前列腺癌早期诊断试剂盒的制作方法

本实用新型涉及医学检验技术领域，具体涉及一种前列腺癌早期诊断试剂盒。

背景技术：

前列腺癌是老年人最常见的肿瘤。在欧美国家，其发病率已连续多年居男性恶性肿瘤发病率首位，死亡率居第二位。我国前列腺癌发病率虽然低于欧美国家，但是随着我国人口老龄化和饮食结构的改变，近年来也呈现出上升趋势。目前前列腺癌的早期诊断主要依赖于前列腺特异性抗原和经直肠超声检查。前列腺特异性抗原的广泛应用无疑会提高前列腺癌的早期诊断，但是血清中前列腺特异性抗原水平的特异性和敏感性在前列腺癌的诊断中是具有争议的。因此，为了对前列腺癌进行更精准的早期诊断，有必要探寻敏感度更高、特异性更好的前列腺癌相关标志物。

目前前列腺癌的早期诊断主要依赖于前列腺特异性抗原和经直肠超声检查。前列腺特异性抗原特异性较低，从而导致前列腺穿刺活检结果阴性率较高，也使得重复穿刺数增加。尤其是前列腺特异性抗原水平介于3-10ng/ml的人群，其前列腺穿刺活检的阴性率接近60％-70％。由于其特异性低，也造成了大量的过度诊断、过度治疗。且目前关于前列腺特异性抗原筛查能否降低前列腺癌患者的死亡率，还存在较大的争议。

启动子区域甲基化是人类恶性肿瘤中发现最多的表观学改变之一。目前，基因甲基化检测作为一种体外诊断方法，已经成为多种疾病早期诊断的有效工具。

mcam基因是编码黑色素瘤细胞粘附分子，在细胞粘附和血管组织细胞间连接处的内皮单层的内聚中发挥作用。

雌激素受体(er)属于核受体超家族的成员，与雌激素结合后，发生变构形成二聚体，然后与雌激素受体反应元件结合，调控靶基因的转录，从而调节雌激素促进细胞增生、分化和维持正常的生理功能，雌激素受体有两种亚型，包括erα和erβ。erα(esr1)基因是被发现的第一个雌激素受体，在生物体内广泛分布，具有重要的生理和病理意义(王强等，erα基因敲除小鼠的繁育及子代小鼠基因型的鉴定，华东地区第十一届实验动物科学学术交流会(山东.烟台，2010.09)论文集)。erβ(esr2)基因在多种癌组织中异常表达，其多态性可能会影响erβ在不同个体中的表达水平或功能，进而影响雌激素生物学作用的发挥。

技术实现要素：

现有技术中存在的技术问题是，目前前列腺癌的早期诊断主要依赖于前列腺特异性抗原和经直肠超声检查。前列腺特异性抗原特异性较低，从而导致前列腺穿刺活检结果阴性率较高，也使得重复穿刺数增加。尤其是前列腺特异性抗原水平介于3-10ng/ml的人群，其前列腺穿刺活检的阴性率接近60％-70％。由于其特异性低，也造成了大量的过度诊断、过度治疗。且目前关于前列腺特异性抗原筛查能否降低前列腺癌患者的死亡率，还存在较大的争议。

本实用新型为了解决上述技术问题，提供了一种前列腺癌早期诊断试剂盒。

具体来说，本实用新型提出了如下技术方案：

本实用新型提供了一种用于前列腺癌早期诊断的试剂盒，包含试剂盒本体1和盒盖2，所述试剂盒本体包含两个单元，分别为第一个单元(3)和第二个单元(4)，所述第一个单元3设有样本保存的试管盒5和含内参引物的试管盒6，所述第二个单元4设有含测序基因引物的试管盒8和含探针引物的试管盒9。

优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，所述第一个单元3中设有含亚硫酸氢钠溶液的试管盒10。

优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，所述第二个单元4设有pcr反应液的试管盒7。

优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，所述测序基因包含mcam基因、erα基因和erβ基因。

优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，所述试管上贴有标签，用于辨识试样品。

优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，所述盒盖2通过卡扣11与所述试剂盒本体1扣合。

本实用新型的有益效果包括：

1.本实用新型对mcam基因、erα基因和erβ基因启动子区域的甲基化进行检测，特异性和敏感度高，能实现对前列腺癌的早期精确诊断；

2.使用甲基化特异性定量pcr，以特异的引物及探针检测基因的cpg岛的胞嘧啶是否发生了甲基化，并对甲基化进行定量分析，能够快速，简单方便，在pcr反应之后不需要任何操作；

3.使用从患者的血液提取的样本进行检测，属于无创操作，患者依从性好，易于接受；

4.本实用新型采用所述的试剂盒，能够防止试剂污染，且使用方便快捷。

附图说明

图1是实施例1-1中的前列腺癌早期诊断试剂盒的示意图，其中，1-试剂盒本体，2-盒盖，3-第一个单元，4-第二个单元，5-样本保存的试管盒，6-含内参引物的试管盒，8-含测序基因引物的试管盒，9-含探针引物的试管盒，11-卡扣。

图2是实施例1-2中的前列腺癌早期诊断试剂盒的示意图，其中，1-试剂盒本体，2-盒盖，3-第一个单元，4-第二个单元，5-样本保存的试管盒，6-含内参引物的试管盒，7-pcr反应液的试管盒，8-含测序基因引物的试管盒，9-含探针引物的试管盒，10-含亚硫酸氢钠溶液的试管盒，11-卡扣。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的前列腺癌早期诊断试剂盒进行详细说明。

实施例1-1试剂盒

从图1可以看出，本实用新型的前列腺癌早期诊断试剂盒，包含试剂盒本体1和盒盖2，所述试剂盒本体1包含两个单元，所述第一个单元3设有样本保存的试管盒5和含内参引物的试管盒6，所述第二个单元4设有含测序基因引物的试管盒8和含探针引物的试管盒9，所述试管上贴有标签，用于辨识试样品，所述盒盖2通过卡扣11与所述试剂盒本体1扣合。

所述内参物为β-actin，所述β-actin的正向引物如seqidno：1所示，所述seqidno：1的序列为：tggtgatggaggaggtttagtaagt；所述β-actin的反向引物如seqidno：2所示，所述seqidno：2的序列为：aaccaataaaacctactcctcccttaa。

所述测序基因包含mcam、erα和erβ，所述mcam的正向引物如seqidno:3所示，所述seqidno：3的序列为：agaatttaggtcggtttttatcg；所述mcam的反向引物如seqidno:4所示，所述seqidno：4的序列为：acgcaaaattcttctcccaaaa；所述erα的正向引物如seqidno：5所示，所述seqidno：5的序列为：tagggagtag；所述erα的反向引物如seqidno：6所示，所述seqidno：6的序列为gccgacacgcgaactctaa；所述erβ的正向引物如seqidno：7所示，所述seqidno：7的序列为：ggcgttcgttttgggattg；所述erβ的反向引物如seqidno：8所示，所述seqidno：8的序列为gccgacacgcgaactctaa。

所述探针引物包含mcam、erα和erβ的探针引物，当测序基因为mcam基因时，其探针引物如seqidno：9所示，所述seqidno：9的序列为：acaatatcaaaccgacgacaacgac；当测序基因为erα基因时，其探针引物如seqidno：10所示，所述seqidno：10的序列为：cgataaaaccgaacgacccgacga；当测序基因为erβ基因时，其探针引物如seqidno：11所示，所述seqidno：11的序列为：accaccacccaacacacaataacaaacaca。

实施例1-2试剂盒

从图2可以看出，本实用新型的前列腺癌早期诊断试剂盒，包含试剂盒本体1和盒盖2，所述试剂盒本体1包含两个单元，所述第一个单元3依次设有样本保存的试管盒5、含内参引物的试管盒6和含亚硫酸氢钠的试管盒10；所述第二个单元4依次设有pcr反应液的试管盒7，含测序基因引物的试管盒8和含探针引物的试管盒9，所述试管上贴有标签，用于辨识试样品，所述盒盖2通过卡扣11与所述试剂盒本体1扣合。

所述内参物为β-actin，所述β-actin的正向引物如seqidno：1所示，所述seqidno：1的序列为：tggtgatggaggaggtttagtaagt；所述β-actin的反向引物如seqidno：2所示，所述seqidno：2的序列为：aaccaataaaacctactcctcccttaa。

所述测序基因包含mcam、erα和erβ，所述mcam的正向引物如seqidno:3所示，所述seqidno：3的序列为：agaatttaggtcggtttttatcg；所述mcam的反向引物如seqidno:4所示，所述seqidno：4的序列为：acgcaaaattcttctcccaaaa；所述erα的正向引物如seqidno：5所述，所述seqidno：5的序列为：tagggagtag；所述erα的反向引物如seqidno：6所述，所述seqidno：6的序列为gccgacacgcgaactctaa；所述erβ的正向引物如seqidno：7所述，所述seqidno：7的序列为：ggcgttcgttttgggattg；所述erβ的反向引物如seqidno：8所述，所述seqidno：8的序列为gccgacacgcgaactctaa。

所述探针引物包含mcam、erα和erβ的探针引物，当测序基因为mcam基因时，其探针引物如seqidno：9所示，所述seqidno：9的序列为：acaatatcaaaccgacgacaacgac；当测序基因为erα基因时，其探针引物如seqidno：10所示，所述seqidno：10的序列为：cgataaaaccgaacgacccgacga；当测序基因为erβ基因时，其探针引物如seqidno：11所示，所述seqidno：11的序列为：accaccacccaacacacaataacaaacaca。

所述pcr反应液包含pcr缓冲溶液、碱基、mgcl2(6.7mmmgcl2，北京全式金生物科技有限公司)、platinumtaq聚合酶及双蒸水(ddh2o，北京全式金生物科技有限公司)。

实施例2试剂盒的使用方法

为了使本实施例所提供的试剂盒更好地说明并便于解释本发明所获得的技术效果，现对前列腺癌早期诊断试剂盒的使用方法说明如下：

1)样本dna提取：采集患者血液样本，置于10ml离心管中，1000×g，4℃离心10min分离血清，-80℃下保存。然后从血清中提取dna，1ml血清中获得的dna，使用50ug/ml蛋白酶k(boehringermannheim，germany)消化，其中加入1％的sds，48℃消化3天。随后进行酚/氯仿抽提，最后用20ul的lot(包含2.5mmol/ledta，10mmol/ltris-hcl)溶解，-20℃保存待用。

其中，血清中提取dna的方法为：采用德国qiaampdnabloodminikit(cat.no.51104)，按照其血液和体液方案进行严格操作：向2ml离心管中加入40μl蛋白酶液，400μl血浆，400μl缓冲液al，56度水浴10min,加入400μl无水乙醇混匀后转移入qiaamp离心柱中6000×g离心1min，弃液，往柱中加入缓冲液aw1500μl，6000×g离心1min，再加入500μl缓冲液aw2洗涤20000×g离心3min，最后用50μlae洗脱dna。

2)亚硫酸氢盐处理

将步骤1)提取的dna使用亚硫酸氢钠处理，其是采用qiagen公司的试剂盒进行处理(catno.59104，qiageninc.valencia，ca)，目的在于将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，经亚硫酸氢钠处理的dna作为后续pcr的模板。

3)pcr扩增：以β-actin的扩增为对照，扩增仪为abi7500realtimepcr仪。

pcr反应体系为：

pcr扩增条件为：

95℃3min；

1)引物及探针序列如下表所示：

2)结果分析

pcr进行扩增后，采用序列检测系统(sds2.4；appliedbiosystems)进行分析。每个基因的甲基化的相对水平通过甲基化指数(pmr)进行指标量化。pmr为甲基化阳性的模板dna在其中所占的比例，其计算公式为：pmr＝2^{-(ct样本-ct内参)}×100％。

实施例3临床试验数据

采用实施例2所述的方法对46例患者进行测试，46例患者来自于天津市肿瘤医院，诊断结果如下：

p值是原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率，p值是统计学上常用到的一个数值，p值越小，差异越显著。

从上表可以看出，前列腺癌患者的甲基化水平较高，从而能够在早期对前列腺癌进行精确诊断。

综上所述，使用本实用新型所述的对前列腺癌早期诊断的试剂盒，采用对mcam基因、erα基因、erβ基因启动子区域的甲基化进行检测，特异性和敏感性高，能实现对前列腺癌的早期精准诊断；而且本实用新型所使用的甲基化特异性定量pcr，是以特异的引物及探针检测基因的cpg岛的胞嘧啶是否发生了甲基化，并对甲基化进行定量分析。能够快速，简单方便，在pcr反应之后并不需要任何操作。本实用新型使用患者的血液进行检测，属于无创操作，患者依从性好，易于接受。

以上所述仅为本实用新型较佳实施例，并不用于局限本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在实用新型的保护范围之内。