭气成分的产生等特点，从而达到除臭的目的。目前，对于除臭菌的筛选已有大量研究，但是一种除臭菌株一般只对一种异味气体具有较高的去除效率，难以同时去除多种成分的异味气体。因此，进一步筛选能够去除多种成分异味气体的菌株具有重要的实际意义。

技术实现要素：

本发明为了解决上述技术问题，而提供一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法，有效去除氨气和硫化氢。

本发明通过下述技术方案实现：一种有效去氨气和硫化氢的菌株，该菌株已于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号是：cgmccno.21519，其生物学分类命名为：波氏杆菌bordetellasp.。

有效去氨气和硫化氢的菌株的筛选方法，包括下列步骤：

s1：将10g新鲜鸡粪加入到装有100mllb培养基的三角瓶中，然后将三角瓶放置到温度为30℃，转速为150rpm的震荡培养箱中富集培养72h，得到富集液；

s2：将富集液与nh3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，然后在温度为30℃，转速为150rpm的摇床中培养，得到驯化培养液，2d后将驯化培养液与nh3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，得到二代驯化培养液，重复以上操作4次，得到富集驯化液；

s3：将富集驯化液与无菌水按照重量份数比1:9加入三角瓶中混合，振荡20min，静置1min，用10倍稀释法，取10^-5梯度的稀释液涂布于lb培养基，置于30℃恒温培养箱内培养，2d后采用平板划线法对菌落进一步纯化，将特征不同的菌落分别接种于相应的斜面培养基上培养，得到纯化细菌；

s4：将纯化细菌接种于lb液体培养基上，在温度为30℃，转速为150rpm的摇床上扩大培养2d制成纯化细菌菌液；

s5：量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入10%纯化细菌菌液，测定纯化细菌菌液的除氨效果；量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1mlh2s标准液（1mg/ml），搅拌混匀后接入10%菌液，测定纯化细菌菌液的除硫化氢效果；通过测定结果筛选出有效去氨气和硫化氢的菌株。

进一步，所述nh3选择性培养基的制备方法，包括下列步骤：

a1：按重量份数计，将50份蔗糖、2份kh2po4、0.5份mgso4·7h2o、0.1份feso4、5份1%znso4、2份nacl、1000份蒸馏水混合，得到混合液；

a2：将混合液灭菌后加入10ml氨水，最终得到nh3选择性培养基。

进一步，lb培养基的制备方法为：按重量份数计，将10份胰蛋白胨、5份酵母提取物、10份nacl、1000份蒸馏水混合得到lb培养基。

进一步，基础发酵培养基的制备方法为：按重量份数计，将20份葡萄糖、0.5份酵母膏、2份kh2po4、2份k2hpo4、0.2份mgso4·7h2o、0.5份nacl、0.5份尿素、1000份蒸馏水混合得到基础发酵培养基。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明有效去氨气和硫化氢的菌株不仅可以有效去除氨气，而且对硫化氢也有较好的去除效果，可以用于堆肥中氨气和硫化氢的去除。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为菌株对氨气的去除效果图；

图2为菌株对硫化氢的去除效果图；

图3为菌株系统发育树；

图4为bh11菌落形态图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步描述。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例

在一个实施例中，一种有效去氨气和硫化氢的菌株，其保藏编号是：cgmccno.21519。

在一个实施例中，所述菌株的筛选方法，包括下列步骤：

s1：将10g新鲜鸡粪加入到装有100mllb培养基的三角瓶中，然后将三角瓶放置到温度为30℃，转速为150rpm的震荡培养箱中富集培养72h，得到富集液；

s2：将富集液与nh3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，然后在温度为30℃，转速为150rpm的摇床中培养，得到驯化培养液，2d后将驯化培养液与nh3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，得到二代驯化培养液，重复以上操作4次，得到富集驯化液；

s3：将富集驯化液与无菌水按照重量份数比1:9加入三角瓶中混合，振荡20min，静置1min，用10倍稀释法，取10^-5梯度的稀释液涂布于lb培养基，置于30℃恒温培养箱内培养，2d后采用平板划线法对菌落进一步纯化，将特征不同的菌落分别接种于相应的斜面培养基上培养，得到纯化细菌；

s4：将纯化细菌接种于lb液体培养基上，在温度为30℃，转速为150rpm的摇床上扩大培养2d制成纯化细菌菌液；

s5：量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入10%纯化细菌菌液，测定纯化细菌菌液的除氨效果；量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1mlh2s标准液（1mg/ml），搅拌混匀后接入10%菌液，测定纯化细菌菌液的除硫化氢效果；通过测定结果筛选出有效去氨气和硫化氢的菌株。

在一个实施例中，所述nh3选择性培养基的制备方法，包括下列步骤：

a1：按重量份数计，将50份蔗糖、2份kh2po4、0.5份mgso4·7h2o、0.1份feso4、5份1%znso4、2份nacl、1000份蒸馏水混合，得到混合液；

a2：将混合液灭菌后加入10ml氨水，最终得到nh3选择性培养基。

在一个实施例中，lb培养基的制备方法为：按重量份数计，将10份胰蛋白胨、5份酵母提取物、10份nacl、1000份蒸馏水混合得到lb培养基。

在一个实施例中，基础发酵培养基的制备方法为：按重量份数计，将20份葡萄糖、0.5份酵母膏、2份kh2po4、2份k2hpo4、0.2份mgso4·7h2o、0.5份nacl、0.5份尿素、1000份蒸馏水混合得到基础发酵培养基。

实验例

1、菌株的选取

1）除氨菌的筛选

将实施例中所述纯化细菌一共15株，编号bh1-bh15，然后分别接种于lb液体培养基上，在温度为30℃，转速为150rpm的摇床上扩大培养2d制成纯化细菌菌液；量取100ml基础发酵培养基置于15个广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入15种10%纯化细菌菌液；在广口瓶内放置含5ml2%硼酸的小烧杯，用保鲜膜封住瓶口后于培养箱内30℃静置培养，2d后取出小烧杯用硫酸滴定法测定nh3含量测定完更换含5ml2%硼酸的小烧杯，广口瓶中加1ml氨水继续培养，每2d测定一次，共测定4次。

如图1所示，除氨菌复筛结果显示菌株bh2、bh5、bh9、bh11、bh12和bh15对nh3去除率相对较高，分别为48.82%、49.44%、45.75%、48.33%、50.96%和51.82%，均高于45%。

2）硫化氢去除效果实验

将上述编号bh1-bh15的15株菌株，分别接种于lb液体培养基上，在温度为30℃，转速为150rpm的摇床上扩大培养2d制成纯化细菌菌液；量取100ml基础发酵培养基置于15个广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入15种10%纯化细菌菌液；在广口瓶内放置含5ml碱性锌氨络盐的小烧杯，用保鲜膜封住瓶口后于培养箱内30℃静置培养，2d后取出取出小烧杯用亚甲基蓝分光光度法测定h2s含量。

如图2所示，将初筛获得的15株除氨菌进行硫化氢去除效果的验证，结果发现菌株bh11、bh13和bh14有去除硫化氢的能力，去除率分别为36.69%、33.68%和32.04%，而其它菌株对硫化氢无去除效果。

综上所述，菌株bh11不仅可以有效去除氨气，而且对硫化氢也有较好的去除效果，可以用于堆肥中氨气和硫化氢的去除。

2、菌株的鉴定

2.1dna的提取

2.11试剂盒组成

使用tianamp细菌基因组提取试剂盒进行细菌dna的提取，试剂盒具体组成为：缓冲液ga(bufferga)、缓冲液gb(buffergb)、缓冲液gd(buffergd)、漂洗液pw(bufferpw)、洗脱缓冲液te(bufferte)、proteinasek、吸附柱cb3(spincolumnscb3)、收集管（2ml）(collectiontubes2ml)。

2.22细菌基因组dna的提取

1）取细菌培养液1-5ml，10000rpm离心1min，尽量吸净上清，向菌体沉淀中加入200μl缓冲液ga，振荡至菌体彻底悬浮。

2）向管中加入20μlproteinasek溶液，混匀。

3）加入220μl缓冲液gb，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4）加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

6）向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

7）向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

8）重复操作步骤7）。

9）将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。

10）将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

2.2pcr扩增

运用通用引物：27f(5’-agagtttgatcctggctca-3’)，1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增。

pcr反应体系：

2.3测序及比对结果

pcr上海派森诺生物科技股份有限公司测序获得的bh11序列如序列表所示，在ncbi数据库中进行blast比对后发现，bh11与bordetellasp.基因序列同源性达到99.93%，可以确定其为波氏菌属。其系统发育树如图3所示。

3、菌株的培养与形态特征

lb培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，氯化钠(nacl)10g，蒸馏水1l，ph7.4。

摇床培养条件：转速为150rpm，温度为35℃。

形态特征：bh11菌落接种于lb培养基上，然后放置在温度为30℃，转速为150rpm的摇床，35℃条件下培养2天，如图4所示，菌落直径为2mm，菌落表面光滑湿润，乳白色半透明，菌体呈球状，表现光滑、凸起，呈珍珠光泽而透明，边缘整齐但边界模糊，革兰氏染色阴性。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120>一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法

<130>yb216212

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>1409

<212>dna

<213>波氏杆菌(bordetellasp.)

<400>2

tgcagtcgaacggcagcacgagagagcttgctctcttggtggcgagtggcggacgggtga60

gtaatatatcggaacgtgcccagtagcgggggataactactcgaaagagtggctaatacc120

gcatacgccctacgggggaaaggaggggatcttcggacctttcactattggagcggccga180

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