奥希替尼耐药细胞株NCI-H1975/AR及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种奥希替尼耐药细胞株nci-h1975/ar及其应用。

背景技术：

肺癌位居全球癌症死亡率中的第一位，非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer，nsclc)占肺癌的80％。非小细胞肺癌5年生存率小于15％，主要原因是大约70％的患者首次诊断为非小细胞性肺癌时已处于晚期，多合并有远处转移。肺癌是率先在临床中应用靶向治疗的癌症种类之一。在过去的十年中，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitor,egfr-tki)是治疗晚期非小细胞肺癌(nsclc)的重要药物，其靶点为表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)。该类药物具有确切的疗效、轻微的不良反应和口服给药的便利等特点，突破了传统化疗药物的瓶颈。

目前临床上应用的第一代egfr-tki有厄洛替尼(商品名特罗凯)、吉非替尼(商品名易瑞沙)、和埃克替尼(商品名凯美纳)，一代tki为可逆性egfr-rtk抑制剂，主要针对两种常见突变(19号外显子缺失突变和21号外显子l858r突变)。二代egfr-rtk有阿法替尼，适应征同一代egfr-tki，但是一种不可逆egfr抑制剂，主要针对egfr的g719x、l861q和s768i等罕见突变位点。三代及后续egfr-tki包括azd9291和co-1686等化合物，不可逆抑制egfr，对野生型egfr也存在抑制作用，并且对发生t790m耐药突变的患者仍有较高的有效率。第一、二代靶向药物虽然疗效显著，但2/3的患者都会在使用药物1-2年出现抗药性，肿瘤可能开始反弹。每个病人对靶向药产生抗药性的原因不尽相同，但50％～60％的egfr抑制剂耐药与t790m突变有关。azd9291(奥希替尼)是一种口服的小分子第三代egfr-tki，是首个针对egfrt790m突变的肺癌药物，能靶向非小细胞肺癌的egfr基因突变(包括18，19，21突变)和egfr-tki获得性耐药(t790m)。azd9291(奥希替尼)在非小细胞肺癌中取得了显著的疗效。

然而，azd9291(奥希替尼)靶向治疗长期使用后，几乎所有患者都会产生耐药性。因此，模拟nsclc肺癌azd9291耐药过程并深入明确nsclcazd9291耐药机制具有重要意义。目前，国内外已经建立了很多肿瘤的耐药细胞株，但尚无非小细胞肺癌对azd9291一线耐药的细胞株。

技术实现要素：

本发明旨在提供非小细胞肺癌对第三代egfr-tki药物奥希替尼(azd9291)耐药的细胞株。

本发明的目的是提供一种对第三代egfr-tki药物奥希替尼(azd9291)耐药的人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar。

本发明另一目的是提供所述人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar在筛选逆转肿瘤耐药性药物中的应用。

本发明再一目的是提供所述人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar在在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明以非小细胞肺癌细胞为诱导对象，采用100nmol的药物持续处理处于对数生长期的非小细胞肺癌细胞，诱导驯化培养6个月；通过细胞形态学观察、药物敏感和耐药性试验，评价非小细胞肺癌对azd9291细胞株的生物学特性，成功构建了携带耐药突变t790m及egfr19外显子缺失的非小细胞肺癌h1975/azd9291耐药株，命名为人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar，即人肺腺癌细胞nci-h1975/ar，并于2019年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：c201982，保藏地址：中国武汉市武汉大学。

本发明构建得到的非小细胞肺癌对azd9291耐药细胞株的耐药倍数在10倍以上，可在作用浓度为100nmolazd9291的培养体系中稳定生长、传代，对azd9291的耐药倍数(ri)为67倍，为研究非小细胞肺癌对靶向药耐药机制、寻找克服非小细胞肺癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，具有重要的作用和良好的应用前景。

因此，所述人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar在筛选逆转肿瘤耐药性药物中的应用，以及在制备抗肿瘤药物中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

优选地其中所述肿瘤为肺癌。具体是指非小细胞癌。更具体为肺腺癌。

本发明具有以下有益效果：

本发明构建了一种非小细胞肺癌对azd9291耐药细胞株，耐药倍数在10倍以上，可在作用浓度为100nmolazd9291的培养体系中稳定生长、传代，对azd9291的耐药倍数(ri)为67倍，为研究非小细胞肺癌对靶向药耐药机制、寻找克服非小细胞肺癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，具有重要的作用和良好的应用前景。

附图说明

图1为耐药细胞株形态学变化；h1975/ar细胞：细胞整体稍大一点，大多数呈多边形伪足更多。

图2为耐药细胞株药物敏感性及耐药性检测结果；ic50：h1975/pt(亲本株)：0.05±0.01μm；h1975/ar(耐药株)：3.35±0.1μmri：67(高度耐药)。

图3为耐药细胞株基因测序前后对比；h1975/pt是耐药前，h1975/ar是耐药后。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1耐药细胞株的诱导建立

人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar的诱导构建：

(1)将非小细胞肺癌细胞h1975培养于含有10％灭活胎牛血清，1％双抗(100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素)的培养基中，放置37℃、5％co2、湿度为96％条件下的电热恒温培养箱中培养；

(2)将对数生长期的非小细胞肺癌细胞以5×10⁵/ml接种于培养瓶中，培养至75％贴壁率时，弃去上清，加入含100nmazd9291药物培养液持续作用细胞，当细胞生长占培养皿80-90％时进行传代，吸去旧的培养基，加2mlpbs洗涤一次，加入适量胰蛋白酶-edta消化液，接着以l×10⁵/ml细胞浓度接种于新培养皿中，在37℃、5％co2、湿度为96％的条件下培养，维持azd9291的作用浓度不变。2-3天更换一次培养基，待细胞恢复生长逐渐长满培养皿，按1:3比例传代细胞，持续使用azd9291(100nm)培养；每两周用mtt法检测ic50值，直至测得稳定的ic50值，而且为原代细胞ic50值10倍以上即为得到耐药株。培养6个月后，筛选得到在作用浓度为100nmolazd9291的培养体系中稳定生长、传代的细胞株。

所得细胞株命名为人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar，并于2019年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：c201982，保藏地址：中国武汉市武汉大学。

实施例2耐药细胞株的形态学观察

1、试验细胞株材料：

实施例1构建的非小细胞肺癌耐药细胞株，即人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar，以及亲本非小细胞肺癌细胞h1975/pt。

2、试验方法：

将两种细胞分别接种于6孔板中，培养至对数生长期，倒置相差显微镜下观察细胞形态。

3、试验结果如图1所示。

h1975/pt和h1975/ar细胞镜下均呈上皮样单层排列贴壁生长，h1975/pt细胞边界清晰，多呈长梭形偶呈多边形，生长松散有空隙；而耐药后的h1975/ar细胞体积变大，边界不清，聚集成簇生长，大部分细胞呈多边形并有伪足形成。

与亲本细胞相比，肺癌耐药细胞株体积增大易成团，形态不规则。说明管癌耐药细胞株在形态上发生了变化。

实施例3耐药细胞株的药物敏感性及耐药性的检测

1、试验细胞株材料：

实施例1构建的非小细胞肺癌耐药细胞株，即人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar，以及亲本非小细胞肺癌细胞h1975/pt。

2、试验方法：

将对数期非小细胞肺癌耐药细胞株h1975/ar，亲本非小细胞肺癌细胞h1975/pt分别配制成浓度为30000个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μl细胞悬液(6000个细胞)；96孔细胞培养板置于37℃，5％co2、湿度为96％的培养箱中，培养24h细胞贴壁后，小心吸出旧的培养基，每孔加入200μl配制好的不同浓度的含药培养基溶液(h1975细胞azd9291的浓度梯度为0.01、0.1、0.5、1、3、5、6、7、8um/ml)每个浓度设6个复孔，阴性对照组用含dmso的培养基。在培养箱中继续培养48h后，小心吸出旧的培养基，每孔加入5mg/ml的mtt溶液(mtt:pbs＝1:9)200ul，37℃培养4h，加入二甲基亚砜(dmso)150μl，摇床10分钟混匀，使用酶标仪在λ＝490nm的条件下测出每孔的od值，计算抑制率和耐药指数。

抑制率(％)＝(对照组od值-试验组od值)/对照组od值×100％

耐药指数(ri)＝耐药细胞ic50/亲本细胞ic50。

3、试验结果：

试验结果如图2所示。本发明构建的非小细胞肺癌细胞h1975/ar细胞株对azd9291的耐药指数(ri)为67倍。

实施例4耐药细胞株的基因突变检测

1、试验细胞株材料：

实施例1构建的非小细胞肺癌耐药细胞株，即人肺腺癌耐药细胞株nci-h1975/ar，以及亲本非小细胞肺癌细胞h1975/pt。

2、试验方法：

illumina细胞全基因组高通量测序，新一代测序(ngs)技术分析全基因组，可提供所有基因组改变的碱基视图，包括单核苷酸位点变异(snv)、插入和缺失、拷贝数变化及结构变异。

3、试验结果如图3所示。

h1975/pt细胞：染色体间易位(interchromosomaltranslocation,ctx)16％，染色体内易位(intra-chromosometranslocation,itx)2％，转置(inversion,inv)0％；缺失(deletion,del)60％；插入(insertion,ins)22％。

h1975/ar细胞：染色体间易位(interchromosomaltranslocation,ctx)5％，染色体内易位(intra-chromosometranslocation,itx)12％，转置(inversion,inv)0％；缺失(deletion,del)71％；插入(insertion,ins)12％。

测序结果说明h1975/ar细胞相对于h1975/pt细胞遗传背景已经完全发生了变化，是一株新的细胞株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。