一种检测奥希替尼含量和有关物质的高效液相法的制作方法

本发明涉及一种检测奥希替尼含量及有关物质的高效液相色谱法，属于药物分析领域。

技术背景

奥希替尼(结构式见附图1)分子式：c28h33n7o2·ch4o3s，黄色结晶性粉末。用于治疗egfrt790m突变阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的靶向药物。它是一种口服的激酶抑制剂，用于既往经表皮生长因子受体(egfr)酪氨酸激酶抑制剂(tki)治疗时或治疗后出现的疾病进展，并且经检测确认存在egfrt790m突变阳性的局部晚期或转移性非小细胞性肺癌(nsclc)成人患者的治疗，并有研究在肺癌脑转移中具有显著治疗。在我国，每年新发病的肺癌患者超过73万人，是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。目前关于检测奥西替尼含量和有关物质方面没有研究。就此本发明采用高效液相法检测奥西替尼的含量和有关物质，以乙腈-磷酸缓冲液(6.8gkh2po4溶解于1l水中，h3po4调ph＝2.8)为流动相，等度洗脱。该检测方法简便高效，色谱峰分离度很好，分离度大于1.5，符合中国药典2010版检测标准，并且色谱峰无拖尾无前延现象，拖尾因子t＝1.12，符合中国药典2010版规定拖尾因子0.95～1.05。所以该检测方法在奥希替尼含量控制和杂质分析具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明经多次精密试验提供一种更准确、高效的测定奥希替尼含量和有关物质的高效液相色谱法。为了达到目的，本发明用了如下技术方案:

本发明的一个具体实施例中，本发明采用agilent高效液相色谱仪测定奥希替尼的含量和有关物质，以乙腈-磷酸缓冲液(6.8gkh2po4溶解于1l水中，h3po4调ph＝2.8)为流动相进行等度洗脱，并且经过多次实验验证，流动相比例优选27:73。

本发明又一个具体实施例中，本发明提供agilenteclipseplus十八烷基键合硅胶色谱柱或者效能相当的色谱柱，经过多次实验验证，本发明优选agilenteclipseplus色谱柱，其分析色谱峰形较好，无拖尾峰无前延峰。

本发明另一个具体实施例中，十八烷基键合硅胶色谱填料颗粒为3-5μm，优选5μm，色谱柱的长度为150mm或250mm，优选250mm。

本发明再一个具体实施例中，利用dad检测器进行190nm-400nm全波长扫描，结果奥希替尼在212nm、272nm、374nm处有最大吸收，且奥希替尼的有关物质在272nm波长下也有较好的吸收，因此优选272nm作为奥希替尼含量和有关物质测定的检测波长。

本发明再一个具体实施例中，利用标准品溶液多次进样来确定进样量，进样精密度次数为5次，所得最佳进样量为5μl。

本发明还有一个具体实施例中，所述流动相的流速为0.5～1.2ml/min，优选1ml/min。

本发明提供一种hplc法测定奥希替尼含量和有关物质的方法，其步骤如下：

标准品溶液配制：取奥希替尼标准品适量，用甲醇溶解并定容，配制浓度为1.5mg/ml的标准品溶液。

供试品溶液配制：取实验室的奥希替尼适量，用甲醇溶解并定容，配制浓度为1.5mg/ml的供试品溶液。

对照品溶液配制：取上述奥希替尼标准品溶液1ml置于25ml容量瓶，用甲醇稀释并定容，配制浓度为0.06mg/ml的对照品溶液。

附图说明

图1为奥希替尼结构式

图2为奥希替尼供试品液相色谱图

图3为奥希替尼标准品液相色谱图

图4为奥希替尼对照品液相色谱图

图5为奥希替尼检测波长液相色谱图

实施方式

色谱条件：

采用美国agilent高效液相色谱仪，agilenteclipseplus色谱柱c18(250×4.6mm5μm)，流动相以乙腈-磷酸缓冲液(6.8gkh2po4溶解于1l水中，h3po4调ph＝2.8)＝27:73，检测波长为272nm，流速为1ml/min，进样量为5μl。

分别取上述供试品溶液和标准品溶液，注入液相色谱仪，按照本发明的色谱条件进行测定，含量按如下公式1计算：

奥希替尼含量(％)＝(a1×c2)/(a2×c1)

其中，a1是供试品峰面积

a2是标准品峰面积

c1是供试品浓度(mg/ml)

c2是标准品浓度(mg/ml)。

分别取上述供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，按照本发明的色谱条件进行测定，供试品如有杂质峰，杂质按如下公式2计算：

奥希替尼有关物质含量(％)＝(a×1×10×w2)/(b×10×200×w1)

其中，a是供试品溶液中杂质峰的峰面积

b是对照品溶液中奥希替尼的峰面积

w1是配制奥希替尼供试品溶液称重时的质量

w2是配制奥希替尼对照品溶液称重时的质量。

实施例1

实验材料：本公司实验室已标定奥希替尼供试品含量为99.2％，单杂为0.19％，总杂为0.36％，奥希替尼标准品购自美国sigma公司，含量为99.0％。

色谱条件：采用美国agilent高效液相色谱仪，agilenteclipseplus色谱柱c18(250×4.6mm5μm)，流动相以乙腈-磷酸缓冲液(6.8gkh2po4溶解于1l水中，h3po4调ph＝2.8)＝27:73，检测波长为272nm，流速为1ml/min，进样量为5μl。

实验步骤：

取本公司实验室奥希替尼适量，用甲醇溶解并定容，配制浓度为1.5mg/ml的奥希替尼供试品溶液，供试品溶液平行配制3次。

取药检所购买的奥希替尼标准品适量，用甲醇溶液并定容，配制浓度为1.5mg/ml的奥希替尼标准品溶液，标准品溶液平行配制3次。

分别取上述供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，按照本发明色谱条件进行检测并记录数据，其中同一标准品重复进样6次，供试品溶液和对照品溶液所得峰面积按上述含量计算公式1，计算供试品中奥希替尼的含量。

图2是供试品奥希替尼的色谱图，奥希替尼主峰保留时间是6.21min，供试品中分离出3个杂质峰，保留时间为4.02min、4.38min和8.87min，3个杂质峰的离度分别为1.63、6.1和7.6，分离效果良好(均大于1.5)符合2010版中国药典的标准。其中4.38min的杂质纯度是0.035％，根据分析处理标准纯度低于0.1％以下的，可忽略不计其含量。图3是标准品奥希替尼的色谱图，将标准品溶液重复进样6次所得峰面积rsd值为0.36％，可见该检测方法重复性良好。供试品和标准品3个样品峰面积平均值分别为8092.66和8061.79，按上述含量计算公1计算本公司实验室奥希替尼含量为99.38％，计算结果如下表1。

表1供试品奥希替尼含量检测结果如下表

结果表明检测奥希替尼含量的方法检测结果准确、可靠、可用于奥希替尼原料药或者丸剂含量检测和杂质分析。

实施例2

实验材料：本公司实验室已标定奥希替尼供试品含量为99.2％，单杂为0.19％，总杂为0.36％，奥希替尼标准品购自美国sigma公司，含量为99.0％。

色谱条件：采用美国agilent高效液相色谱仪，agilenteclipseplus色谱柱c18(250×4.6mm5μm)，流动相以乙腈-磷酸缓冲液(6.8gkh2po4溶解于1l水中，h3po4调ph＝2.8)＝27:73，检测波长为272nm，流速为1ml/min，进样量为5μl。

实验步骤：

分别取实施例1中的供试品溶液和上述浓度为0.06mg/ml的对照品溶液，注入液相色谱仪中，按照本发明色谱条件进行测定并记录供试品溶液中杂质的峰面积，按上述计算公式2计算奥希替尼的杂质含量。

图4为对照品溶液色谱图，其中供试品溶液杂质峰面积分别为14.98和11.64，对照品溶液峰面积为304.51，将供试品溶液中杂质峰面积与对照品峰面积代入公式计算，两个杂质含量分别为0.19％和0.15％，总杂为0.34％。

结果表明本发明提供奥希替尼有关物质的检测方法结果准确、可靠、可用于奥希替尼原料药或者丸剂的杂质含量控制和杂质分析。