一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用与流程

本发明涉及一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：丁酸梭状芽孢杆菌(clostridiumbutyricum)，又名酪酸梭菌，是芽孢杆菌科、梭菌属的一种革兰氏阳性厌氧细菌。广泛存在于奶酪、天然酸奶、人与动物粪便及土壤中。丁酸梭状芽孢杆菌发酵过程中产气,发酵产物包括乙酸、丁酸、丁醇、淀粉酶、脂肪酶、维生素等。丁酸梭状芽孢杆菌作为微生态制剂的研究是1933年日本千叶医学院博士首先发现并报告。此后,丁酸梭状芽孢杆菌由于可调节人体肠道微生态平衡，具有极强的整肠作用等益生功能，被广泛用作肠炎治疗药物、食品添加剂、兽药和饲料添加剂。因此，筛选大量不同来源的丁酸梭状芽孢杆菌，构建丁酸梭状芽孢杆菌资源库，对于挖掘我国益生菌的资源、选择具有优良益生特性的丁酸梭状芽孢杆菌用于治疗和缓解人类疾病意义重大。丁酸梭状芽孢杆菌作为厌氧菌，主要从粪便和土壤中筛选，目前，普遍采用rcm以及tsn琼脂培养基进行筛选，最后分离株通过生理生化实验及16srrna测序进行鉴定。然而rcm琼脂培养基特异性差，同时丁酸梭状芽孢杆菌不是肠道和土壤中的优势菌株，其相对丰度低导致最终筛选较为困难。tsn琼脂培养基特异性较rcm琼脂培养基高，但由于丁酸梭状芽孢杆菌在样本中分布不均一，特别是粪便样本，含有丁酸梭状芽孢杆菌的样本比例低，工作量大且不易获得目标菌株这使得丁酸梭状芽孢杆菌的筛选和分离具有偶然性和随机性，工作量大且不易获得目标菌株，大大降低了挖掘这一特定种属菌株资源的几率。因而发展高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法具有重要的应用价值。技术实现要素：本发明所述高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是通过设计丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物，凝胶电泳检测pcr扩增结果来确定粪便样品中是否含有丁酸梭状芽孢杆菌，缩小筛选样品的范围来进行的。本发明的第一个目的是提供一种高效鉴定丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是以(a)～(c)任一所示的引物对微生物进行pcr扩增，经凝胶电泳获得特异性条带的为丁酸梭状芽孢杆菌；其中，(a)正向引物：5＇-tcaattagaaggcagagtacc-3＇(seqidno:1)；反向引物：5＇-ctaaaactgactgtggcatt-3＇(seqidno:2)；(b)正向引物：5＇-caaagtcatcatctagtcgt-3＇(seqidno:3)；反向引物：5＇-tccattataagctggtgcat-3＇(seqidno:4)；(c)正向引物：5＇-tacactcctatcatcacccttat-3＇(seqidno:5)；反向引物：5＇-cacctaaatcggcagcagcat-3＇(seqidno:6)。本发明的第二个目的是提供一种筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是以所述(a)～(c)任一所示的引物对样品进行pcr扩增，经凝胶电泳获得特定大小特异性条带的样品含有丁酸梭状芽孢杆菌。在一种实施方式中，所述方法采用(a)所示的引物进行pcr扩增，并获得1022bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。在一种实施方式中，所述方法采用(b)所示的引物进行pcr扩增，并获得491bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。在一种实施方式中，所述方法采用(c)所示的引物进行pcr扩增，并获得445bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。在一种实施方式中，用于所述pcr扩增的反应体系中含有dna模板、2×taqplusmastermix(dye)、正向引物、反向引物和无菌双蒸水的体积比为4:25:1:1:19。在一种实施方式中，dna模板的终浓度为10-20ng/μl。在一种实施方式中，pcr扩增反应条件为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。本发明还要求保护所述方法在微生物
技术领域：
筛选或鉴定丁酸梭状芽孢杆菌方面的应用。在一种实施方式中，所述方法采用选择性培养基培养样品中的微生物，挑取单菌落，以单菌落或其dna为模板进行pcr扩增；所述选择性培养基含有：酵母粉、蛋白胨、亚硫酸钠、柠檬酸铁、新霉素和多粘菌素b。在一种实施方式中，所述选择性培养基为tsn培养基，每l含有：酵母粉10g，蛋白胨15g，亚硫酸钠1g，柠檬酸铁0.5g，新霉素0.05g，多粘菌素b0.02g，琼脂粉20g。有益效果：(1)准确度高、特异性强本发明提供的丁酸梭状芽孢杆菌的pcr扩增引物具有高度特异性，在本发明涉及的丁酸梭菌菌株内，准确率达100％。可以特异性检测出丁酸梭状芽孢杆菌，所检测的阴性对照如索氏梭菌(clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、第三梭菌(clostridiumtertium)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(clostridiumbarati)、类腐败梭菌(clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(clostridiumchauvoei)、clostridiumsulfidigenes、clostridiumaerotolerans和水对照均无阳性结果。(2)灵敏度高，检测结果准确使用传统筛选方法筛选丁酸梭状芽孢杆菌，对样品中是否含有丁酸梭状芽孢杆菌是未知的，导致筛选的盲目性、工作量大。本发明提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的pcr扩增引物具有灵敏度高的特点，最小检出限为103cfu/μl。即使样品中丁酸梭状芽孢杆菌含量低或已经失活，使用本发明的pcr扩增引物进行扩增也可以检测到，因而做出正确的判定，为筛选样品指明了方向，加快了实验进程，提高了筛选效率。(3)耗时少，迅速获得结果传统筛选丁酸梭状芽孢杆菌方法具有盲目性、随机性，筛选周期长、工作量大。一个样品筛选周期为4-5天。分离得到的菌株经16srrna鉴定将耗时2-3天才能得到准确结果。本发明通过一次特定的pcr扩增即可完成粪便样品的筛选，缩小筛选样品范围，减少了约90％不含丁酸梭状芽孢杆菌样品不必要的筛选工作。同时，分离得到的菌株可以经16srrna鉴定，也可以通过本发明提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的pcr扩增引物进行鉴定，从pcr扩增到琼脂糖凝胶电泳检测判定只需要4-5个小时。利用本发明提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，在时间成本、工作量、经济成本等方面具有明显的优势。附图说明图1为实施例2中特异性引物cbu21f/cbu1023r对20株丁酸梭状芽孢杆菌dna扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，m泳道为dnamaker，c泳道为阴性对照，1-20号泳道为20株丁酸梭状芽孢杆菌dna的扩增结果。图2为实施例2中特异性引物cbu80f/cbu551r对20株丁酸梭状芽孢杆菌dna扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，m泳道为dnamaker，c泳道为阴性对照，1-20号泳道为20株丁酸梭状芽孢杆菌dna的扩增结果。图3为实施例2中特异性引物cbu64f/cbu488r对20株丁酸梭状芽孢杆菌dna扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，m泳道为dnamaker，c泳道为阴性对照，1-20号泳道为20株丁酸梭状芽孢杆菌dna的扩增结果。图4为实施例3中特异性引物cbu21f/cbu1023r对12株梭菌属其他梭菌dna扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，m泳道为dnamaker，p泳道为丁酸梭状芽孢杆菌dna的扩增结果即阳性对照，n泳道为阴性对照，1-12号泳道分别为索氏梭菌(clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、第三梭菌(clostridiumtertium)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(clostridiumbarati)、类腐败梭菌(clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(clostridiumchauvoei)、clostridiumsulfidigenes、clostridiumaerotoleransdna的扩增结果。图5为实施例3中特异性引物cbu80f/cbu551r对12株梭菌属其他梭菌dna扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，m泳道为dnamaker，p泳道为丁酸梭状芽孢杆菌dna的扩增结果即阳性对照，n泳道为阴性对照，1-12号泳道分别为索氏梭菌(clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、第三梭菌(clostridiumtertium)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(clostridiumbarati)、类腐败梭菌(clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(clostridiumchauvoei)、clostridiumsulfidigenes、clostridiumaerotoleransdna的扩增结果。图6为实施例3中特异性引物cbu64f/cbu488r对12株梭菌属其他梭菌dna扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，m泳道为dnamaker，p泳道为丁酸梭状芽孢杆菌dna的扩增结果即阳性对照，n泳道为阴性对照，1-12号泳道分别为索氏梭菌(clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、第三梭菌(clostridiumtertium)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(clostridiumbarati)、类腐败梭菌(clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(clostridiumchauvoei)、clostridiumsulfidigenes、clostridiumaerotoleransdna的扩增结果。图7为实施例4中特异性引物cbu21f/cbu1023r灵敏度检测结果。其中，m泳道为dnamaker，c泳道为阴性对照，1-7泳道分别为106cfu/μl、105cfu/μl、104cfu/μl、103cfu/μl、102cfu/μl、101cfu/μl、100cfu/μl浓度的丁酸梭状芽孢杆菌dna扩增结果。图8为实施例4中特异性引物cbu80f/cbu551r灵敏度检测结果。其中，m泳道为dnamaker，c泳道为阴性对照，1-7泳道分别为106cfu/μl、105cfu/μl、104cfu/μl、103cfu/μl、102cfu/μl、101cfu/μl、100cfu/μl浓度的丁酸梭状芽孢杆菌dna扩增结果。图9为实施例4中特异性引物cbu64f/cbu488r灵敏度检测结果。其中，m泳道为dnamaker，c泳道为阴性对照，1-7泳道分别为106cfu/μl、105cfu/μl、104cfu/μl、103cfu/μl、102cfu/μl、101cfu/μl、100cfu/μl浓度的丁酸梭状芽孢杆菌dna扩增结果。图10的a为实施例6中特异性引物cbu21f/cbu1023r对22份粪便样品dna扩增产物的凝胶电泳检测图；其中，m泳道为dnamaker，p泳道为丁酸梭状芽孢杆菌dna的扩增结果即阳性对照，n泳道为阴性对照，1-22号泳道为22份粪便样品dna的扩增结果；b为实施例6中特异性引物cbu21f/cbu1023r对另22份粪便样品dna扩增产物的凝胶电泳检测图；其中，m泳道为dnamaker，p泳道为丁酸梭状芽孢杆菌dna的扩增结果即阳性对照，n泳道为阴性对照，1-22号泳道为22份粪便样品dna的扩增结果。具体实施方式具体实施方式中所涉及的生物材料：20株丁酸梭状芽孢杆菌(clostridiumbutyricum)、其他梭菌如索氏梭菌(clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、第三梭菌(clostridiumtertium)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(clostridiumbarati)、类腐败梭菌(clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(clostridiumchauvoei)、clostridiumsulfidigenes、clostridiumaerotolerans各1株，都取自江南大学食品学院食品生物技术研究中心的菌种保藏中心(中国无锡)。细菌基因组dna提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。实施例1鉴定丁酸梭状芽孢杆菌的方法设计如下引物：(1)引物cbu21f/cbu1023r序列分别为：forwardprimer：5＇-tcaattagaaggcagagtacc-3＇(seqidno:1)reverseprimer：5＇-ctaaaactgactgtggcatt-3＇(seqidno:2)扩增的目的基因片段大小为1022bp；(2)引物cbu80f/cbu551r序列分别为：forwardprimer：5＇-caaagtcatcatctagtcgt-3＇(seqidno:3)reverseprimer：5＇-tccattataagctggtgcat-3＇(seqidno:4)扩增的目的基因片段大小为491bp；(3)引物cbu64f/cbu488r序列分别为：forwardprimer：5＇-tacactcctatcatcacccttat-3＇(seqidno:5)reverseprimer：5＇-cacctaaatcggcagcagcat-3＇seqidno:6扩增的目的基因片段大小为445bp。模板dna的提取：使用细菌基因组dna提取试剂盒(dp302，北京天根生化科技有限公司)提取20个丁酸梭状芽孢杆菌和作为对照的12株细菌培养物的基因组dna。pcr反应体系建立如表1所示；表1pcr反应体系试剂25μl反应体系终浓度2*taqplusmastermix(dye)12.5μl1*forwardprimer,20μm0.5μl0.4μmreverseprimer,20μm0.5μl0.4μmtemplatedna2μl10-20ng/μlddh2o9.5μl/pcr反应程序：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃60s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。结果判定：所述的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的pcr方法结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从粪便样品dna中扩增出了特异性条带，则说明该样品存在丁酸梭状芽孢杆菌，可进行丁酸梭状芽孢杆菌筛选；如果粪便样品dna没有扩增出特异性条带，则说明该样品不含有丁酸梭状芽孢杆菌，从而不需要进行丁酸梭状芽孢杆菌筛选。实施例2筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法基于tsn选择性培养基完成对扩增出目的条带的粪便样品中丁酸梭状芽孢杆菌的筛选。将样品梯度稀释，每个稀释度取100μl涂布于tsn选择性培养基平板上，37℃厌氧培养48h，挑选厌氧条件下正常生长的单菌落在tsn选择性培养基平板上进行划线分离，37℃培养48h后，挑选菌落形态与丁酸梭状芽孢杆菌相似的单菌落。按照实施例1的方式进行pcr扩增，获得相应特异性目的条带的为目标菌株。实施例3高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌pcr扩增引物的准确度检测分别以cbu21f/cbu1023r、cbu80f/cbu551r和cbu64f/cbu488r为引物进行pcr扩增引物的准确度检测。提取20株来自不同样品的丁酸梭状芽孢杆菌的基因组dna，使用实施例1中优化好的引物cbu21f/cbu1023r和反应体系和反应程序进行pcr扩增，检测本发明的pcr扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，从图1可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物cbu21f/cbu1023r，能够准确的扩增出20株丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表示本发明的pcr扩增引物具有高准确度，在发明涉及的丁酸梭状芽孢杆菌样本内，准确率为100％；提取20株来自不同样品的丁酸梭状芽孢杆菌的基因组dna，使用实施例1中优化好的引物cbu80f/cbu551r和反应体系和反应程序进行pcr扩增，检测本发明的pcr扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，从图2可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物cbu80f/cbu551r，能够准确的扩增出20株丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表示本发明的pcr扩增引物具有高准确度，在发明涉及的丁酸梭状芽孢杆菌样本内，准确率为100％；提取20株来自不同样品的丁酸梭状芽孢杆菌的基因组dna，使用实施例1中优化好的引物cbu64f/cbu488r和反应体系和反应程序进行pcr扩增，检测本发明的pcr扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，从图3可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物cbu64f/cbu488r，能够准确的扩增出20株丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表示本发明的pcr扩增引物具有高准确度，在发明涉及的丁酸梭状芽孢杆菌样本内，准确率为100％；实施例4：高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌pcr扩增引物的特异性检测分别以cbu21f/cbu1023r、cbu80f/cbu551r和cbu64f/cbu488r为引物进行pcr扩增引物的特异性检测。提取丁酸梭状芽孢杆菌(clostridiumbutyricum)、索氏梭菌(clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、第三梭菌(clostridiumtertium)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(clostridiumbarati)、类腐败梭菌(clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(clostridiumchauvoei)、clostridiumsulfidigenes、clostridiumaerotolerans的基因组dna，使用实施例1中引物cbu21f/cbu1023r和优化好的反应体系和反应程序进行pcr扩增，检测本发明的pcr扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示，从图4中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物cbu21f/cbu1023r，能够准确的扩增出丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，其他梭菌细菌dna和水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表明本发明的pcr扩增引物具有很好地特异性；提取丁酸梭状芽孢杆菌(clostridiumbutyricum)、索氏梭菌(clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、第三梭菌(clostridiumtertium)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(clostridiumbarati)、类腐败梭菌(clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(clostridiumchauvoei)、clostridiumsulfidigenes、clostridiumaerotolerans的基因组dna，使用实施例1中优化好的引物cbu80f/cbu551r和反应体系和反应程序进行pcr扩增，检测本发明的pcr扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5所示，从图5中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物cbu80f/cbu551r，能够准确的扩增出丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，其他梭菌细菌dna和水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表明本发明的pcr扩增引物具有很好地特异性；提取丁酸梭状芽孢杆菌(clostridiumbutyricum)、索氏梭菌(clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、第三梭菌(clostridiumtertium)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(clostridiumbarati)、类腐败梭菌(clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(clostridiumchauvoei)、clostridiumsulfidigenes、clostridiumaerotolerans的基因组dna，使用实施例1中优化好的引物cbu64f/cbu488r和反应体系和反应程序进行pcr扩增，检测本发明的pcr扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图6所示，从图6中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物cbu64f/cbu488r，能够准确的扩增出丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，其他梭菌细菌dna和水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表明本发明的pcr扩增引物具有很好地特异性，但是存在杂带。实施例5：高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌pcr扩增引物的灵敏度检测分别以cbu21f/cbu1023r、cbu80f/cbu551r和cbu64f/cbu488r为引物进行pcr扩增引物的灵敏度检测。将起始浓度为106cfu/μl的丁酸梭状芽孢杆菌基因组dna，用灭菌双蒸水连续10倍倍比稀释后作为模板dna，采用实施例1中引物cbu21f/cbu1023r和优化的反应体系和反应程序进行pcr扩增，进行特异性引物cbu21f/cbu1023r的灵敏度验证实验。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图7所示，从图7中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物最低检出限为103cfu/μl。将起始浓度为106cfu/μl的丁酸梭状芽孢杆菌基因组dna，用灭菌双蒸水连续10倍倍比稀释后作为模板dna，采用实施例1中引物cbu80f/cbu551r和优化的反应体系和反应程序进行pcr扩增，进行特异性引物cbu80f/cbu551r的灵敏度验证实验。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图8所示，从图8中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物最低检出限为104cfu/μl。将起始浓度为106cfu/μl的丁酸梭状芽孢杆菌基因组dna，用灭菌双蒸水连续10倍倍比稀释后作为模板dna，采用实施例1中引物cbu64f/cbu488r和优化的反应体系和反应程序进行pcr扩增，进行特异性引物cbu64f/cbu488r的灵敏度验证实验。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9所示，从图9中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物最低检出限为104cfu/μl。综合实施例2-4，引物cbu21f/cbu1023r不仅准确性高、特异性强，而且灵敏度高，综合性能优于引物cbu80f/cbu551r和引物cbu64f/cbu488r。实施例6：丁酸梭状芽孢杆菌传统筛选方法随机选取44份人粪便样品，梯度稀释，每个稀释度取100μl涂布于tsn选择性培养基平板上，37℃厌氧培养48h，挑选厌氧条件下正常生长的单菌落在tsn选择性培养基平板上进行划线分离，37℃培养48h后，挑选菌落形态、生长特性等与丁酸梭状芽孢杆菌相似的单菌落，采用16srrna菌株鉴定。结果显示，44份粪便样品获得450个单菌落，经16srrna鉴定，获得丁酸梭状芽孢杆菌1株。筛选周期长达4周，筛选工作效率为11份/周，样品筛选成功率为2.3％以及单菌落筛选成功率为0.2％。实施例7：一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌方法的验证由于粪便样品中存在较多干扰pcr扩增的杂质，对粪便样品的dna进行提取，以去除大部分杂质。随机选取与实施例6中同等数量的44份人粪便样品dna，使用本发明的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，采用特异性引物cbu21f/cbu1023r分别进行pcr扩增。结果显示(图10a、10b)，总共有2份粪便样品dna检测出丁酸梭状芽孢杆菌的特异性条带，为阳性结果。采用实施例6相同的操作方式即筛选这2份粪便样品，结果显示，共获得20个单菌落，经特异性引物cbu21f/cbu1023r鉴定，获得10株丁酸梭状芽孢杆菌，均来自同一份粪便样品。该方法减少了42份不含丁酸梭状芽孢杆菌粪便样品的筛选工作，筛选周期仅5天，筛选工作效率为44份/周，样品筛选成功率为50％以及单菌落筛选成功率为50％。实施例7与实施例6对比可得，筛选工作效率从11份/周提升至44份/周，提升了300％；样品筛选成功率从2.3％提升至50％；单菌落筛选成功率从0.2％提升至50％。发明人应用实施例7的方法进行了多次筛选实验，与实施例6现有的tsn选择性平培养基筛选方法相比，筛选成功率均不同程度提升，对于未筛选到目的菌株的粪便样品原因可能是样品中丁酸梭状芽孢杆菌含量低或保藏不当已经失活。本发明的方法克服了筛选过程中目的菌株培养条件探索困难、易受杂菌干扰等瓶颈问题，极大缩短了筛选所需的周期。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1tcaattagaaggcagagtacc21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ctaaaactgactgtggcatt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3caaagtcatcatctagtcgt20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tccattataagctggtgcat20<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5tacactcctatcatcacccttat23<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6cacctaaatcggcagcagcat21当前第1页12