一种小鼠子宫内膜上皮细胞及其3D分化培养物模型的构建方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种小鼠子宫内膜上皮细胞及其3d分化培养物模型的构建方法。

背景技术：

子宫内膜是一种高度再生组织，长期处于增生、分化和脱落的动态循环中，子宫内膜分为基底层和功能层，其中功能层的组成包括了海绵层与致密层，研究表明子宫内膜组织中存在一小群具有强大增殖和多向分化潜能的干细胞，可不断分裂增殖，及时补充脱落的终末分化细胞，使其始终保持自我更新和再生能力，在生殖活动中占有重要地位。随着组织工程学和细胞、亚细胞及分子水平的发展，体外构建组织工程化子宫片层或其3d分化培养物为进一步研究子宫疾病和胚胎着床提供了更多理想实验模型的选择。为获得大量的、高纯度的子宫内膜细胞，国内外学者对子宫细胞的分离、培养方法进行了大量研究。1989年研究者根据细胞沉降速度不同分离得到子宫细胞，2001年研究者采用200目、350目的滤网过滤2次可获得纯度较高的人子宫细胞，1992年fernandez-shaw将悬浮的子宫内膜细胞吸附在用抗体包被的免疫磁珠上也可成功分离子宫细胞，但以上方法都有不足，分离的子宫内膜细胞在体外无法稳定增殖培养，在产量和纯度上也有待提高。

目前，从动物或人活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低(包括子宫内膜细胞)，其中细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都比较低，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限，例如有的只能进行短期的原代培养，有的只能进行有限的传代培养(2～3代)，影响大批量开展实验研究。为了在体外进行上皮细胞的扩增培养，目前国内外大多通过遗传操作，如转入病毒或细胞癌基因延长体外细胞存活的代数。但是遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，因此这些细胞也不具备正常分化功能。

上皮组织层具有一定的极性，从而形成了两个不同的表面：顶端面和基底外侧面。顶端面主要面对外环境，而基底面则是接触底层细胞以及全身脉管系统，其形态学及分化程度在子宫内膜及相关功能修复机制研究中至关重要。近年来，女性子宫内膜过薄现象逐年严重，宫腔粘连发病率也居高不下，已经成为体外受精—胚胎移植中周期取消和种植失败的重要原因之一。研究发现子宫内膜上皮细胞在分泌期的集落形成能力强，推断子宫内膜上皮细胞具有子宫内膜干细胞的特性，在子宫内膜周期性脱落和增长中起到关键作用。目前，利用常规二维的细胞培养模型来探索子宫内膜再生及相关功能修复机制研究始终存在着明显的局限性。因此，建立稳定的更接近子宫内环境及生理状态的三维子宫内膜上皮3d分化培养物模型意义重大。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺陷，本发明的首要目的是提供一种小鼠子宫内膜上皮细胞。该子宫内膜上皮细胞具有传代稳定、存活率高的特点，具有谱系分化潜能、正常dna损伤修复功能，没有锚定-非依赖性生长的能力。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

提供一种小鼠子宫内膜上皮细胞，该细胞命名为小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027，已于2016年8月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏登记入册编号为cctccno：c2015108。

该细胞来源于雌性c57小鼠正常的子宫内膜组织，染色体为二倍体，str(短串联重复序列)基因型以10个“短串联重复序列基因座/等位基因长度”来表示：amel/x，csf1po/10/12，d13s317/11/13，d16s539/9/13，d21s11/28，d5s818/11/12，d7s820/8/10，th01/9/9.3，tpox/8/11，vwa/15/16。

上述小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027原代分离培养：

(1)收集60～75天性成熟、体成熟的雌性c57小鼠正常的子宫内膜组织。

(2)消化液的配制：含胶原酶和分散酶均为0.2mg/ml的小鼠子宫内膜上皮细胞2d培养基；其中，小鼠子宫内膜上皮细胞2d培养基的配制：dmem与ham'sf12nutrientmix按体积比3:1混合的培养基，同时添加4～6％胎牛血清(fbs)、1～3nm三腆甲状腺氨酸(triiodothyronine)，0.4～0.65％胰岛素铁晒传递蛋白(insulintransferrinselenium)试剂、4～6μg/ml铁传递蛋白(transferrin)、9～11ng/ml表皮生长因子(epithelialgrowthfactor〈egf〉)、0.3～0.5μg/ml氢化可的松(hydro-cortisone)、35～45μg/ml庆大霉素(gentamicin)、45～55nmcalpeptin、35～45ng/ml重组人il-lra，3μg/ml重组人r-spondin-1以及1-100ng/ml人胎盘催乳素(humanplacentallactogen)。

(3)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用pbs缓冲液(0.01m，ph7.4)洗，然后将组织样品放入含预冷pbs的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀将组织剪碎。

(4)将小鼠正常的子宫内膜组织样品放入10倍于组织样品体积的含步骤(2)所配制消化液的无菌培养皿中，37℃消化1～3小时。

(5)将消化后的组织低速离心(1000rpm)5分钟，去除上清。

(6)将细胞沉淀重悬于2～5ml的0.25％(质量体积比)胰酶-edta中，置于冰上1小时或室温消化10分钟。

(7)加入10ml含10％(v/v)fbs的dmem，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清。

(8)重悬细胞沉淀于小鼠子宫内膜上皮细胞2d培养基中，接种于t25或t75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5％co2。将原代小鼠子宫内膜上皮细胞与放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞共培养，所述共培养利用上述培养基进行，所述小鼠成纤维细胞为小鼠成纤维细胞mfc/hl-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：c201714。

本发明的另一目的在于提供上述小鼠子宫内膜上皮细胞的3d分化培养物模型的构建方法。此方法构建的小鼠子宫内膜上皮3d分化培养物分化完全后，具有与正常子宫内膜组织相似的结构特征，形成由上皮细胞构成的假复层结构，包括基底层和功能层。同时也具有与正常小鼠子宫内膜组织相同的特异性蛋白标志物和细胞紧密连接相关蛋白的表达特点，具有结构功能性，可用于子宫内膜组织的生理学研究和再生修复的功能性研究。技术方案如下：

一种小鼠子宫内膜上皮细胞3d分化培养物模型的构建方法，包括如下步骤：

1)上述小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027的传代培养：

(1)当在t25或t75的培养瓶中培养的小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027增殖至70～90％丰度时，用1×pbs(0.01m，ph7.4)洗涤细胞2次，加入0.6～1ml浓度为0.02％的edta后轻轻晃匀使之与培养瓶上的细胞充分接触，20～30s后拍打培养瓶外壁，使小鼠成纤维细胞从培养瓶壁上脱落，当在显微镜下观察到小鼠成纤维细胞全部脱离瓶壁后，迅速移除edta，用pbs洗涤细胞3次。

(2)再用0.05％(质量体积比)胰酶-edta消化单层细胞2～5分钟。

(3)加入10mldmem中和消化反应1～2分钟，1000rmp离心5分钟，去除上清。

(4)以1:2,1:3,1:4或1:5比例重悬细胞沉淀于小鼠子宫内膜上皮细胞培养基，接种于培养瓶与放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞共培养，培养条件是37℃、5％co2。

(5)细胞保种时可将约1×10⁶个小鼠子宫内膜上皮细胞重悬于1～2ml的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％dmso,v/v)中，储存于液氮中备用。

c、小鼠子宫内膜上皮细胞的气液3d培养：

(1)将0.4μm的millicellpcf内置物(12mmsize,millipore)放入六孔板中，每孔最多放三个内置物；

(2)用400μ1小鼠子宫内膜上皮细胞培养基(2d培养基)重悬5×10⁵个的小鼠子宫内膜上皮细胞，然后接种到每个内置物中；

(3)每个孔板内部即内置物外围加入2ml的2d培养基；

(4)将放有内置物的六孔板放入培养箱中，37℃，5％co2培养时长为48小时；

(5)将内置物内部及外部中的培养基更换为3d分化培养基；

3d分化培养基的配制：dmem与f12按体积比1:1混合的培养基，同时添加0.5～1.2μm胰岛素(sigma-aldrich16634)、0.05～0.2μm铁传递蛋白(sigma-aldricht0665),0.05～0.15μm氢化可的松(sigma-aldrichh0396),0.005～0.015μm三腆甲状腺氨酸(sigma-aldricht6397),1～4μm肾上腺素(sigma-aldriche4642),0.1～1ng/ml表皮生长因子，2～8×10^-8m视黄酸(sigma-aldrichr2625),0.1～1μm磷酸乙醇胺(sigma-aldrichp0503),0.1～1μm氨基乙醇(sigma-aldriche0135),1～5μm硫酸锌(sigma-aldrichz0251),100u/ml青霉素g硫酸(sigma-aldrichp3032),100μg/ml链霉素硫酸盐(sigma-aldrichs9137),0.5～1.5mm氯化钙(sigma-aldrichc3881)，1-50nmbeta-雌二醇estradiol(e2,sigmae4389),0.1-10ug/ml人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hcg,sourcebioscienceabc403),1-100ng/ml人胎盘催乳素(humanplacentallactogen，hpl,r&d5757-pl)。

(6)将放有内置物的培养板放入培养箱中，培养15～17小时，使insert内部的细胞与细胞之间形成紧密连接；

(7)移除内置物内部及外围所有的培养基，外部的培养皿中加入3d分化培养基，开始分化培养；

(8)在培养箱中培养小鼠子宫内膜上皮细胞14～21天，培养条件为37℃，5％co2，每2～3天更换内置物外围的3d分化培养基。

在本发明的一个实施例中，将传代小鼠子宫内膜上皮细胞传至六孔板中进行细胞爬片，待细胞汇合度达到80％以上，便可通过检测荧光蛋白的方法对其特异性、激素受体表达进行鉴定。荧光显微镜下观察，如图4所示，子宫内膜由柱状上皮细胞组成，可检测到cytokeratin(ck18)和细胞干性标记分子p63的表达，不表达外宫颈鳞状分层上皮(ectocervicalsquamousepithelium)的标志分子cytokeratin14(ck14)。同时观测到子宫内膜上皮细胞中特有的标记蛋白estrogenreceptor(er)和progesteronereceptor(pr)，由于成纤维细胞中不含有角蛋白，故不显色。蓝色荧光为dapi标记的椭圆形且规则的细胞核。红蓝重合显色者为子宫内膜上皮细胞，由此可见，传代小鼠子宫内膜上皮细胞纯度较好且有激素受体表达，为具有谱系分化潜能的上皮细胞，为构建小鼠子宫内膜上皮3d培养物模型奠定基础。

在本发明的一个实施例中，将传代小鼠子宫内膜上皮细胞传至六孔板中进行细胞培养，待细胞汇合度达到90％以上，经放线菌素d处理便可通过dna损伤应答反应的方法对其正常dna损伤修复功能进行鉴定。成像分析系统下观察，如图5所示，与未处理组对比分析p53和下游效应基因p21的表达变化。由此可见，传代小鼠子宫内膜上皮细胞可表达p53、p21，具有正常dna损伤修复功能，为构建小鼠子宫内膜上皮3d培养物模型奠定基础。

在本发明的一个实施例中，将传代小鼠子宫内膜上皮细胞传至铺有软琼脂的六孔板中进行培养，培养观察3～4周观察小鼠子宫内膜上皮细胞体外克隆形成情况(肿瘤细胞hela作为对照)。显微镜下观察，如图6所示，小鼠子宫内膜上皮细胞在体外无异常增殖和致瘤性。由此可见，传代小鼠子宫内膜上皮细胞没有锚定-非依赖性生长的能力，为构建小鼠子宫内膜上皮3d培养物模型奠定基础。

在本发明的一个实施例中，将分化完成的小鼠子宫内膜上皮3d培养物放入4％多聚甲醒(wt/vol)中，4℃固定过夜，根据标准制作流程制作石蜡病理切片，h&e染色后显微镜下观察，如图8a所示，正常小鼠子宫内膜组织和3d分化培养物具有相似的结构特征，均具有完整的上皮细胞形成的假复层结构，包括基底层和功能层。与此相对应图8b所示，3d培养基中不添加雌二醇时(图8b左)，小鼠子宫内膜上皮细胞很难分化为基底层和功能层；3d培养基中不添加人绒毛膜促性腺激素时(图8b右)，小鼠子宫内膜上皮细胞3d分化培养物结构不完整。

在本发明的一个实施例中，将获得的小鼠子宫内膜上皮3d培养物的石蜡病理切片进行dab免疫组化分析，如图9所示，正常的小鼠子宫内膜组织和体外建立的3d分化培养物具有相同的特异性蛋白标志物和细胞紧密连接相关蛋白的表达特点(主要体现在蛋白分子的表达分布和表达量上)，可检测cytokeratin14(ck14)、cytokeratin(ck18)、p63、estrogenreceptor(er)、progesteronereceptor(pr)等标记分子的表达，进一步验证所建立的3d分化培养物具有的结构功能性。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

1.本发明提供的小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027，原代分离培养自小鼠子宫内膜组织，该细胞未导入任何外源基因，为小鼠的正常细胞；细胞能稳定增值，连续传代培养54天，细胞群体倍增数超过50，本发明的小鼠子宫内膜上皮细胞仍能保持增殖状态在体外生长增殖。本发明的小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027经str基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种小鼠的正常细胞株。

2.本发明提供的小鼠子宫内膜上皮细胞2d培养基中的人胎盘催乳素，增加了体外培养细胞的增殖能力；同时，3d分化培养基中雌二醇，人绒毛膜促性腺激素，人胎盘催乳素，在3d培养条件下，协同调节子宫内膜上皮细胞的增殖与分化的正常功能，所建立的3d分化培养物不仅可以在体外正常分化，且具有与正常小鼠子宫内膜组织相似的结构特征。

3.本发明提供的3d模型可用于子宫内膜组织的生理学研究和再生修复的功能性研究。

附图说明

图1是小鼠子宫内膜上皮细胞str(短串联重复序列)基因型；

图2是小鼠子宫内膜上皮细胞共培养形态图(早代与晚代)；

图3是小鼠子宫内膜上皮细胞的增殖倍增曲线图；

图4是小鼠子宫内膜上皮细胞的组织学特异性鉴定结果图；

图5是小鼠子宫内膜上皮细胞的dna损伤应答实验结果图；

图6是小鼠子宫内膜上皮细胞的软琼脂克隆形成实验结果图；

图7是小鼠子宫内膜上皮细胞的基质胶3d分化培养物生长形态图；

图8是小鼠子宫内膜上皮细胞的气液3d分化培养物形态，与小鼠子宫内膜组织结构对比，以及与不添加激素的3d培养基的培养条件对比；

图9是小鼠子宫内膜上皮细胞气液3d分化培养物组织学特异性鉴定结果图；

本发明提供的一种小鼠子宫内膜上皮细胞，该细胞命名为小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027，已于2016年8月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏登记入册编号为cctccno：c2015108。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离培养：

(1)收集60～75天性成熟、体成熟的雌性c57小鼠正常的子宫组织。

(2)消化液的配制：含胶原酶和分散酶均为0.2mg/ml的小鼠子宫内膜上皮细胞2d培养基；其中，小鼠子宫内膜上皮细胞2d培养基的配制：dmem与ham'sf12nutrientmix按体积比3:1混合的培养基，同时添加5％胎牛血清(fbs)、1nm三腆甲状腺氨酸(triiodothyronine)，0.5％胰岛素铁晒传递蛋白(insulintransferrinselenium)试剂、5μg/ml铁传递蛋白(transferrin)、10ng/ml表皮生长因子(epithelialgrowthfactor〈egf〉)、0.5μg/ml氢化可的松(hydro-cortisone)、35μg/ml庆大霉素(gentamicin)、45nmcalpeptin、35ng/ml重组人il-lra，3μg/ml重组人r-spondin-1以及1ng/ml人胎盘催乳素(humanplacentallactogen，hpl,r&d5757-pl)。

(3)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用pbs缓冲液(0.01m，ph7.4)洗，然后将组织样品放入含预冷pbs的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀将组织剪碎。

(4)将小鼠正常的子宫组织样品放入10倍于组织样品体积的含步骤(2)所配制消化液的无菌培养皿中，37℃消化约2小时。

(5)将消化后的组织低速离心(1000rpm)5分钟，去除上清。

(6)将细胞沉淀重悬于5ml的0.25％(质量体积比)胰酶-edta中，置于冰上1小时或室温消化10分钟。

(7)加入10ml含10％(v/v)fbs的dmem，用70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清。

(8)重悬细胞沉淀于小鼠子宫内膜上皮细胞培养基中，接种于t25培养瓶培养，培养条件是37℃、5％co2。将原代小鼠子宫内膜上皮细胞与放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞共培养，所述共培养利用上述2d培养基进行，所述小鼠成纤维细胞为小鼠成纤维细胞mfc/hl-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：c201714。

按照上述方法分离培养成功的原代小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027，提取细胞的基因组dna(细胞/组织基因组dna提取试剂盒dp304，天根公司),利用16hs系统(dc2101，promega公司)进行10个基因座(9个str位点和1个性别位点)的dna复合扩增；经和powertypertm16macro软件分析样本数据，进行自动基因分型，str分型结果图1，检测10个str基因位点。以“str基因座/等位基因长度”来表示：amel/x，csf1po/10/12，d13s317/11/13，d16s539/9/13，d21s11/28，d5s818/11/12，d7s820/8/10，th01/9/9.3，tpox/8/11，vwa/15/16。本发明的小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027经str基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种小鼠的正常细胞株。

【实施例2】小鼠子宫内膜上皮细胞的传代培养：

(1)当在t25培养瓶中培养的小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027增殖至80％丰度时，用1×pbs(0.01m，ph7.4)洗涤细胞2次，加入1ml浓度为0.02％的edta后轻轻晃匀使之与培养瓶上的细胞充分接触，20s后拍打培养瓶外壁，使小鼠成纤维细胞从培养瓶壁上脱落，当在显微镜下观察到小鼠成纤维细胞全部脱离瓶壁后，迅速移除edta，用pbs洗涤细胞3次。

(2)再用0.05％胰酶-edta消化单层细胞5分钟。

(3)加入10mldmem中和消化反应1分钟，1000rmp离心5分钟，去除上清。

(4)以大约1:3比例重悬细胞沉淀于小鼠子宫内膜上皮细胞培养基，接种于培养瓶与放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞共培养，培养条件是37℃、5％co2。

(5)细胞保种时可将约1×10⁶个小鼠子宫内膜上皮细胞重悬于约1ml的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％dmso,v/v)中，储存于液氮中备用。

按照上述方法进行原代和传代培养小鼠子宫内膜上皮细胞，在显微镜下观察细胞的形态如图2，在传代培养第6代和第49代都表现为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。

培养建系的细胞增殖倍增曲线如图3，连续传代培养54天，细胞群体倍增数超过50，本发明的小鼠子宫内膜上皮细胞仍能保持增殖状态在体外生长增殖。

【实施例3】小鼠子宫内膜上皮细胞的组织学特异性鉴定分析

(1)待共培养的小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027汇合度达到80％以上时，消化制备成细胞悬液，每孔约3×10⁴个传至六孔板中进行细胞爬片，次日弃去培养液，加入1mlpbs清洗3次，每次3min。

(2)每孔加入300μl的4％多聚甲醛固定30min，固定后加入1mlpbs清洗3次，每次3min。

(3)每孔加入300μl的tritonx-100通透液通透10min，通透后加入1mlpbs清洗3次，每次3min。

(4)每孔加入300μl的1％bsa-pbs封闭液封闭30min，封闭后弃去废液并加入已稀释(1:200)的一抗，震荡孵育1h，pbs清洗后加入已稀释(1:100)的二抗cy3，避光孵育1h。

(5)清洗后每孔加入300μldapi，避光孵育10min，pbs清洗后避光在用荧光显微镜观察。

按照上述方法鉴定培养的小鼠子宫内膜上皮细胞，荧光显微镜下观察如图4，子宫内膜由柱状上皮细胞组成，可检测到cytokeratin(ck18)和细胞干性标记分子p63的表达，不表达外宫颈鳞状分层上皮(ectocervicalsquamousepithelium)的标志分子cytokeratin14(ck14)。同时观测到子宫内膜上皮细胞中特有的标记蛋白estrogenreceptor(er)和progesteronereceptor(pr)，由于成纤维细胞中不含有角蛋白，故不显色。蓝色荧光为dapi标记的椭圆形且规则的细胞核。红蓝重合显色者为子宫内膜上皮细胞，由此可见，传代小鼠子宫内膜上皮细胞纯度较好且有激素受体表达，为具有谱系分化潜能的上皮细胞，为构建小鼠子宫内膜上皮3d培养物模型奠定基础。

【实施例4】小鼠子宫内膜上皮细胞的dna损伤应答实验(hela细胞为阳性对照)

(1)将小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027、hela细胞分别接种到6孔细胞培养板中。

(2)待细胞融合度达到70％左右时，加入放线菌素d，作用浓度为0.5nm，继续培养24h，未加药的细胞作为阴性对照。

(3)24h后收集细胞，做蛋白质免疫印迹(western-blotting)分析，步骤如下：

a、细胞裂解：放线菌素d作用细胞24h后，弃培养基，预冷的pbs洗涤细胞3次，加入ripa裂解液(含0.1mmol/lpmsf)冰上放置15～20min，将裂解液转移至1.5ml的离心管，4℃12000rpm离心12min，收集上清。

b、bca法测定总蛋白浓度。

c、将蛋白样品与加样缓冲液混匀，沸水中煮5～10min，瞬时离心，收集上清。

d、sds-page凝胶电泳：配制10％的分离胶和5％的浓缩胶。将上步得到的上清液加入凝胶微孔，4℃冰箱中恒压80v电泳40min后，调节电压至120v约1.5h至溴酚蓝移动到凝胶底部，停止电泳。

e、转膜：pvdf膜在甲醇中浸泡30s，使之浸透，转移缓冲液中静置5min。取下凝胶，按照正→负(海绵-滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸-海绵)的顺序放入电转槽，低温条件下恒压转膜(100v，60min)。

f、封闭：5％bsatbst溶液，室温摇床封闭60～90min。

g、孵一抗：鼠抗人p21抗体用封闭液稀释至(1：1000)，鼠抗人p53抗体(1:500)，鼠抗人β-actin抗体(1:2000)稀释，封闭置于摇床4℃冰箱过夜。tbst洗膜，5min3次。

h、孵二抗：hrp标记羊抗鼠二抗(1:5000)，室温孵育1h；tbst洗膜，5min×3次。

i、显影：ecl底物液a液：b液(1:1)混合，加到pvdf膜上，放于凝胶成像仪中，调节曝光时间、光圈至形成清晰的图像。

j、图像分析软件对图片进行分析。

放线菌素d(引起dna损伤)处理细胞，hela细胞作为对照。作用24h后，结果如图5所示：相比未加处理的小鼠子宫内膜上皮细胞，放线菌素d使小鼠子宫内膜上皮细胞p53蛋白以及下游的应答分子p21蛋白表达量都明显升高，而肿瘤细胞hela的p53蛋白、p21蛋白表达水平没有改变。说明小鼠子宫内膜上皮细胞具有正常的dna损伤应答能力。

【实施例5】小鼠子宫内膜上皮细胞的软琼脂克隆形成实验(hela细胞为阳性对照)

(1)用蒸馏水分别配制1.2％和0.8％两个浓度的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃的水浴中保证其不凝固。

(2)按照1:1的比例使1.2％的琼脂糖和2×dmem或2×2d培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)在无菌离心管中混匀，取3ml混合液注入6孔板中，冷却凝固，作为底层琼脂置37℃，5％co2培养箱中备用，每株细胞做三个复孔。

(3)再按照1:1的比例使0.8％的琼脂糖和2×dmem或2×2d培养基在无菌离心管中混匀，再向管内加入2ml的细胞悬液(琼脂糖和2×dmem混合液中加入含有hela细胞的琼脂糖细胞悬液，琼脂糖和2×2d培养基中加入含有小鼠子宫内膜上皮细胞的细胞悬液)，六孔板中每孔加3×10⁴个细胞，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃，5％co2培养箱中培养30天。

(4)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆的形态与细胞的致瘤性。

hela细胞和小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027在软琼脂中的生长状态如图6，hela细胞能在软琼脂中形成明显较大的细胞克隆，小鼠子宫内膜上皮细胞在琼脂中未能形成细胞克隆。说明小鼠子宫内膜上皮细胞不具有锚定-非依赖性生长的能力，即不具有致瘤性，为正常细胞。

【实施例6】小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027的matrigel胶3d培养、固定及dapi染色(hela细胞为阳性对照)

(1)将matrigel(bd，bdbiosciences)于4℃过夜溶解。

(2)在冰上充分预冷的8孔chamberslide中，均匀加入80μl的matrigel平铺底部成一层，置于37℃的培养箱15～30min，使matrigel形成胶状。

(3)胰酶-edta常规消化小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027约3min，完全dmem中和消化反应。

(4)1000rmp离心5min，去上清，重悬细胞沉淀于150μl的2d培养基中，加入上述(2)制备的8孔chamberslide中，置于37℃的培养箱15～30min。

(5)洗掉上层培养基。

(6)冰上充分预冷的2d培养基150μl中加入5％的matrigel，微量枪头混匀后沿培养板壁小心加入8孔chamberslide中。

(7)于37℃、5％co2条件下培养7天，每2天更换一次培养基。

(8)用dapi进行染色并在荧光显微镜下观察。

按照上述方法在matrigel中培养的小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027，经固定和dapi染色后，显微镜下观察细胞的生长分化状况，免疫荧光染色结果如图7，hela细胞会形成杂乱无章的聚集体，甚至有些会呈现“葡萄串样”的结构。而小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027在matrigel中分化培养能够形成表面光滑的球状体，dapi染色观察到球体内部结构规则，与癌细胞对比说明小鼠子宫内膜上皮细胞具有正常分化能力。

【实施例7】小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027的气液3d培养：

(1)将0.4μm的millicellpcfinsert(12mmsize,millipore)放入六孔板中，每

每孔最多放三个inserts。

(2)用400μ1小鼠子宫内膜上皮细胞2d培养基重悬5×10⁵个的小鼠子宫内膜上皮细胞，然后接种到每个insert中。

(3)每个孔板内部即insert外围加入2ml的2d培养基。

(4)将放有insert的六孔板放入培养箱中，37℃，5％co2培养时长为48h。

(5)将insert内部及外部中的培养基更换为3d分化培养基。

3d分化培养基的配制：dmem与f12按体积比1:1混合的培养基，同时添加1μm胰岛素(sigma-aldrich16634)、0.1μm铁传递蛋白(sigma-aldricht0665),0.1μm氢化可的松(sigma-aldrichh0396),0.01μm三腆甲状腺氨酸(sigma-aldricht6397),1μm肾上腺素(sigma-aldriche4642),0.1ng/ml表皮生长因子，2×10^-8m视黄酸(sigma-aldrichr2625),0.1μm磷酸乙醇胺(sigma-aldrichp0503),0.1μm氨基乙醇(sigma-aldriche0135),1μm硫酸锌(sigma-aldrichz0251),100u/ml青霉素g硫酸(sigma-aldrichp3032),100μg/ml链霉素硫酸盐(sigma-aldrichs9137),0.5mm氯化钙(sigma-aldrichc3881)，1nmbeta-雌二醇(e2,sigmae4389),0.1ug/ml人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hcg,sourcebioscienceabc403),1ng/ml人胎盘催乳素(humanplacentallactogen，hpl,r&d5757-pl)。

(6)将放有insert的培养板放入培养箱中，培养15～17h，使insert内部的细胞与细胞之间形成紧密连接。

(7)移除insert内部及外围所有的培养基，外部的培养皿中加入3d分化培养基，开始分化培养。

(8)在培养箱中培养小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-02714～21天，培养条件为37℃，5％co2，每2～3天更换insert外围的3d分化培养基。

(9)分化完成后，将insert放入4％多聚甲醛(wt/vol)中，4℃固定过夜。

(10)吸走insert内部的4％多聚甲醛，用新的手术刀将膜切下，并将膜小心铺在滴有4％多聚甲醛的光滑平皿上，将膜剪成两半，并将边缘部分剪成小块。

(11)将小块的膜放入两个4％的多聚甲醛湿润的化妆棉中，再放入包埋盒。

(12)立即将包埋盒放入含有70％乙醇的容器内，根据标准制作流程制作石蜡病理切片。

【实施例8】小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027在气液3d培养条件下呈现正常分化，具有正常子宫内膜组织相似的结构

(1)切片：将小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027的气液3d分化培养物或者子宫内膜组织，固定后连续切片，切片厚度为5μm。

(2)捞片：将切好的石蜡切片置入37℃温水中，待石蜡中的组织完全伸展开来，即用载玻片捞起固定。

(3)烤片：将固定有组织切片的载玻片置入烘箱中，烘箱温度为70℃，2h，然后置于室温冷却。

(4)脱蜡：将切片分别先后浸入二甲苯i和二甲苯ii中，时间分别为5min。

(5)获水：将石蜡切片分别置于梯度乙醇的时间分别为无水乙醇5min，95％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min，水洗1min。

(6)苏木素染色：苏木塑染液染色10min，水洗1min，盐酸乙醇的分化时间为10s。

(7)蓝化：水洗1s。

(8)伊红染色：伊红染液染色30s。

(9)分色与脱水：先水洗1min，再置于梯度乙醇中，分别为80％乙醇20s，95％乙醇20s，无水乙醇i20s，无水乙醇ii1min。

(10)透明：将石蜡切片置于二甲苯中10min。

(11)封片：中性树脂封片。

如图8所示，正常小鼠子宫内膜组织(a)和3d分化培养物(b)具有相似的结构特征，主要分为三层，最上层的角质层、中间的移行层和最下层的基底层，表明所建立的3d分化培养物不仅可以在体外正常分化，且具有与正常子宫内膜组织相似的结构特征。

【实施例9】小鼠正常子宫上皮细胞mnuec/hl-027在气液3d培养条件下正常分化，且表达与正常子宫内膜组织相同的分化标志蛋白

(1)石蜡切片脱蜡至水：将石蜡切片置于新鲜的二甲苯中，15min×2次，除去多余的液体后，分别置于梯度乙醇中：依次为无水乙醇浸泡3min×2次，95％乙醇中浸泡3min，85％乙醇中浸泡3min，75％乙醇中浸泡3min，自来水冲洗1min，pbs溶液冲洗3min×3次。

(2)用3％的h2o21份+分析级甲醇9份混合配制过氧化物酶阻断剂，室温下灭活10min，蒸榴水浸洗3次，每次1min。

(3)抗原微波修复：将切片浸入浓度为0.01m,ph6.0拧橡酸缓冲液，微波中最大火力加热至沸腾，微波中最大火力温度为98℃～100℃，冷却，冷却时间约为5～10min，不烫手即可，反复两次。

(4)血清封闭：封闭(用荧光笔画出包含组织的区域)：将切片置于湿盒中，室温下，使用10％fbs封闭，时间为37℃，30min，封闭完毕后甩去多余液体。

(5)一抗孵育：在各组织的圆圈中滴加用pbs、抗原稀释液或者封闭液稀释的抗体，一抗分别为cytokeratin14(ck14)、cytokeratin(ck18)、p63、estrogenreceptor(er)、progesteronereceptor(pr)，一抗的稀释比例为1:100，滴加约50μ1，应完全覆盖组织，置于湿盒中，放入4℃中冰箱孵育过夜，时间为15h以上，取出后37℃复温，取出倾去多于液体，用pbs洗，pbs浸洗时间为5min×4次。

(6)甩去多余pbs，滴加反应增强液，室温孵育或37℃孵育，20min，倾去多于抗体，pbs洗5min×4次。

(7)二抗孵育：滴加约50μl酶标二抗，稀释比例为1:100，室温或者37℃孵育，孵育时间为30min，取出倾去多余液体，用新鲜的pbs浸洗5min×4次。

(8)dab显色：dab显色液应按照试剂盒说明书现配现用，显微镜下控制反应时间，显色反应时间约3～5min，染色完毕后用蒸榴水浸洗，1min×3次。

(9)苏木素复染，复染时间为10min，取出，过水后，在1％盐酸乙醇中分化，分化时间为3～5s，自来水或者1％的氨水返蓝，时间为1min。

(10)脱水透明：将石蜡切片依次置于梯度酒精中，分别为70％乙醇20s，80％乙醇20s，90％乙醇20s，95％乙醇20s，无水乙醇i1min，无水乙醇ii1min，二甲苯i2min，二甲苯ii2min。

(11)通风晾干，中性树胶封片。

如图9所示，正常的小鼠子宫内膜组织和体外建立的3d分化培养物具有相同的特异性蛋白标志物和细胞紧密连接相关蛋白的表达特点(主要体现在蛋白分子的表达分布和表达量上)，可检测cytokeratin14(ck14)、cytokeratin(ck18)、p63、estrogenreceptor(er)、progesteronereceptor(pr)等标记分子的表达，进一步验证所建立的3d分化培养物具有的结构功能性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。