针对寨卡病毒囊膜蛋白的鼠源单克隆抗体的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种针对寨卡病毒囊膜蛋白的鼠源单克隆抗体。

背景技术：

寨卡病毒(zikv)是一种黄病毒科病毒，感染该病毒后可导致新生儿的小头畸形并影响婴幼儿的神经发育，成年人感染后可能发生格林巴利综合征(gbs)导致神经损伤。目前尚无获批的疫苗和特效药物，这里我们利用自己构建的寨卡病毒囊膜蛋白免疫小鼠，获得了具备较强中和活性的鼠源单克隆抗体，将来可以运用于寨卡病毒的防治。

技术实现要素：

本发明的目的在于填补现有技术的空白，提供一种特异性好的针对寨卡病毒囊膜蛋白的鼠源单克隆抗体。

为实现上述目的，本发明提供了一种针对寨卡病毒囊膜蛋白的鼠源单克隆抗体，其轻链序列如seqno.1所示，其重链序列如seqno.3所示。

上述针对寨卡病毒囊膜蛋白的鼠源单克隆抗体对应的碱基序列，其轻链序列如seqno.4所示，其重链序列如seqno.5所示。

本申请的发明人在中国专利申请201811613477.1的研究基础上，利用其构建噬菌体文库的方法进行筛选并进一步基因改造，获得了效果较好的鼠源单克隆抗体。

本发明的有益效果：通过筛选和基因改造后，所获抗体的特异性好、中和活性强、抗聚集性增强，适用于寨卡病毒的防治。

附图说明

图1-1为tango软件预测d10氨基酸序列的易聚集区。

图1-2为tango软件预测d11氨基酸序列的易聚集区。

图1-3为d10和d11的重链突变区域比较图。

图2为sds-page检测d11抗体。

图3为elisa分析d11抗体与寨卡病毒囊膜蛋白的结合图。

图4为d11抗体对寨卡病毒的中和活性图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：d10抗体序列的获得

基于已构建的免疫小鼠fab噬菌体展示文库(该文库的获得方法来自中国专利申请201811613477.1公开的黄病毒科病毒囊膜蛋白的融合蛋白及其制备方法与应用，利用其中的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠后获得其cdna，利用其作为噬菌体展示文库的构建材料)，我们进行了三轮的筛选，并通过单克隆phageelisa，将其中的阳性克隆送测序，得到了d10候选克隆的碱基序列，并经氨基酸翻译软件，得到了其氨基酸序列，轻链氨基酸序列如seqno.1所示，其重链氨基酸序列如seqno.2所示。

实施例2：利用tango软件对获得的d10氨基酸序列进行优化

利用tango软件(http://tango.crg.es/)对d10候选克隆的氨基酸序列进行易聚集区预测，发现其中存在较强的易聚集区域，如图1-1，因此对该区域进行点突变，得到d11抗体，其轻链氨基酸序列如seqno.1所示，其重链氨基酸序列如seqno.3所示，对应碱基序列，轻链如seqno.4所示，重链如seqno.5所示。突变后的氨基酸序列经tango软件重新预测，发现该易聚集区被明显改善，如图1-2，1-3。

实施例3：293f细胞表达d11抗体并sds-page检测

将突变后的碱基序列克隆到双启动载体pvitro2-neo-mcs(invivogen)上，利用pei转染293f细胞后进行蛋白的表达，经过5-7天的表达，将293f细胞的培养上清经proteina(ge)纯化，将纯化后的蛋白经过浓换液后，得到溶于pbs缓冲液的d11抗体。经sds-page电泳检测，发现其呈现轻链和重链两条带，如图2所示。

实施例4：elisa分析d11抗体与寨卡病毒囊膜蛋白的结合

包被寨卡病毒囊膜蛋白在elisa板上，将d11抗体经梯度稀释后作为一抗，hrp标记的goat-anti-mouseigg(abcam)作为二抗，显色后，通过信号强度变化计算ec50，约在200nm，如图3所示。

实施例5：d11抗体的寨卡病毒中和实验。

将d11抗体进行梯度稀释后分别与100pfu的寨卡病毒在37℃共同孵育1h，然后将该混合物加入到提前一天铺有vero细胞的24孔板中，37℃孵育1h，弃掉病毒混合液，加入上层覆盖物(dmdm配制的2％羟甲基纤维素，含有2％血清)继续培养2-3天。形成明显病毒噬斑后，弃掉上层覆盖物，并加入3.7％的甲醛溶液进行固定，后加入1％浓度的结晶紫对噬斑进行染色，根据不同抗体浓度下病毒噬斑减少的情况，计算出ic50值，约为100nm，如图4所示。

sequencelisting

<110>武汉班科生物技术股份有限公司

<120>针对寨卡病毒囊膜蛋白的鼠源单克隆抗体

<130>2019004

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>215

<212>prt

<213>轻链(artificialsequence)

<400>1

aspalavalvalthrglngluseralaleuthrthrserproglyglu

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglulysproasphisleuphethrgly

354045

leuileglyglythrasnasnargalaproglyvalproalaargphe

505560

serglyserleuileglyasplysalaalaleuthrilethrglyala

65707580

glnthrgluaspglualailetyrphecysalaleutrptyrserasn

859095

histrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglnpro

100105110

lysserserproservalthrleupheproproserserglugluleu

115120125

gluthrasnlysalathrleuvalcysthrilethraspphetyrpro

130135140

glyvalvalthrvalasptrplysvalaspglythrprovalthrgln

145150155160

glymetgluthrthrglnproserlysglnserasnasnlystyrmet

165170175

alasersertyrleuthrleuthralaargalatrpgluarghisser

180185190

sertyrsercysglnvalthrhisgluglyhisthrvalglulysser

195200205

leuserargalaaspcysser

210215

<210>2

<211>446

<212>prt

<213>d10重链(artificialsequence)

<400>2

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

sermethistrpvallysglnalaproglylysglyleumettrpmet

354045

glytrpileasnprogluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

thrglyargphealaphevalvalgluthrseralaserthralatyr

65707580

leulysileasnserleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glyargglyglyaspasptyrserileasptyrtrpglyglnglythr

100105110

servalthrvalserseralalysthrthrproproservaltyrpro

115120125

leualaproglyseralaalaglnthrasnsermetvalthrleugly

130135140

cysleuvallysglytyrpheprogluprovalthrvalthrtrpasn

145150155160

serglyserleuserserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

seraspleutyrthrleuserserservalthrvalproserserthr

180185190

trpprosergluthrvalthrcysasnvalalahisproalaserser

195200205

thrthrvalasplyslysleugluproargglyprothrilelyspro

210215220

cysproprocyslyscysproalaproasnleuleuglyglyproser

225230235240

valpheilepheproprolysilelysaspvalleumetileserleu

245250255

serproilevalthrcysvalvalvalaspvalsergluaspasppro

260265270

aspvalglnilesertrpphevalasnasnvalgluvalhisthrala

275280285

glnthrglnthrhisarggluasptyrasnserthrleuargvalval

290295300

seralaleuproileglnhisglnasptrpmetserglylysgluphe

305310315320

lyscyslysvalasnasnlysaspleuproalaproilegluargthr

325330335

ileserlysprolysglyservalargalaproglnvaltyrvalleu

340345350

proproproglugluglumetthrlyslysglnvalthrleuthrcys

355360365

metvalthraspphemetprogluaspiletyrvalglutrpthrasn

370375380

asnglylysthrgluleuasntyrlysasnthrgluprovalleuasp

385390395400

seraspglysertyrphemettyrserlysleuargvalglulyslys

405410415

asntrpvalgluargasnsertyrsercysservalvalhisglugly

420425430

leuhisasnhishisthrthrlysserpheserargthrpro

435440445

<210>3

<211>446

<212>prt

<213>d11重链(artificialsequence)

<400>3

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

sermethistrpvallysglnalaproglylysglyleumettrpmet

354045

glytrpileasnprogluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

thrglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leulysileasnserleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glyargglyglyaspasptyrserileasptyrtrpglyglnglythr

100105110

servalthrvalserseralalysthrthrproproservaltyrpro

115120125

leualaproglyseralaalaglnthrasnsermetvalthrleugly

130135140

cysleuvallysglytyrpheprogluprovalthrvalthrtrpasn

145150155160

serglyserleuserserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

seraspleutyrthrleuserserservalthrvalproserserthr

180185190

trpprosergluthrvalthrcysasnvalalahisproalaserser

195200205

thrthrvalasplyslysleugluproargglyprothrilelyspro

210215220

cysproprocyslyscysproalaproasnleuleuglyglyproser

225230235240

valpheilepheproprolysilelysaspvalleumetileserleu

245250255

serproilevalthrcysvalvalvalaspvalsergluaspasppro

260265270

aspvalglnilesertrpphevalasnasnvalgluvalhisthrala

275280285

glnthrglnthrhisarggluasptyrasnserthrleuargvalval

290295300

seralaleuproileglnhisglnasptrpmetserglylysgluphe

305310315320

lyscyslysvalasnasnlysaspleuproalaproilegluargthr

325330335

ileserlysprolysglyservalargalaproglnvaltyrvalleu

340345350

proproproglugluglumetthrlyslysglnvalthrleuthrcys

355360365

metvalthraspphemetprogluaspiletyrvalglutrpthrasn

370375380

asnglylysthrgluleuasntyrlysasnthrgluprovalleuasp

385390395400

seraspglysertyrphemettyrserlysleuargvalglulyslys

405410415

asntrpvalgluargasnsertyrsercysservalvalhisglugly

420425430

leuhisasnhishisthrthrlysserpheserargthrpro

435440445

<210>4

<211>645

<212>dna

<213>轻链(artificialsequence)

<400>4

gacgctgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactc60

acttgtcgctcaagtactggggctgttacaactagtaactatgccaactgggtccaagaa120

aaaccagatcatttattcactggtctaataggtggtaccaacaaccgagctccaggtgtt180

cctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggca240

cagactgaggatgaggcaatatatttctgtgctctatggtacagcaaccattgggtgttc300

ggtggaggaaccaaactgactgtcctaggccagcccaagtcttcgccatcagtcaccctg360

tttccaccttcctctgaagagctcgagactaacaaggccacactagtgtgtacgatcact420

gatttctacccaggtgtggtgacagtggactggaaggtagatggtacccctgtcactcag480

ggtatggagacaacccagccttccaaacagagcaacaacaagtacatggctagcagctac540

ctgaccctgacagcaagagcatgggaaaggcatagcagttacagctgccaggtcactcat600

gaaggtcacactgtggagaagagtttgtcccgtgctgactgttcc645

<210>5

<211>1338

<212>dna

<213>d11重链(artificialsequence)

<400>5

cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatc60

tcctgcaaggcttctggttataccttcacagactattcaatgcactgggtgaagcaggct120

ccaggaaagggtttaatgtggatgggctggataaaccctgagactggtgagccaacatat180

gcagatgacttcacgggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctac240

ttaaagatcaacagcctcagaaatgaggacacggctacatatttttgtggtagagggggc300

gacgactattctattgactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaa360

acgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatg420

gtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaac480

tctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctac540

actctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgc600

aacgttgcccacccggccagcagcaccacggtggacaaaaaacttgagcccagagggccc660

acaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatcc720

gtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtc780

acatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtg840

aacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtact900

ctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttc960

aaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaaccc1020

aaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgact1080

aagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtg1140

gagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggac1200

tctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaa1260

agaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaag1320

agcttctcccggactccg1338