一种重组几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用与流程

本发明属于微生物学、分子生物学、生物化学领域，更具体地，本发明涉及一种低温几丁质脱乙酰酶的重组异源表达、制备及其应用研究；本发明的低温重组几丁质脱乙酰酶主要应用于医药、食品、农业等行业。
背景技术：
：几丁质(chitin)是由β-n-乙酰-d-葡萄糖胺单体通过β-1,4糖苷键连接成的直链多糖，壳聚糖是几丁质脱n-乙酰基的产物，一般地，n-脱乙酰度在55％以上的就可称之为壳聚糖。壳聚糖与几丁质的区别主要在于它们的聚合度、乙酰化度、乙酰化模式等特征不同，壳聚糖的溶解性比几丁质的溶解性高。壳聚糖分子中的氢离子被氢化使其无法形成氢键，导致壳多糖的化学性质相对几丁质要活泼很多，壳聚糖很容易发生乙酰化、烷基化、甲基化、酯化、醚化等化学反应。近年来，由几丁质制备的壳聚糖有许多独特的生物学活性逐渐引起了科学界和产业界的重视。目前，壳聚糖主要应用于食品、医药、环保等领域，随着研究的深入，其应用范围也在不断的扩展。工业上在生产壳聚糖的过程中，由于大部分采用热碱法，不仅具有生产成本高，产物均一性差，反应进程不易控制等缺点，而且在生产的过程中还会产生碱性废液污染环境。因此，工业上制备壳聚糖的高能耗和环境污染问题是亟待解决的。几丁质脱乙酰酶(chitindeacetylases，cdas)是酶法催化几丁质制备壳聚糖的一种酶种，其通过催化β-n-乙酰-d-葡萄糖胺脱乙酰基即可实现几丁质转化为壳聚糖。此外，一些几丁质脱乙酰酶还具有一定的抗真菌活性，可作为新型杀虫剂和抗真菌剂应用于现代农业。尽管现在已有人员针对以几丁质脱乙酰酶制取壳聚糖进行研究，但是，现有技术中存在的几丁质脱乙酰酶在生理生化性质、生物学功能等方面参差不齐，酶活性、底物特异性方面也良莠不齐，并且普遍存在低温下活性低的问题。因此，本领域亟待找到新型的，具有低温及高活性的几丁质脱乙酰酶，以提高此类酶的工业化生产水平、拓展其应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种重组几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：(a)具有seqidno:2所示氨基酸序列多肽；(b)由(a)所述的多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)功能的多肽；或(c)与(a)所述的多肽的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性，且具有多肽(a)功能的多肽；(d)在(a)或(b)或(c)所述多肽的n或c末端添加标签序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。在一个优选例中，所述的多肽具有较高的低温活性；较佳地，其最适反应温度为15℃；较佳地，其在例如5℃时仍然具有65％以上的催化活性。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：(1)编码如所述多肽的多核苷酸；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。在一个优选例中，该多核苷酸编码如seqidno:2所示氨基酸序列的多肽；较佳地，该多核苷酸的核苷酸序列如seqidno:1所示。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在一个优选例中，所述的整合包括定向整合或随机整合。在另一优选例中，所述的细胞不是植物繁殖细胞或动物干细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞，如但不限于大肠杆菌。在本发明的另一方面，提供一种制备所述的多肽的方法，包括：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的多肽的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的多肽。较佳地，在以下条件下进行培养：诱导剂iptg(当宿主细胞为大肠杆菌时)浓度0.05～0.3mm、较佳地0.08～0.15mm；诱导温度16～35℃、更佳地18～30℃；更佳地18～20℃；诱导时间15～20小时；较佳地16～18小时。在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于：催化几丁质的脱乙酰化，或用于制备催化几丁质的脱乙酰化的组合物；较佳地，脱乙酰化后生成壳聚糖。在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于：抑制微生物，或用于制备具有抑制微生物功能的组合物；较佳地，所述的微生物是细胞壁包含几丁质的微生物。在本发明的另一方面，提供一种组合物，其包含：所述的多肽或所述的宿主细胞；以及工业学或微生物学上可接受的载体。在一个优选例中，所述的组合物为农药组合物，用于植物病害防治，较佳地用于防治棉花黄萎病和黄瓜枯萎病等。在本发明的另一方面，提供一种催化几丁质的脱乙酰化的方法，包括：应用所述的多肽、所述的宿主细胞或所述的组合物对几丁质或含有几丁质的物质进行处理；较佳地，脱乙酰化后生成壳聚糖。在本发明的另一方面，提供一种抑制微生物的方法，包括：应用权所述的多肽、所述的宿主细胞或所述的组合物对需要抑制微生物的对象(如含有微生物的场所、物质、动植物或其加工产物)进行处理；较佳地，所述的微生物是细胞壁包含几丁质的微生物。在一个优选例中，在温度0～35℃、较佳地5～25℃、更佳地10～20℃(如12、14、15、16、18℃)条件下进行处理。在另一优选例中，在ph5～10、较佳地ph5.5～9、更佳地ph6.5～8.5(如ph7，7.5，8)条件下进行处理。在另一优选例中，在nacl0.01～0.5m、较佳地0.03～0.3m、更佳地0.05～0.2m(如0.06、0.08、0.1、0.12、0.15m)条件下进行处理。在另一优选例中，在含有na+、k+、mg2+、zn2+和/或ni2+(金属离子含量如1±0.8mm，较佳地1±0.5mm；更佳地1±0.3mm)条件下进行处理。在另一优选例中，在含有edta(用量如为1±0.5％)条件下进行处理。在另一优选例中，在含有dtt(用量如为1±0.5％)条件下进行处理。在另一优选例中，进行所述处理时，反应体系中不含有：li+、nh4+、ca2+、mn2+、cu2+、fe2+、fe3+、sds和/或tritonx-100。在另一优选例中，进行所述处理时，反应体系中不含有：丙酮、乙醇、甲醇和/或乙腈。在另一优选例中，所述的微生物包括：真菌；较佳地所述真菌包括：轮枝菌属(verticillium)真菌，镰刀菌属(fusarium)真菌，曲霉属(aspergillus)真菌，青霉属(penicillium)真菌。更佳地，所述轮枝菌属真菌包括(但不限于)：大丽花轮枝孢(verticilliumdahlia)；所述镰刀菌属真菌包括(但不限于)：尖孢镰孢黄瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)；所述曲霉属真菌包括(但不限于)：黑曲霉(aspergillusniger)；所述青霉属真菌包括(但不限于)：大核青霉(penicilliummacrosclerotiorum)。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、本发明的几丁质脱乙酰酶的重组表达及条件优化；(a)不同的诱导温度下，酶的可溶表达量的变化；其中lane1为未诱导的全细胞裂解物，lane2～6依次为诱导温度15℃，20℃，25℃，30℃，35℃；(b)不同的诱导剂浓度下，酶的可溶表达量的变化；其中lane1为未诱导的全细胞裂解物，lane2～9依次为iptg浓度0mm，0.01mm，0.02mm，0.05mm，0.1mm，0.15mm，0.25mm，0.3mm；(c)接种不同量的重组菌时，酶的可溶表达量的变化；其中lane1为未诱导的全细胞裂解物，lane2～7依次为接种量0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％；(d)不同的诱导时间下，酶的可溶表达量的变化；其中lane1为未诱导的全细胞裂解物，lane2～9依次为诱导时间4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h，32h。图2、本发明的几丁质脱乙酰酶的重组表达产物的纯化；(a)lane1～lane4分别表示：未加iptg诱导、iptg诱导的全细胞、iptg诱导的上清液、纯化后的几丁质脱乙酰酶；(b)lane1是活性电泳后经考马斯亮蓝r-250染色的几丁质脱乙酰酶，lane2是活性电泳后经calcofluorwhitem2r显色的几丁质脱乙酰酶。图3、本发明的几丁质酶的性质；(a)重组几丁质脱乙酰酶的最适温度研究；(b)重组几丁质脱乙酰酶的温度稳定性研究；(c)重组几丁质脱乙酰酶的最适ph研究；(d)重组几丁质脱乙酰酶的ph稳定性研究；(e)氯化钠对重组几丁质脱乙酰酶活性影响；(f)氯化钠对重组几丁质脱乙酰酶的稳定性的影响。图4、本发明的重组几丁质脱乙酰酶可以对于多株植物病原真菌的抑制作用具体实施方式本发明人经过大规模的筛选和深入的研究，从南极来源的菌株中分离到了一种新颖的几丁质脱乙酰酶(低温几丁质脱乙酰酶)，其不仅能够催化几丁质的脱乙酰化，还能够有效地抑制病原菌，具有非常好的应用前景。本发明的几丁质脱乙酰酶对于低温的适应性好，既能够在原核表达的相对较高的温度下被表达，又具有较高的低温活性。同时，本发明还优化了该低温几丁质脱乙酰酶的重组表达方法，从而使之在宿主细胞中得到了高效的表达。如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“低温几丁质脱乙酰酶”、“几丁质脱乙酰酶”可互换使用，都指具有seqidno:2或其片段或其变异形式或衍生物的蛋白或多肽。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的多肽(本发明中为低温几丁质脱乙酰酶)”是指所述几丁质脱乙酰酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述几丁质脱乙酰酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述几丁质脱乙酰酶的纯度能用氨基酸序列分析。如本文所用，所述“微生物”是指细胞壁含有几丁质的微生物，所述微生物包括菌，如真菌、放线菌或细菌等；较佳地，该“微生物”为“病原微生物”。如本文所用，所述“病原微生物”是指对于人、动物、植物或环境具有危害性的微生物。本发明中，所述“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，“工业学上可接受的载体”或“微生物学上可接受的载体”是用于将本发明的几丁质脱乙酰酶传送给需要处理的对象的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持本发明的几丁质脱乙酰酶的活性的载体。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括所述几丁质脱乙酰酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然几丁质脱乙酰酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原igg片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“所述几丁质脱乙酰酶”指具有所述几丁质脱乙酰酶活性的seqidno:2序列的多肽。该术语还包括具有与所述几丁质脱乙酰酶相同功能的、seqidno:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能；又比如，仅表达该蛋白的催化结构域，而不表达碳水化合物结合结构域也能获得和完整蛋白同样的催化功能。因此该术语还包括所述几丁质脱乙酰酶的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在seqidno:2的保守功能域之外。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与所述几丁质脱乙酰酶dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗所述几丁质脱乙酰酶的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含所述几丁质脱乙酰酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了所述几丁质脱乙酰酶的片段。通常，该片段具有所述几丁质脱乙酰酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供所述几丁质脱乙酰酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然所述几丁质脱乙酰酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。在本发明中，“所述几丁质脱乙酰酶的保守性变异体”指与seqidno:2的氨基酸序列相比，有至多30个，较佳地至多20个，更佳地至多10个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表1最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu本发明的几丁质脱乙酰酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是flag，ha，ha1，c-myc，poly-his，poly-arg，strep-tagii，au1，ee，t7，4a6，ε，b，ge以及ty1。为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述几丁质脱乙酰酶的氨基酸氨基末端添加宿主适用的信号肽。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与几丁质脱乙酰酶的天然编码序列或与seqidno:1所示编码序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seqidno:2的蛋白质，但与几丁质脱乙酰酶的天然编码序列或seqidno:1所示编码序列有差别的核酸序列。编码seqidno:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严谨条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与seqidno:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。所述几丁质脱乙酰酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。本发明也提供了包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或所述几丁质脱乙酰酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的所述几丁质脱乙酰酶。一般来说有以下步骤：(1).用编码所述几丁质脱乙酰酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，所述几丁质脱乙酰酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码所述几丁质脱乙酰酶的dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos、293细胞、或bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。在本发明的优选方式中，所述的宿主细胞为原核细胞。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。作为本发明的优选方式，采用大肠杆菌作为宿主细胞来表达所述几丁质脱乙酰酶。本发明通过构建表达系统，在大肠杆菌中异源表达所述的低温几丁质脱乙酰酶。作为本发明的优选方式，在以下条件下进行培养：诱导剂iptg(当宿主细胞为大肠杆菌时)浓度0.05～0.3mm、较佳地0.08～0.15mm；诱导温度16～35℃、更佳地18～30℃；更佳地18～20℃；诱导时间15～20小时；较佳地16～18小时。在上述优选的条件下，可以获得表达量高且酶活性高的重组几丁质脱乙酰酶。本发明所述的几丁质脱乙酰酶的用途包括：催化几丁质的脱乙酰化，或用于制备催化几丁质的脱乙酰化的组合物。较佳地，所述的几丁质脱乙酰化后生成壳聚糖。本发明所述的几丁质脱乙酰酶的用途还包括抑制微生物，或用于制备具有抑制微生物功能的组合物。较佳地，所述的微生物是细胞壁包含几丁质的微生物。在获得了本发明的几丁质脱乙酰酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥降解底物(特别是催化作为底物的几丁质的脱乙酰化)的作用。作为本发明的优选方式，还提供了一种降解几丁质的方法，该方法包含：用本发明所述的几丁质脱乙酰酶处理待降解的底物(特别是几丁质)。在本发明的部分实施例中，通过催化对硝基乙酰苯胺生成对硝基苯胺来考察几丁质脱乙酰酶的活性。本发明人在确认几丁质脱乙酰酶可以催化其提天然底物几丁质脱乙酰化后，选用对硝基乙酰苯胺作为人工底物进行几丁质脱乙酰酶的酶学性质研究。根据本发明的提示，本领域人员也可以应用该酶来发挥抑制微生物(如病原微生物)的作用。包括以所述的几丁质脱乙酰酶对需要抑制微生物的对象进行处理。所述的微生物包括真菌。在本发明的优选方式中，较佳地所述真菌包括：轮枝菌属(verticillium)真菌，镰刀菌属(fusarium)真菌，曲霉属(aspergillus)真菌，青霉属(penicillium)真菌；更佳地，所述轮枝菌属真菌包括(但不限于)：大丽花轮枝孢(verticilliumdahlia)；所述镰刀菌属真菌包括(但不限于)：尖孢镰孢黄瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)；所述曲霉属真菌包括(但不限于)：黑曲霉(aspergillusniger)；所述青霉属真菌包括(但不限于)：大核青霉(penicilliummacrosclerotiorum)。本发明人发现，所述的几丁质脱乙酰酶对于此类真菌的细胞壁几丁质具有优异的降解作用。因此，本发明的几丁质脱乙酰酶或产生该酶的细胞，能被应用于农业微生物防治上，例如但不限于棉花黄萎病和黄瓜枯萎病。本发明人还优化了利用所述的几丁质脱乙酰酶进行处理的反应体系，作为本发明的优选方式，在以下条件下进行处理：温度0～35℃、较佳地5～25℃、更佳地10～20℃，如12、14、15、16、18℃；ph5～10、较佳地ph5.5～9、更佳地ph6.5～8.5，如ph7，7.5，8。本发明人还发现，少量nacl的应用有利于为本发明的几丁质脱乙酰酶提供良好的反应环境，提高其催化活性；因此，在本发明的优选方式中，在酶反应体系(处理体系)中加入nacl0.01～0.5m、较佳地0.03～0.3m、更佳地0.05～0.2m；如0.06、0.08、0.1、0.12、0.15m。本发明人还发现，在反应体系中含有na+、k+、mg2+、zn2+和/或ni2+有利于促进本发明的几丁质脱乙酰酶的酶活性。在优选的方式下，所述的金属离子含量如1±0.8mm，较佳地1±0.5mm；更佳地1±0.3mm。本发明人还发现，在反应体系中含有edta或dtt有利于促进本发明的几丁质脱乙酰酶的酶活性。在优选的方式下，所述edta的用量为0.1％～5％；较佳地为0.5％～2％，如1％；或，所述的dtt用量为0.1％～5％；较佳地为0.5％～2％，如1％。作为本发明的优选方式，进行所述处理时，反应体系中不含有：li+、nh4+、ca2+、mn2+、cu2+、fe2+、fe3+、sds和/或tritonx-100；也不含有：丙酮、乙醇、甲醇和/或乙腈。本发明获得几丁质脱乙酰酶，酶活性理想，并且能够适于在大肠杆菌表达的温度条件下被重组表达，进一步又能够适用于低温条件下的酶反应(包括酶催化反应或抑制微生物)，有着广泛的工业应用潜力。根据本发明所提供的分离的几丁质脱乙酰酶及其氨基酸序列，本领域人员可以通过蛋白分子改造等手段进一步提高其酶活力、或扩大其适用的ph值范围、温度范围、耐盐性及对于冷、热的稳定性等，因此其应用前景良好。采用这些技术改造本发明所述几丁质脱乙酰酶后生成的变体或衍生物也被包含在本发明中。本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的几丁质脱乙酰酶以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、甘油、dmso或其组合。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中所述几丁质脱乙酰酶的有效量。所述的组合物中还可添加调节本发明的几丁质脱乙酰酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。较佳地，提高所述几丁质脱乙酰酶活性的物质选自：na+、k+、mg2+、zn2+和/或ni2+或在添加至底物后可水解形成na+、k+、mg2+、zn2+和/或ni2+的物质，如氯化钠。提高所述几丁质脱乙酰酶活性的物质还可选自：edta或dtt。本发明的几丁质脱乙酰酶、含有该酶的载体或宿主细胞、含有该酶或宿主细胞的组合物，还可被包含在容器或试剂盒中。较佳地，所述的试剂盒中还包括使用说明书等，以便于本领域技术人员应用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、低温几丁质脱乙酰酶的来源及序列信息本发明所述的低温几丁质脱乙酰酶来源于菌株pseudomonassp.gwsms-1(cctccno.m2019207)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年3月27日，其保藏编号为cctccno.m2019207。获得该pseudomonassp.gwsms-1菌株后，本发明人对其各方面性能、其基因特点及其产生的多种多样的蛋白进行了大量的研究和试验，对重点的功能性基因和蛋白进行着重研究，从而筛选获得本发明所述的低温几丁质脱乙酰酶。所述的低温几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列如下(seqidno:2)：msadyprdligyannpphphwpndarialsfvlnyeeggernilhgdkeseaflsemvsaqplqgqrnlcmeslyeygsragvwrllslfqkhnipltifavamaaqrhpdaikamadagheicshgyrwidyqnmseaeerehmheairilteltgqrpqgwytgrtgpntrrlvreeggflydsdtydddlpywdpastaakphlvipytldtndmrftqvqgfntgddffqylkdafdvlyaegvagapkmltigmhcrllgrparlaslarfieyvqsheqvwcarrvdiakhwhathpfneqaskelsk实施例2、几丁质脱乙酰酶的克隆、异源表达和优化1、材料与方法(1)培养基lb液体培养基：酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l。lb固体培养基：lb液体培养基中加入琼脂粉20g/l。(2)几丁质脱乙酰酶基因的密码子优化、全基因合成及克隆本发明人首先根据表达情况进行了密码子优化，以提高表达效率及dna片段的稳定性。将优化后的序列插入至质粒pet28a(+)中，得到重组质粒pet28-cda，随后将重组质粒pet28-cda转化至大肠杆菌bl21(de3)中进行异源表达。(3)重组几丁质脱乙酰酶基因的表达条件优化接种量：接种量设置为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％。按上述设置将重组菌接种于新鲜lb液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养，当菌液od600达到0.6-0.8时向培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg(对照组未添加iptg)，然后于20℃，150rpm条件下继续培养10小时后收集菌体。诱导温度：按1％接种量将重组菌接种于新鲜lb液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养，当菌液od600达到0.6-0.8时向培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg(对照组未添加iptg)，随后将菌液分别置于15℃、20℃、25℃、30℃和35℃条件下，150rpm继续培养10小时后收集菌体。诱导剂浓度：按1％接种量将重组菌接种于新鲜lb液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养，当菌液od600达到0.6-0.8时向培养基中分别加入终浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mm的iptg(对照组未添加iptg)，然后于20℃，150rpm条件下继续培养10小时后收集菌体。诱导时间：按1％接种量将重组菌接种于新鲜lb液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养，当菌液od600达到0.6-0.8时向培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg(对照组未添加iptg)，然后于20℃，150rpm条件下分别继续培养0、4、8、12、16、20、24、32小时后收集菌体。(4)蛋白电泳10000g离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤并悬浮菌体，然后超声破碎菌体细胞，于4℃条件下15000g离心10min收集上清，取15μl上清液进行sds-page电泳。2、结果(1)密码子优化后序列密码子优化后的几丁质脱乙酰酶基因序列如下(seqidno:1)：atgagcgcggattatccgcgtgatctgattggctacgctaacaacccgccgcacccgcactggccgaacgatgcgcgtatcgcactgagctttgttctgaattatgaagaaggtggtgaacgtaacattctgcatggtgataaagaatctgaagcattcctgtctgaaatggtttctgctcagccgctgcaaggccagcgtaacctgtgtatggaatctctgtatgaatacggttctcgtgcaggcgtttggcgtctgctgagcctgttccagaaacacaacatcccgctgaccatcttcgcggttgcgatggcggcgcagcgtcacccggatgcgatcaaagcaatggcggatgctggccacgaaatctgcagccacggttaccgttggatcgattaccagaacatgagcgaagcggaagaacgtgaacacatgcacgaagcgatccgcatcctgaccgaactgaccggccagcgtccgcagggctggtacaccggtcgtaccggcccgaacacccgtcgtctggttcgtgaagaaggcggcttcctgtacgactctgacacctacgatgatgatctgccgtactgggatccggcgagcaccgcggcgaaaccgcacctggttatcccgtacaccctggataccaacgatatgcgtttcacccaggttcagggcttcaacaccggtgatgatttcttccagtacctgaaagatgcgttcgatgttctgtacgcggaaggcgttgcgggcgcgccgaaaatgctgaccatcggtatgcactgccgtctgctgggtcgtccggcgcgtctggcgtccctggcgcgtttcatcgaatacgttcagagccacgaacaggtttggtgcgcgcgtcgtgtggatatcgcgaaacactggcacgcgacccacccgttcaacgaacaggcgtctaaagaactgagcaaataa(2)表达条件优化诱导温度(图1a)：当诱导温度为15℃时，重组几丁质脱乙酰酶的可溶表达量较低；当诱导温度为20℃-35℃时，重组几丁质脱乙酰酶的可溶表达量变化不明显；因此，最佳诱导温度为20℃。诱导剂浓度(图1b)：当诱导剂浓度为低于0.1mm时，重组几丁质脱乙酰酶的可溶表达量较低；当诱导剂iptg浓度高于0.1mm时，重组几丁质脱乙酰酶的可溶表达量变化不明显；因此，最佳诱导剂终浓度为0.1mm。接种量(图1c)：当接种量为0.5％-1.5％时，重组几丁质脱乙酰酶的可溶表达量逐步增加；当接种量为1.5％-3.0％时，重组几丁质脱乙酰酶的可溶表达量变化不明显；因此，最佳接种量为1.5％。诱导时间(图1d)：当诱导时间短于16小时的时候，重组几丁质脱乙酰酶的可溶表达量较低；当诱导时间长于16小时的时候，重组几丁质脱乙酰酶的可溶表达量变化不明显；因此，最佳诱导时间为16小时。上述较佳的表达条件下，重组几丁质脱乙酰酶的表达量为9.6mg/l。实施例3、重组几丁质脱乙酰酶的制备1、材料与方法(1)粗酶液制备按1％接种量将重组菌接种于新鲜lb液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养，当菌液od600达到0.6-0.8时向培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg，然后于20℃，150rpm条件下分别继续培养16小时后离心收集菌体。离心后的菌体充分悬浮于裂解缓冲液中，通过超声破碎细胞，随后于15000g，4℃离心10min去除细胞碎片，收集得到的上清液即为粗酶液。(2)纯酶制备通过ni-nta亲和层析重力柱进行纯酶的制备，粗酶液在上样前需用0.45μm的滤器过滤，粗酶液上样和填料结合后，使用漂洗缓冲液漂洗约10-15倍的床体积以清除杂蛋白，随后加入洗脱缓冲液洗脱纯酶。洗脱下的纯酶再通过超滤脱盐并切换成储酶缓冲液，分装后储藏于-80℃冰箱中待用。(3)活性测定采用对硝基乙酰苯胺法来测定几丁质脱乙酰酶的活性，该方法以对硝基乙酰苯胺为作用底物，几丁质脱乙酰酶可催化对硝基乙酰苯胺生成对硝基苯胺，通过测定产物在400nm处的吸光值来进行几丁质脱乙酰酶的活性表征。标准曲线绘制：首先称量0.1g对硝基苯胺，蒸馏水定容1l，分别稀释至合适浓度，测定不同浓度的稀释液在400nm处的吸光值，蒸馏水作对照，以对硝基苯胺浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。几丁质脱乙酰酶活性测定：取ph8.00.05m的tris-hcl3ml，加入1ml(200mg/l)的对硝基乙酰苯胺溶液，然后加入重组几丁质脱乙酰酶，50℃水浴保温15min，然后沸水浴3-5min终止反应，加入蒸馏水定容到10ml，振荡混匀，3500g离心10min，取上清液测定其在400nm处的吸光值，空白对照实验体系中添加1ml相应浓度的灭活酶液(沸水浴灭活)，其余同上，测定上清液在400nm处的吸光值。在上述几丁质脱乙酰酶促反应体系条件下，每小时产生1μg对硝基苯胺所需的酶量，定义为一个酶活力单位。2、结果重组几丁质脱乙酰酶的sds-page电泳图如图2(a)，第1条到第4条泳道分别表示未加iptg诱导、iptg诱导的全细胞及iptg诱导的上清液、纯化后的几丁质脱乙酰酶，从图可以看出该酶经过纯化超滤后只显示一个单一的条带，说明该酶经过ni-ntaagarose填料重力柱纯化后已经达到了电泳纯。与蛋白marker比较结果显示，该几丁质脱乙酰酶的大小约为40kda左右)。图2b为几丁质脱乙酰酶的活性蛋白电泳结果，左图为考马斯亮蓝r-250染色，右图为几丁质酶的活性染色(参见trudel1990)，利用calcofluorwhitem2r显色。该显色试剂是一种荧光增白剂，能吸收特定的紫外光反射回蓝光，其与反应产物壳聚糖结合后的荧光强度比其与底物几丁质结合后的荧光强度高，所以在有壳聚糖的位置会出现比背景更亮的条带。根据图2，显示考马斯亮蓝和活性染色的目的条带在电泳胶的位置上一致，说明活性几丁质脱乙酰酶对于几丁质具有脱乙酰作用。纯化后重组几丁质脱乙酰酶的比活力为150.5u/mg，总酶活力回收率约为53％。实施例4、几丁质脱乙酰酶性质1、材料与方法(1)最适温度与温度稳定性最适温度：重组几丁质酶在标准反应条件下分别于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃中反应30min，对照组为沸水浴灭活5min的几丁质脱乙酰酶液，按照几丁质脱乙酰酶活性检测方法测其活性。温度稳定性：将重组几丁质脱乙酰酶在以上温度条件下处理1小时，然后在最适反应温度下测定其几丁质脱乙酰酶的活性。(2)最适ph与ph稳定性最适ph：重组几丁质酶在标准反应条件下分别于ph3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的缓冲液中反应30min，按照几丁质脱乙酰酶活性检测方法测其活。ph稳定性：将重组几丁质酶在以上ph条件下4℃处理1小时，然后在最适反应温度下测定其几丁质脱乙酰酶的活性。(3)氯化钠对重组几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响活性：重组几丁质酶在标准反应条件下分别加入终浓度为0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4m的氯化钠反应30min，然后测定几丁质脱乙酰酶的活性。稳定性：将重组几丁质酶在上述氯化钠浓度条件下4℃处理1小时，然后在最适反应温度下测定其几丁质脱乙酰酶的活性。(4)金属离子等对重组几丁质脱乙酰酶活性影响在最适ph的缓冲体系下分别配制含有nacl、kcl、licl、nh4cl、mgcl2、cacl2、mncl2、cuso4、niso4·6h2o、znso4、cocl2、feso4·7h2o、fecl3·6h2o各1mm的缓冲液，含有edta、dtt、tritonx-100、sds各1％的缓冲液，按照几丁质脱乙酰酶活性检测方法测其活性。(5)有机溶剂对重组几丁质脱乙酰酶活性影响将几丁质脱乙酰酶溶液分别置于体积分数为10％、20％、30％、40％、50％的有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮、乙腈，dmso中4℃保温1小时，然后测定几丁质脱乙酰酶的活性。2、结果(1)最适温度与温度稳定性最适温度：如图3a所示，重组几丁质脱乙酰酶的最适反应温度为15℃，当催化温度在10℃-20℃之间时，该重组几丁质脱乙酰酶的催化活性超过了80％，该酶在反应温度为5℃时仍然具有68.89％的催化活性，当催化温度为55℃时已经检测不到几丁质脱乙酰酶活性。说明该重组几丁质脱乙酰酶为低温酶。温度稳定性：如图3b所示，当该重组几丁质脱乙酰酶在15℃处理1小时后酶活性即下降到76％，当该重组酶在40℃处理1小时后基本检测不到酶活性，也同样说明该重组几丁质脱乙酰酶是一个低温酶。(2)最适ph与ph稳定性最适ph：如图3c所示，该重组几丁质脱乙酰酶的最适催化ph为7.0，当ph小于6.0或大于8.0时催化活性迅速降低，说明该酶是一个中性酶。ph稳定性：如图3d所示：该重组几丁质脱乙酰酶在ph8.0时的稳定性最高。(3)氯化钠对重组几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响活性：如图3e所示，当氯化钠的浓度在0-0.5m时重组几丁质脱乙酰酶的催化活性高于未加氯化钠时的水平，说明该重组酶具有一定的氯化钠耐受性，并且在氯化钠浓度为0.1m时该重组酶的催化效率最高，而氯化钠的浓度高于0.5m时表现为对该重组酶的抑制作用。可见低浓度nacl有助于重组酶的催化活性的提高。稳定性：如图3f所示，该重组几丁质脱乙酰酶在氯化钠浓度高于1m、4℃条件下保存1小时后相对酶活性低于50％，说明该重组酶对氯化钠的耐受性一般。(4)金属离子等对重组几丁质脱乙酰酶的酶活影响如表2所示，1mm的na+、k+、mg2+、zn2+和ni2+对该重组酶的催化活性有促进作用，其中镍离子的促进作用最明显，其它金属离子对重组几丁质脱乙酰酶均有不同程度的抑制作用；1％的edta和1％的dtt对几丁质重组酶的催化活性有促进作用，1％的sds和1％的tritonx-100对该重组酶催化活性表现出完全抑制作用。表2、金属离子及其它化合物对重组几丁质脱乙酰酶活性的影响(5)有机溶剂对重组几丁质脱乙酰酶稳定性的影响如表3所示，该重组几丁质脱乙酰酶在30％的dmso溶液中4℃保存1小时后具有76％的相对酶活性，说明该重组酶对dmso的耐受性很好；该重组酶在20％的丙酮溶液中4℃保存1小时仍然具有80％的活性；该重组酶在20％以上的甲醇、乙醇、乙腈中的耐受性较差，在10％的乙腈中4℃保存1小时相对酶活力低于50％。表3、有机溶剂对重组几丁质脱乙酰酶稳定性的影响实施例5、抗真菌实验1、材料与方法(1)培养基同实施例2。(2)重组几丁质脱乙酰酶的制备同实施例3。(3)抗真菌实验将直径为6mm的滤纸片浸泡于重组几丁质脱乙酰酶液中5min，用直径为0.5cm的打孔器打取菌盘，接种到新的具有pda培养基的培养皿的中央位置；然后在菌盘中央处放1片浸泡好的滤纸片，在20℃培养后观察抑制情况，培养期间，每间隔2个小时在滤纸片上滴加1次实验溶液。(4)真菌供试菌株verticilliumdahliacicc2534(大丽花轮枝孢)；fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumcicc2532(尖孢镰孢黄瓜专化型)；aspergillusnigercicc2039(黑曲霉)；penicilliummacrosclerotiorumcicc40649(大核青霉)。2、结果如图4，本发明的重组几丁质脱乙酰酶可以对于植物病原真菌verticilliumdahliacicc2534、fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumcicc2532具有良好的抑制效果；对aspergillusnigercicc2039和penicilliummacrosclerotiorumcicc40649也表现出具有显著性的抑制作用。抑制率统计如表4。表4菌株第6天抑制率verticilliumdahliacicc253456％fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumcicc253243％aspergillusnigercicc203934％penicilliummacrosclerotiorumcicc4064957％已知verticilliumdahliacicc2534和fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumcicc2532分别可以引起棉花黄萎病和黄瓜枯萎病，这表明本发明所述的重组几丁脱乙酰酶有应用于上述两种植物病害的生物防治的能力。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国极地研究中心(中国极地研究所)<120>一种重组几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用<130>198164<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>945<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(945)<223>密码子优化的几丁质脱乙酰酶基因序列<400>1atgagcgcggattatccgcgtgatctgattggctacgctaacaacccgccgcacccgcac60tggccgaacgatgcgcgtatcgcactgagctttgttctgaattatgaagaaggtggtgaa120cgtaacattctgcatggtgataaagaatctgaagcattcctgtctgaaatggtttctgct180cagccgctgcaaggccagcgtaacctgtgtatggaatctctgtatgaatacggttctcgt240gcaggcgtttggcgtctgctgagcctgttccagaaacacaacatcccgctgaccatcttc300gcggttgcgatggcggcgcagcgtcacccggatgcgatcaaagcaatggcggatgctggc360cacgaaatctgcagccacggttaccgttggatcgattaccagaacatgagcgaagcggaa420gaacgtgaacacatgcacgaagcgatccgcatcctgaccgaactgaccggccagcgtccg480cagggctggtacaccggtcgtaccggcccgaacacccgtcgtctggttcgtgaagaaggc540ggcttcctgtacgactctgacacctacgatgatgatctgccgtactgggatccggcgagc600accgcggcgaaaccgcacctggttatcccgtacaccctggataccaacgatatgcgtttc660acccaggttcagggcttcaacaccggtgatgatttcttccagtacctgaaagatgcgttc720gatgttctgtacgcggaaggcgttgcgggcgcgccgaaaatgctgaccatcggtatgcac780tgccgtctgctgggtcgtccggcgcgtctggcgtccctggcgcgtttcatcgaatacgtt840cagagccacgaacaggtttggtgcgcgcgtcgtgtggatatcgcgaaacactggcacgcg900acccacccgttcaacgaacaggcgtctaaagaactgagcaaataa945<210>2<211>314<212>prt<213>假单胞菌(pseudomonassp.)<400>2metseralaasptyrproargaspleuileglytyralaasnasnpro151015prohisprohistrpproasnaspalaargilealaleuserpheval202530leuasntyrglugluglyglygluargasnileleuhisglyasplys354045gluserglualapheleuserglumetvalseralaglnproleugln505560glyglnargasnleucysmetgluserleutyrglutyrglyserarg65707580alaglyvaltrpargleuleuserleupheglnlyshisasnilepro859095leuthrilephealavalalametalaalaglnarghisproaspala100105110ilelysalametalaaspalaglyhisgluilecysserhisglytyr115120125argtrpileasptyrglnasnmetserglualaglugluarggluhis130135140methisglualaileargileleuthrgluleuthrglyglnargpro145150155160glnglytrptyrthrglyargthrglyproasnthrargargleuval165170175argglugluglyglypheleutyraspseraspthrtyraspaspasp180185190leuprotyrtrpaspproalaserthralaalalysprohisleuval195200205ileprotyrthrleuaspthrasnaspmetargphethrglnvalgln210215220glypheasnthrglyaspaspphepheglntyrleulysaspalaphe225230235240aspvalleutyralagluglyvalalaglyalaprolysmetleuthr245250255ileglymethiscysargleuleuglyargproalaargleualaser260265270leualaargpheileglutyrvalglnserhisgluglnvaltrpcys275280285alaargargvalaspilealalyshistrphisalathrhisprophe290295300asngluglnalaserlysgluleuserlys305310当前第1页1 2 3