仿生肝类器官培养模型及其应用的制作方法

本发明涉及细胞体外培养技术和药物毒性筛选领域，具体涉及仿生肝类器官培养模型构建及其用于药物毒性评估的应用。

背景技术：

药物性肝损伤(druginducedliverinjury,dili)是药物研发失败、上市后被撤回的主要原因之一。由于动物模型缺乏准确的预测性及3r原则(即替代，减少，优化)的大力推行，因此建立可靠的体外人源肝细胞模型并用于药物肝毒性筛选研究尤为重要。然而，研究发现肝细胞在体外常规培养过程中易丧失其结构特征和分化能力，其主要是由于肝细胞缺乏体内肝脏的三维结构及细胞间相互作用，从而导致肝功能和活性的降低，进而影响其用于药物肝毒性筛选评估。因此这些问题的存在在建立可靠的体外肝模型中不容忽视。

当前，体外三维肝细胞球培养相对于常规的二维肝细胞培养在重建体外功能性肝组织具有重要意义。三维细胞球培养为肝细胞提供了一个更接近体内肝组织环境的三维地貌，同质肝细胞间紧密相连可有效的增强肝功能特异性的长期保持。高水平的肝功能可提升细胞对药物的毒性敏感度，更真实的预测体内的药物毒性水平。除三维肝细胞培养，肝细胞与非实质细胞共培养也可有效的提升肝功能。共培养可以模仿体内类似的细胞微环境，主要表现在细胞间的相互作用。在体内，肝在体内是由肝实质细胞和非实质细胞组成。肝实质细胞即肝细胞占肝总体积的80％，是肝功能的主要执行者。非实质细胞包括肝血窦内皮细胞，星状细胞和枯否细胞，其中肝血窦内皮细胞是肝非实质细胞中数量最大的一种细胞，约占肝非实质细胞总数的50％。内皮细胞可分泌许多不同的生长因子，例如vegf，hgf，no和tgf-β1等，为肝细胞提供合适的生存微环境，并促进肝细胞增殖和分化，从而直接参与肝脏发育，肝再生和肿瘤发生等多种生理和病理过程。体外肝细胞共培养非实质细胞内皮细胞不仅可以更好地重建体内微环境，实现异质细胞间相互作用，而且可以更真实地反映实际肝细胞特性。除此之外，药物引起肝损伤不仅是表现在肝细胞坏死，同时也体现在非实质细胞的损害，例如环磷酰胺引起的肝血管损害。因此，肝细胞-内皮细胞共培养模型相比常规的肝细胞单独培养模型更适合用于药物筛选。然而目前暂无肝细胞与内皮细胞共培养模型及用于药物毒性筛选方面的研究，尤其是三维肝细胞球与内皮共培养模型尚无尝试及报道。

有鉴于此，构建三维肝细胞球和内皮细胞的共培养模型在药物肝毒性筛选评价具有重要意义，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种仿生肝类器官培养模型，从而更有利于研究药物毒性筛选。仿生肝类器官培养模型内的同质与异质细胞间相互作用可有效的提升三维肝细胞球特异性功能及代谢功能。仿生肝类器官培养模型结构独特，双细胞双靶点，可用于主要靶点肝细胞的毒性评估也可用于非实质内皮细胞的毒性评估。该培养模型的构建为药物肝毒性筛选提供了一个新颖的思路及有力的工具。

为了实现上述目的，本发明提供的仿生肝类器官培养模型的构建方法，其特征在于：在所述方法中，三维肝细胞球与单层内皮细胞非接触共培养，所述方法包括以下步骤：

将肝细胞和内皮细胞分别进行常规细胞培养；

将肝细胞和内皮细胞分别消化，制备成细胞悬液，备用；

将肝细胞悬液接种到凹槽装置中，置于37℃、5％的co2培养箱内培养12h-24h，以形成三维肝细胞球；

将内皮细胞悬液接种到孔径为0.4-8μm的多孔膜上，置于37℃、5％的co2培养箱内培养1h-6h，以形成单层内皮细胞，之后弃去未贴壁的内皮细胞；

将多孔膜组装到凹槽装置上，形成仿生肝类器官培养模型；

将仿生肝类器官培养模型的培养基加入到多孔膜上，置于37℃、5％的co2培养箱内培养。

进一步地，所述肝细胞和内皮细胞为永生化细胞系、原代细胞、衍生自多能性干细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞。

进一步地，所述肝细胞和内皮细胞来源为人源。

进一步地，所述0.4-8μm的多孔膜材质为高分子聚合物、pet或pc膜中的至少任一种。

进一步地，所述凹槽由水凝胶或高分子有机硅化合物中的至少任一种制得。

进一步地，所述三维肝细胞球为细胞聚集自组装形成无载体支架的细胞球。

进一步地，所述三维肝细胞球直径为20-500μm。

进一步地，肝类器官培养模型在药物毒性筛选评估中的应用。

更进一步地，将药物刺激后的所述仿生肝类器官培养模型培养进行拆分后，对三维肝细胞球和内皮细胞分别进行毒性评估。

本发明的有益效果是：

本发明仿生肝类器官培养模型可以很好的重现体内肝的构型及微环境，同时相对于肝细胞单独培养模型，同质和异质细胞间相互作用可有效的提升肝特异功能及代谢功能，进而提升细胞对药物的毒性敏感度。此外，该仿生肝类器官培养模型结构独特，可任意拆分，双细胞双靶点，可同时执行三维肝细胞球和内皮细胞的毒性测试，可有效的提升药物肝毒性评价的可靠性、准确性及全面性。

附图说明

图1a为采用现有培养液培养与采用本发明的仿生肝类器官培养模型的培养基培养(模型培养基)分别培养的肝细胞和内皮细胞的生长状态比较图，其中，标尺为200μm。

图1b为采用现有培养液培养与采用本发明的仿生肝类器官培养模型的培养基培养(模型培养基)分别培养的肝细胞和内皮细胞的细胞活力的对比图。

图2为本发明的仿生肝类器官培养模型(模型组)、三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)及内皮细胞培养模型(对照组2)的结构示意图。

图3为本发明的仿生肝类器官培养模型(模型组)与三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)的肝功能的对比图。

图4为本发明的仿生肝类器官培养模型(模型组)与三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)的代谢功能的对比图。

图5为本发明的仿生肝类器官培养模型(模型组)与内皮细胞培养模型(对照组2)的内皮细胞能量的对比图。

图6为本发明的仿生肝类器官培养模型(模型组)与三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)分别培养的肝细胞对模型药物对乙酰氨基酚、环磷酰胺和他莫昔芬的毒性敏感性的对比图。

图7为本发明的仿生肝类器官培养模型(模型组)与内皮细胞培养模型(对照组2)分别培养的内皮细胞对模型药物对乙酰氨基酚、环磷酰胺和他莫昔芬的毒性敏感性的对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

本发明的仿生肝类器官培养模型中，三维肝细胞球与单层内皮细胞非接触共培养，并且按如下步骤制得：

1)将肝细胞和内皮细胞分别进行常规细胞培养。肝细胞和内皮细胞分别采用所购买厂商的说明书中规定的培养基进行常规培养。此外，肝细胞和内皮细胞为永生化细胞系、原代细胞、衍生自多能性干细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞，并且肝细胞和内皮细胞来源为人源。

2)将肝细胞和内皮细胞分别消化，制备成均匀的细胞悬液，备用。

3)将均匀的肝细胞悬液接种到凹槽装置中，置于37℃、5％的co2培养箱内培养，12h-24h可形成无载体支架的三维肝细胞球。该三维肝细胞球为细胞聚集自组装形成无载体支架的细胞球，并且肝细胞球直径是可控的，其成球细胞直径范围为20-500μm。

4)将均匀的内皮细胞悬液接种到孔径为0.4-8μm的多孔膜上，置于37℃、5％的co2培养箱内培养，1h-6h内皮细胞贴壁完全，形成单层内皮细胞，弃去未贴壁的内皮细胞。该0.4-8μm的多孔膜材质为高分子聚合物、pet或pc膜中的至少任一种，更优选地，该0.4-8μm的多孔膜为商品化transwell或自制多孔膜模具中的至少任一种。

5)将多孔膜组装到凹槽装置上，形成仿生肝类器官培养模型。该凹槽由水凝胶或高分子有机硅化合物中的至少任一种制得。

6)将仿生肝类器官培养模型的培养基加入到多孔膜上，置于37℃、5％的co2培养箱内培养，最终形成的仿生肝类器官培养模型结构为培养内皮细胞的多孔膜在上，培养三维肝细胞球的凹槽装置在下。在本步骤中，使用的培养基是由肝细胞与内皮细胞所购买厂商的说明书中规定的培养混合制得，其最优混合比例为1：1。

根据本发明的步骤4制成的三维肝细胞球与体内肝细胞生长相似，根据本发明的步骤5单层内皮细胞与体内的内皮细胞生长相似，同时两者细胞空间构型与体内肝组织相似。

本发明的仿生肝类器官培养模型能够应用于药物毒性筛选评估。该药物毒性评估方法为，将模型药物加入仿生肝类器官培养模型，分别计算肝细胞和内皮细胞的半数致死率tc50。其中，在仿生肝类器官培养模型培养1-4天后开始药物刺激，并且在仿生肝类器官培养模型培养给药刺激1-10天后进行药物毒性评估。

本发明的仿生肝类器官培养模型在药物刺激之后可以进行拆分，并且在拆分后对药物刺激后的三维肝细胞球和内皮细胞分别进行毒性评估。

本发明的优点将通过以下实施例进行阐述。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂均可通过商业途径获得，但并不局限于同产家。

以下所述培养基所用试剂除另有说明外，均采购自gibco公司。

实施例1：构建三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)：

肝细胞采用人肝祖细胞heparg(购自thermofisher)，heparg细胞按说明书规定培养基(购自thermofisher)进行培养。heparg细胞采用胰酶进行消化，台盼蓝检测细胞活力，细胞活力达到90％以上，备用。

将heparg细胞悬液吹打均匀后加入到凹槽装置中，放置到37℃，5％co2的培养箱中进行培养，培养24h即可形成三维肝细胞球单独培养模型，每隔2天更换一次培养液。

实施例2：构建内皮细胞单独培养模型(对照组2)：

内皮细胞采用人内皮细胞huvec(购自atcc)，huvec细胞按说明书规定培养基(购自atcc)进行培养。huvec细胞采用胰酶进行消化，台盼蓝检测细胞活力，细胞活力达到90％以上，备用。

将huvec细胞悬液吹打均匀后加入到tranwell上，放置到37℃，5％co2的培养箱中进行培养，培养24h即可形成内皮细胞单独培养模型，每隔2天更换一次培养液。

实施例3：构建仿生肝类器官培养模型(模型组)：

肝细胞采用人肝祖细胞heparg(购自thermofisher)，heparg细胞按说明书规定培养基(购自thermofisher)进行培养。内皮细胞采用人内皮细胞huvec(购自atcc)，huvec细胞按说明书规定培养基(购自atcc)进行培养。heparg和huvec细胞分别采用胰酶进行消化，台盼蓝检测细胞活力，heparg和huvec细胞活力均达到90％以上，备用。

将heparg细胞悬液吹打均匀后加入到凹槽装置中，放置到37℃，5％co2的培养箱中进行培养，培养24h即可形成三维肝细胞球单独培养模型。将huvec细胞悬液吹打均匀后加入到tranwell上，放置到37℃，5％co2的培养箱中进行培养，培养24h即可形成内皮细胞单独培养模型。然后，将培养三维肝细胞球的凹槽装置和培养内皮细胞的transwell可逆组装在一起形成仿生肝类器官培养模型。将heparg与huvec培养液按1：1进行混合配置成仿生肝类器官培养模型的培养基(模型培养基)，培养基临用现配，每隔2天更换一次培养液。

实施例4：

采用模型培养基分别培养heparg细胞和huvec细胞，培养2天后，与采用说明书指定培养基培养的heparg细胞和huvec细胞进行拍照观察及细胞活力对比。细胞活力采用台盼蓝染色法进行测定，死细胞及细胞膜破碎的细胞染蓝色，活细胞不着染，采用luna细胞计数仪，进行自动细胞计数及活力统计。

实验结果如图1a和图1b所示模型培养基中培养的heparg细胞和huvec细胞与在说明书指定培养基中培养的heparg细胞和huvec细胞在形态方面没有明显的改变。细胞活力采用台盼蓝染色后，结果显示相比说明书指定培养基中培养的heparg细胞和huvec细胞，模型培养基中两种细胞的细胞活力均有所提升。结果说明模型培养基可适用于heparg细胞和huvec细胞的培养。

将实施例1、实施例2及实施例3中的模型分别放置到37℃，5％co2的培养箱中进行培养。待培养至第10天后，收集3种模型细胞上清液，采用elisa法检测上清液中人白蛋白和尿素氮的合成分泌量，从而评估模型内肝细胞的特异性功能表达水平。

如图2所示的实验结果分别为实施例1、实施例2及实施例3中的三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)、内皮细胞单独培养模型(对照组2)及仿生肝类器官培养模型(模型组)的结构示意图。其中，实施例3中的模型组结构为培养内皮细胞的多孔膜在上，培养三维肝细胞球的凹槽装置在下，两者为可逆地组装在一起，可任意拆分，组装在一起时无漏液的现象出现。

如图3所示的实验结果为实施例1与实施例3中对照组1与模型组内三维肝细胞球的肝特异性功能的表达水平(即白蛋白和尿素氮合成分泌量)的对比分析，见表1。通过数据可以看出，模型组中三维肝细胞球白蛋白分泌量是对照组1中的三维肝细胞球白蛋白分泌量的5-6倍。模型组中三维肝细胞球尿素氮分泌量是对照组1中的三维肝细胞球尿素氮分泌量的4-5倍。结果说明本发明的仿生肝类器官培养模型可明显提升肝癌类器官细胞球的肝功能特异性表达水平。

表1：实施例1中对照组1与实施例3中模型组内三维肝细胞球的白蛋白和尿素氮合成分泌量

现有技术中，许多化合物和药物大部分是由于肝代谢产生的有毒中间体而引起的肝毒性损伤。几种重要的肝细胞色素p450(例如cyp2c9、cyp2d6和cyp3a4)参与大约80％的市场销售的药品的代谢。在体外肝模型中，肝细胞代谢能力的提升可改善体外肝细胞对药物毒性评价的预测能力。当三维肝细胞球培养至第10天后，采用实时定量反转录--聚合酶链反应(rt-pcr)定量分析实施例3模型组与实施例1对照组1中三维肝细胞球内的3种肝细胞色素p450酶(cyp2c9、cyp2d6和cyp3a4)基因表达水平。将模型组进行拆分，取出模型中凹槽装置，使用冷pbs清洗对照组1和模型组内的三维肝细胞球，利用提纯rna和合成cdna试剂盒，合成cdna，然后逆转录聚合酶反应表达cyp2c9、cyp2d6和cyp3a4基因，以nadph作为内参。

如图4所示的实验结果为实施例1与实施例3中三维肝细胞球均表达cyp2c9、cyp2d6及cyp3a4基因，其中本发明模型组中培养的三维肝细胞球的3种基因表达均明显高于对照组1中培养的三维肝细胞球的3种基因表达水平，见表二。说明本发明模型组可提高三维肝细胞球的代谢活力，更有利于评估由于代谢引起肝毒性的药物预测能力。总结以上肝功能检测结果说明模型组中异质细胞相互作用，即内皮细胞的旁分泌可有效提升三维肝细胞球的肝特异性功能及代谢功能。

表2：模型组和对照组1分别培养的三维肝细胞球的基因表达水平的比值

将实施例3中的模型组在培养至第10天后进行拆分，取出培养内皮细胞的transwell，使用pbs清洗后，使用elisa法检测细胞内三磷酸腺苷(atp)表达水平，并与培养10天后的实施例2的对照组2的内皮细胞atp含量进行对比，见表3。

从图5所示的实验结果中可以看出，本发明模型组中培养的内皮细胞的能量代谢能力是对照组2中培养的内皮细胞的2-3倍。说明本发明模型组中共培养的肝细胞可提升内皮细胞的代谢能力。

表3：模型组和对照组2培养的内皮细胞atp含量

将实施例1、实施例2及实施例3中的模型培养至第3天后，分别加入模型药物对乙酰氨基酚、环磷酰胺和他莫昔芬，药物刺激72h，采用atp试剂盒检测药物刺激后的三维肝细胞和内皮细胞的毒性水平，比较tc50值(细胞半数致死率)。

从图6所示的实验结果中可以看出，3种药物对实施例1和实施例3模型中的三维肝细胞球均有毒性作用。对比对照组1中的三维肝细胞的tc50值，模型组内的三维肝细胞球tc50值更低，结果说明模型组中三维肝细胞球对这3种模型药物的毒性敏感度更显著，这一现象可能与模型组肝细胞代谢能力的提升有关。

从图7所示的实验结果中可以看出，对乙酰氨基酚和环磷酰胺对对照组2中的内皮细胞无毒性，但是对模型组中的内皮细胞有明显毒性，结果说明模型组中的乙酰氨基酚和环磷酰胺通过三维肝细胞球代谢形成有毒的中间体，从而有而有毒的中间体引起对模型组中的内皮细胞损伤。在该模型中，环磷酰胺的肝毒性损伤与体内肝毒性一致，临床上环磷酰胺主要是由于肝血管损伤从而引起药物性肝损伤。他莫昔芬对实施例2和实施例3中的模型均有毒性作用，但模型组中的内皮毒性比对照组2中的内皮细胞毒性更敏感。以上结果说明仿生肝类器官培养模型可以更有效的用于药物肝毒性筛选，双细胞双靶点可以测定候选化合物的毒性靶向细胞(肝细胞和内皮细胞)及其毒性机制研究，进而提升药物肝毒性评价的可靠性、准确性及全面性。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。