一种固定微生物还原吸附重金属铬的方法与流程

本发明涉及一种固定微生物还原吸附重金属铬的方法，属于环境生物技术领域。

背景技术：

异化铁还原菌是指一类能够以fe(iii)作为唯一电子受体、fe(iii)被还原、同时氧化有机碳源，并从中获取能量供自身生长的一类微生物的统称。异化铁还原菌在细菌呼吸和生长过程中能够还原多种金属离子，去除有机物和重金属。铁还原是一种重要的微生物代谢途径，也是地球化学循环过程中的重要环节。异化铁还原期间产生的fe(ii)会催化cr(vi)的还原，这为cr(vi)污染的治理提供了可能。

铬主要用于金属加工、电镀、制革等行业，农业畜禽养殖过程也会产生大量的铬污染。重金属铬是重要的工业原料，我国年产量超过16万吨，产生的六价铬废料高达3500吨。这对厂区附近及废物倾倒地的土壤和水体造成了严重的污染。水体环境中铬一般以cr(vi)和cr(iii)的形式存在，cr(vi)具有很强的流动性，对水体以及土壤造成长期污染，对人体危害也较大，而还原为三价铬后对人体的危害较小。所以，水体中六价铬的去除是解决重金属污染问题的主要方向之一。

重金属的去除方法主要有物理吸附和化学沉淀法，例如离子交换，膜分离，反渗透等方法。这些方法普遍存在能耗高，运行成本高，操作复杂，处理低浓度重金属时效率低等问题。物理和化学修复方法还会造成水体和土壤的二次污染。生物修复成为去除重金属污染的研究热点，而微生物修复以无二次污染，速度快，成本低，高效率等优点成为主要的重金属去除手段。由于含重金属污水毒性高，生存环境差，选择具有耐受性的微生物还原吸附沉淀可溶性重金属离子，选择具有耐受性的微生物以及固定微生物都成为解决毒性环境问题的关键。

技术实现要素：

技术问题：

本发明的主要目的在于提供一种还原六价铬的微生物菌剂、吸附三价铬的铁氧化合物以及其固定化小球的制备方法，以期为去除污水环境中的铬提供一种解决方案。

技术方案：

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种混合菌剂，所述混合菌剂包括蜡状芽胞杆菌(bacilluscereus)dif1以及赤红球菌(rhodococcusruber)dif2；所述蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)dif1，于2018年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，菌种保藏号cctccno:m2018274；所述赤红球菌(rhodococcusruber)dif2，于2018年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，菌种保藏号cctccno:m2018275。

进一步的，所述混合菌剂制备包括如下步骤：

(1)分别活化蜡状芽孢杆菌dif1和赤红球菌dif2,利用lb液体培养基悬浮培养，在30摄氏度和120转下震荡培养12小时；

所述lb液体培养基成分为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph7.0。

(2)取等量蜡状芽孢杆菌dif1和赤红球菌dif2的悬浮培养物放入新鲜lb液体培养基中混合培养12小时，制成混合菌剂备用。

进一步的，所述混合菌剂在异化还原fe³⁺和/或cr⁶⁺方面的应用。

一种微生物菌剂固定化小球的制备方法如下：采用蜡状芽胞杆菌(bacilluscereus)dif1以及赤红球菌(rhodococcusruber)dif2混合制成菌剂，利用负载了氧化铁的活性炭载体吸附混合菌剂后，并利用包埋剂包埋菌剂载体成微生物菌剂固定化小球，实现对铬的还原吸附。

进一步的，所述氧化铁负载活性炭制备方法包括如下步骤：

(1)将40gfe(no3)3·9h2o溶入500ml的去离子水中，加入2-4g活性炭，搅拌；

(2)逐滴的加入1mol/l的氢氧化钠溶液500ml，搅拌，当溶液的ph调节到7～8之间时，停止滴加氢氧化钠；

(3)将沉淀产物在4000g下离心20min，用超纯水冲洗，再离心，灭菌，100摄氏度烘干备用。

进一步的，所述微生物菌剂固定化小球的制备方法包括如下步骤：

(1)氧化铁负载活性炭按1.8-2.5％的质量比例浸入3所述菌剂悬浮培养液中8-12小时；

(2)所得悬浮液以20-30g/l的浓度加入聚乙烯醇，同时，20-30g/l的浓度加入海藻酸钠，混匀以得到菌体包埋液；

(3)将所述菌体包埋液缓慢加入50-80g/l的cacl2交联液中，交联7-10小时，凝固成球，经纯水洗涤得到所述微生物菌剂的固定化小球。

进一步的，所述微生物菌剂固定化小球在微生物还原cr⁶⁺方面的应用。

进一步的，所述包埋剂为海藻酸钠和/或聚乙烯醇。

有益效果

基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明的铬还原微生物菌剂用于还原六价铬时，具有经济高效、无二次污染等优点，可在有氧条件下完全降解浓度为2mg/l的六价铬，可以被用于各种污水中六价铬的去除。

本发明采用固定化手段将上述微生物菌剂固定后可对外界环境的变化起到缓冲作用，可以为微生物提供稳定的生长环境，更适应毒性环境，处理浓度更高的六价铬离子，并延长微生物菌剂的使用时间和次数。

附图说明

图1为dif1与dif2混合菌剂还原铬效率图；

图2为本发明固定微生物还原吸附重金属铬的反应图解；

图3为凝胶微球还原铬效率图；

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：还原六价铬微生物混合菌剂的制备及铬还原实验

(一)混合菌剂制备：

(1)选取两种铬还原菌，蜡状芽孢杆菌dif1和赤红球菌dif2，分别接种在lb液体培养基中；在28-30摄氏度，120转条件下培养8-12小时，od600的值为0.8-1.0；

所述lb培养基配方为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph7.0；

(2)选取两种菌液各10ml接种在100ml灭过菌的新鲜培养基中，在步骤(1)条件下继续培养8-12小时，od600值达到1.0-1.2，菌液备用；

(二)六价铬还原实验：

混合菌剂对cr(vi)还原能力验证实验：配置lb溶液，溶液中加入2mmol/l无水铬酸钠。高温灭菌后加入无菌的100ml血清瓶中，分别在不同血清瓶中加入蜡状芽孢杆菌dif1，赤红球菌dif2，以及dif1与dif2的混合菌剂，密封，置于30℃恒温培养箱中暗培养。每隔12h，在无菌操作台中提取一次样品，按照测铬还原标准曲线的方法，利用紫外分光光度计分别检测样品的cr⁶⁺浓度变化，结果显示，0-24h之间，cr⁶⁺浓度降低迅速，蜡状芽孢杆菌dif1在96h铬还原能力约为1.44mmol/l，赤红球菌dif2在96h铬还原能力约为1.36mmol/l，而dif1与dif2的混合菌剂则为1.58mmol/l，高于纯菌还原效率。见图1。

实施例2：凝胶微球制备及铬还原效果

(一)活性炭负载氧化铁制备，包括以下步骤：

(1)将40gfe(no3)3·9h2o溶入500ml的去离子水中，加入2-4g活性炭，搅拌；

(2)逐滴的加入1mol/l的氢氧化钠溶液500ml，搅拌，当溶液的ph调节到7-8之间时，停止滴加氢氧化钠；

(3)将沉淀产物在4000g下离心20min，用纯水冲洗，再离心，灭菌，100摄氏度烘干备用。

(二)凝胶微球制备,包括以下步骤：

(1)将制备的负载氧化铁的活性炭按1.8-2.5％的质量比例浸入菌剂悬浮培养液中8-12小时；

(2)将(1)所得菌液中加入2-3％质量浓度的海藻酸和2-3％质量浓度的聚乙烯醇，制成菌体包埋液；

(3)将(2)所述菌体包埋液缓慢加入50-80g/l的cacl2交联液中，交联7-10小时，凝固成球，经纯水洗涤得到所述微生物菌剂的固定化小球。

所得的微生物菌剂固定化小球具有如下特点：

(1)两种铬还原菌蜡状芽孢杆菌和赤红球菌均为革兰氏阳性菌，混合后，比单一菌种还原铬效率高，耐受六价铬能力提高，对环境毒性适应能力提高；

(2)活性炭负载了铁氧化合物，比表面积增加，对铬离子吸附能力增加；

(3)铁还原微生物菌剂还原铁氧化合物为二价铁离子，二价铁离子还原六价铬离子为三价铬离子，本身被氧化为三价铁离子，微生物继续还原三价铁离子为二价铁离子，可以循环进行。增加六价铬离子的去除效率，见图2说明。

(三)如上所述制备方法制得的微生物菌剂的固定化小球在还原中六价铬的应用

配置lb溶液，溶液中加入2mmol/l无水铬酸钠。高温灭菌后加入无菌的100ml血清瓶中，在血清瓶中加入微生物菌剂的固定化小球，密封，置于30℃恒温培养箱中暗培养。每隔12h，在无菌操作台中提取一次样品，按照测铬还原标准曲线的方法，利用紫外分光光度计分别检测样品的cr⁶⁺浓度变化，结果显示，0-24h之间，cr⁶⁺浓度降低迅速，微生物菌剂的固定化小球在96h铬还原能力超过90％，高于dif1和dif2混合菌剂的还原效率。见图3。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

蜡状芽胞杆菌dif1的16srrna基因(dna)序列表

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赤红球菌dif2的16srrna基因(dna)序列表

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序列表

<110>东南大学

<120>一种固定微生物还原吸附重金属铬的方法

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<170>siposequencelisting1.0

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<213>蜡状芽胞杆菌dif1(bacilluscereusdif1)

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<213>赤红球菌dif2(rhodococcusruberdif2)

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