用于治疗转移性和化疗耐受性癌症的四氢喹啉衍生物
相关申请
本申请要求2018年7月31日提交的美国临时专利申请no.62/712,434的权益。以上专利申请的全部教导内容作为参考并入本文。
背景技术：
当前用于治疗侵袭性和/或化疗耐受性转移性癌症的疗法效力有限。因此，仍需要对于这些癌症的治疗具有改善的效力的治疗剂。
技术实现要素：
本文提供了用于治疗对其有需要的受试者中的癌症的化合物、组合物和方法，例如，该癌症为转移性癌症(例如，转移性乳腺癌，如基底细胞样乳腺癌、her-2阳性乳腺癌)、化疗耐受性癌症(例如，耐受紫杉醇(paclitaxel)和/或多柔比星(doxorubicin)的癌症)。
一种实施方式是结构式ii的化合物：
或其药用盐，其中变量(例如，r1、r2、r3、r4、r5、r9、l、n)的值如本文所述。
另一种实施方式是治疗对其有需要的受试者中的转移性或化疗耐受性癌症的方法，其包括向该受试者施用结构式i的化合物：
或其药用盐，其中变量(例如，r1、r2、r3、r4、r5、r9、l、x1、x2、x3、x4、x5)的值如本文所述。还提供了用于在转移性或化疗耐受性癌症的治疗中使用的化合物，其中该化合物由结构式i表示，或其药用盐。还提供了结构式i的化合物或其药用盐用于制备用于治疗转移性或化疗耐受性癌症的药剂的用途。
另一种实施方式是抑制转移性或化疗耐受性癌细胞增殖的方法，其包括向细胞施用有效量的结构式i的化合物或其药用盐。还提供了用于抑制转移性或化疗耐受性癌细胞增殖的化合物，其中该化合物由结构式i表示，或其药用盐。还提供了结构式i的化合物或其药用盐用于制备用于抑制转移性或化疗耐受性癌细胞增殖的药剂的用途。
另一种实施方式是治疗对其有需要的受试者中的2型糖尿病的方法，其包括向受试者施用结构式i的化合物或其药用盐。还提供了用于在2型糖尿病的治疗中使用的化合物，其中该化合物由结构式i表示，或其药用盐。还提供了结构式i的化合物或其药用盐用于制备用于治疗2型糖尿病的药剂的用途。
本文所述的化合物、组合物和方法可以用于抑制对于转移和/或化疗耐受性重要且在多种肿瘤类型中广泛表达的酶催化靶标(aldh1a3)。本文所述的多种化合物对aldh1a3具有低纳摩尔亲合力，并且化合物mbe1已在小鼠中显示使转移性病变缩小且无毒性。
附图说明
本专利或专利申请包含至少一副彩色附图。通过请求和支付必要的费用，专利局将提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开的拷贝。
根据以下对实例实施方式更具体的描述，上述内容将是显而易见的。
图1a是在存在本文所述的各种化合物的情况下，aldefluortm-阳性细胞的百分比的柱状图，并且其显示了在使用本文所述的标准aldefluortm规程，以100纳摩尔浓度的化合物培育后，如通过流式细胞术所检测的高于背景荧光水平的sum159-m1a-aldh1a3细胞的百分比。使用1毫摩尔n,n-二乙基氨基苯甲醛(deab)作为阴性对照，对背景荧光进行设门(gating)。
图1b是在存在不同浓度的mbe1或mbe1.5的情况下，aldefluortm-阳性细胞的百分比的折线图，并且其显示了在与mbe1或mbe1-5的剂量滴定组合的根据本文所述的标准aldefluortm规程培育之后，如通过流式细胞术所检测的高于背景荧光水平的sum159-m1a-aldh1a3细胞的百分比。将[inh-min]阈值设置为对照样品的两个标准偏差的下限，而将ic50阈值设置为对照样品平均值的50％。
图1c是在存在不同浓度的mbe1或mbe1.5的情况下，高aldh百分比的折线图，并且其显示了在与mbe1或mbe1.5的剂量滴定组合的根据本文所述的标准aldefluortm规程培育之后，如通过流式细胞术所检测的处于高荧光水平的sum159-m1a-aldh1a3细胞的百分比。在10纳摩尔的mbe1.5浓度，将高活性设门在第99细胞百分位。将[inh-min]阈值设置为对照样品的两个标准偏差的下限。
图2a是使用人aldh1a1、aldh1a3或aldh3a1稳定转导并通过与dmso或处于所列浓度的mbe1组合的流式细胞术使用aldefluortm规程分析的mcf7细胞的柱状图，并且其显示了dmso或mbe1对通过每种酶所诱导的aldefluortm活性的影响。
图2b是使用人aldh1a2或aldh1a3瞬时转染并通过与dmso或处于所列浓度的mbe1.5组合的流式细胞术使用aldefluortm规程分析的293t细胞的柱状图，并且其显示了dmso或mbe1.5对通过每种酶所诱导的aldefluortm活性的影响。
图3a是在存在deab或mbe1的情况下，在多种癌症类型中的aldefluortm-阳性细胞的柱状图，并且其显示除了m1a(乳腺)和mda-468(乳腺)外，在多种癌症类型中也观察到了aldh1a3活性，并且在多种癌症类型中通过mbe1抑制所述aldh1a3活性。
图3b是在存在1mmdeab(一种pan-aldh抑制剂)或100nmmbe1.5(特异性aldh1a3抑制剂)的情况下，在多种癌症类型中的aldefluortm活性的柱状图，并且其显示了显示aldh1a3活性的大部分人癌细胞系。
图4a是流式细胞谱图，并且其显示cd45-阳性骨髓细胞是aldefluortm-阳性的，但是不受mbe1.5的影响。
图4b是流式细胞谱图，并且其显示cd11c-阳性骨髓细胞是aldefluortm-阳性的，但是不受mbe1.5的影响。
图5a是用于向通过静脉内尾静脉注射，用m1a-aldh1a3细胞注射的小鼠施用mbe1和紫杉醇的剂量施用策略的图，并且其显示了设计以测试mbe1在治疗转移性癌症中的效力的体内实验的设计。
图5b是相对于时间(天)的肺转移的折线图，如使用生物发光成像(bli)所测量的，并且在来自图5a中所列实验的小鼠中比较了在存在和不存在mbe1的情况下的肺转移。学生t检验，双侧(双尾，two-tailed)，假定不等方差。
图6a是用于向通过心内注射，用m1a-aldh1a3细胞注射的小鼠施用mbe1和紫杉醇的剂量施用策略的图，并且其显示了设计以测试mbe1在治疗转移性癌症中的效力的体内实验的设计。
图6b是相对于时间(天)的骨转移的折线图，如使用bli所测量的，并且在来自图6a中所列实验的小鼠中比较了在存在和不存在mbe1的情况下的骨转移。学生t检验，单侧，假定不等方差。
图7a是流式细胞谱图，并且其显示与对照mda-mb-468细胞(最左侧谱图)相比，mda-mb-468乳腺癌细胞中aldh1a3(中间和最右侧谱图)的基因敲除显著降低了aldefluortm活性。
图7b是肿瘤体积(mm3)相对于时间(天)的折线图，并且其显示mda-mb-468乳腺癌细胞中aldh1a3的基因敲除减缓了原发肿瘤生长并且使肿瘤对紫杉醇敏感。
图7c是肿瘤质量(g)相对于基因敲除的柱状图，并且其显示mda-mb-468乳腺癌细胞中aldh1a3的基因敲除减缓了原发肿瘤生长并且使肿瘤对紫杉醇敏感。
图8a是生物发光(ph/s)相对于时间(天)的折线图，并且其显示在注射了用编码三种aldh酶aldh1a1、aldh1a3和aldh3a1的载体转导的sum159-m1b细胞的小鼠中肺转移的发生。
图8b是在图8a中所述的实验终点离体计数的肺结节的图。学生t检验，双侧，假定不等方差。
图9a是流式细胞谱图，并且其显示sum159-m1a乳腺癌细胞中aldh1a3的基因敲除几乎消除了该细胞中的aldefluortm活性并且可以通过用挽回载体(rescuevector)转导该细胞来挽回aldefluortm活性。
图9b是相对于时间(天)的骨转移的折线图，如通过生物发光(ph/s)所测量的，并且其显示sum159-m1a乳腺癌细胞中aldh1a3的敲除减缓了骨转移生长。
图9c是无骨转移存活随时间的kaplan-meier图，并且其显示sum159-m1a乳腺癌细胞中aldh1a3的敲除显著提高了存活时间。
图10a是基于通过kmplot.com托管的数据分析工具，通过高(红色)和低(黑色)aldh1a3表达所划分的患者存活曲线，并且其显示肾脏透明细胞癌患者的无远端转移存活与aldh1a3表达水平有关。
图10b是基于通过kmplot.com托管的数据分析工具，通过高(红色)和低(黑色)aldh1a3表达所划分的患者存活曲线，并且其显示三阴乳腺癌患者的整体存活与aldh1a3表达水平有关。
图10c是基于通过kmplot.com托管的数据分析工具，通过高(红色)和低(黑色)aldh1a3表达所划分的患者存活曲线，并且其显示胃癌患者的整体存活与aldh1a3表达水平有关。
图10d是基于通过kmplot.com托管的数据分析工具，通过高(红色)和低(黑色)aldh1a3表达所划分的患者存活曲线，并且其显示膀胱癌患者的整体存活与aldh1a3表达水平有关。
图10e是基于通过kmplot.com托管的数据分析工具，通过高(红色)和低(黑色)aldh1a3表达所划分的患者存活曲线，并且其显示卵巢癌患者的整体存活与aldh1a3表达水平有关。
图10f是基于通过kmplot.com托管的数据分析工具，通过高(红色)和低(黑色)aldh1a3表达所划分的患者存活曲线，并且其显示肺鳞癌患者的整体存活与aldh1a3表达水平有关。
图10g是基于来自癌症基因组图谱(cancergenomeatlas)的存活时间系列数据和患者水平rna表达数据，通过高(红色)和低(蓝色)aldh1a3表达所划分的患者存活曲线，并且其显示结肠直肠癌患者的整体存活与aldh1a3表达水平有关。
图10h是基于来自癌症基因组图谱(cancergenomeatlas)的存活时间系列数据和患者水平rna表达数据，通过高(红色)和低(蓝色)aldh1a3表达所划分的患者存活曲线，并且其显示低级别胶质瘤患者的整体存活与aldh1a3表达水平有关。
图11a是来自metabric临床乳腺癌数据组的aldh1a3的mrna表达图，并且其显示了乳腺癌亚型的aldh1a3表达和化疗史。
图11b是基于erasmusmedicalcenter-memorialsloan-kettering(emc-msk)的数据组的一组存活曲线，并且其显示了按亚型的乳腺癌患者的存活时间和通过中值aldh1a3表达水平的划分。
图12是aldefluortm活性相对于浓度的图，并且其显示了在10nm和100nm的浓度下本文所述的几种化合物的aldefluortm活性。
图13a是western印迹，并且其显示了多种aldh同工型，包含1a1、1a2、1a3和3a1在mcf7和sum159细胞中的表达。
图13b是表达所指明的aldh同工型的aldefluortm-阳性mcf7细胞的百分比相对于mbe1.5浓度的对数的图，并且其显示在低于10μm的浓度，mbe1.5特异性抑制aldh1a3。
图13c是表达所指明的aldh同工型的aldefluortm-阳性sum159细胞的百分比相对于mbe1.5浓度的对数的图，并且其显示在低于10μm的浓度，mbe1.5特异性抑制aldh1a3。
图14是如通过生物发光成像(bli)所测量的肺转移相对于时间(天)的折线图，并且其显示在小鼠异种移植模型中，在第17、19和21天施用的3剂量的与25mg/kg紫杉醇组合的50mg/kgmbe1.5引起所确立的转移性疾病的消退。学生t检验，双侧，假定不等方差。
图15a是体重(g)相对于时间(天)的折线图，并且其显示在该实验中不存在与mbe1.5治疗有关的总毒性。
图15b是肿瘤体积(mm3)相对于时间(天)的折线图，并且其显示用mbe1.5的12天治疗引起mda-mb-468原发性乳腺肿瘤消退。通过学生t检验进行统计。*p<0.05。
图16a是肺转移生物发光相对于时间(天)的折线图，并且其显示用mbe1.5或载体(媒介物，vehicle)治疗前后肺转移的发展。通过学生t检验进行统计。*p<0.05。
图16b是作为处理组的函数，小鼠存活随时间的kaplan-meier图，并且其显示用mbe1.5的12天治疗在具有晚期确立的乳腺癌肺转移的小鼠中的延长存活。通过cox成比例危险模型统计。
具体实施方式
该化合物、组合物和方法部分基于以下发现：醛脱氢酶(aldh、aldh)并且具体地aldh同工型1a3(aldh1a3)涉及多种癌症类型以及其它aldh1a3介导的疾病和病症，如2型糖尿病。因此，本文所提供的化合物、组合物和方法涉及调节(例如，抑制)aldh，例如，aldh1a3。
以下描述了实例实施方式。
定义
本文所述的化合物包含常规描述的那些，并且通过本文所公开的种类、亚类和种类进一步说明。除非另外说明，否则如本文所使用的，以下定义应适用。出于本发明的目的，根据元素周期表，cas版，handbookofchemistryandphysics,75thed.表示化学元素。另外，在以下文献中描述了有机化学的一般原理：“organicchemistry”,thomassorrell,universitysciencebooks,sausalito:1999和“march’sadvancedorganicchemistry”,5thed.,ed.:smith,m.b.和march,j.,johnwiley&sons,newyork:2001，这些文献的全部内容作为参考并入本文。
除非在本说明书中另外指明，否则在本说明书中使用的命名一般遵循nomenclatureoforganicchemistry,sectionsa,b,c,d,e,f和h,pergamonpress,oxford,1979中所述的实例和规则，该参考文献对于其化学结构名称和化学结构命名规则作为参考并入本文。任选地，可以使用化学命名程序(例如，
本发明的化合物可以具有不对称中心、手性轴和手性面(例如，如在e.l.eliel和s.h.wilen,stereo-chemistryofcarboncompounds,johnwiley&sons,newyork,1994,1119-1190页中所述)，并且作为外消旋物、外消旋混合物以及作为单个非对映体或对映异构体存在，所有可能的异构体及其混合物，包括光学异构体包含在本发明中。
“烷基”是指具有指定碳原子个数的饱和脂族支链或直链一价烃基。因此，“(c1-c3)烷基”表示以直链或支链布置具有1-3个碳原子的基团。烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基等。“(c1-c3)烷基”包括甲基、乙基、丙基和异丙基。
“氨基”表示-nh2。
“烷基氨基”表示(烷基)(h)-n-，其中所述烷基如本文所述。在一个方面，烷基氨基是(c1-c3)烷基氨基。具体的烷基氨基包括甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基和异丙基氨基。
“二烷基氨基”表示(烷基)2-n-，其中所述烷基如本文所述，其可以是相同或不同的。具体的二烷基氨基是((c1-c3)烷基)2-n-，其中所述烷基可以是相同或不同的。二烷基氨基包括二甲基氨基、二乙基氨基和甲基乙基氨基。
“卤素”和“卤代”在本文中是可互换使用的并且分别表示氟、氯、溴或碘。在一些实施方式中，卤素选自氟(氟代，fluoro)或氯(氯代，chloro)。
“氯代”表示-cl。
“氟代”表示-f。
“氰基”表示-cn。
“硝基”表示-no2。
“羟基”表示-oh。
“巯基”表示-sh。
“烷氧基”是指通过氧连接原子所连接的烷基，其中“烷基”如本文所述。“(c1-c6)烷氧基”包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基。
“硫代烷氧基”是指通过硫连接原子所连接的烷基，其中“烷基”如本文所述。
“卤代烷基”包括单、多和全卤代烷基，其中每个卤素独立地选自氟、氯和溴，并且烷基如本文所述。在一个方面，卤代烷基是全卤代烷基(例如，全氟烷基)。卤代烷基包括三氟甲基和五氟乙基。
“卤代烷氧基”是指通过氧连接原子所连接的卤代烷基，其中“卤代烷基”如本文所述。
应理解本领域的技术人员可以选择本发明的化合物上的取代基以提供化学稳定的且可以通过本领域中已知的技术以及以下所述的那些方法容易地合成的化合物。本发明设想的取代基(例如，r1-r9、m、n、l、x1-x5)的组合优选地为导致稳定或化学可行的化合物的形成的那些。如本文所使用的术语“稳定的”是指当处于允许其产生、检测并且在某些实施方式中，其回收、纯化和用于本文所公开的一个或多个目的的使用的条件时，未显著改变的化合物。
如本文所使用的，术语“药用盐”表示在合理医学判断范围内适合于与人和低等动物的组织接触的使用而无过度毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。药用盐在本领域中是熟知的。例如，s.m.berge等人在j.pharmaceuticalsciences,1977,66,1-19中详细描述了药用盐，该文献的相关教导内容以其全部内容作为参考并入本文。本文所述的化合物的药用盐包括衍生自与受试者的治疗相容的适合的无机和有机酸和碱的盐。
药用无毒酸加成盐的实例是与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，或者与有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或者通过使用本领域中使用的其它方法如离子交换所形成的氨基盐。其他药用酸加成盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊基丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基磺酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、p-甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。
在一些实施方式中，形成适合的盐的示例性无机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及酸性金属盐，如正磷酸氢二钠和硫酸氢钾。形成适合的盐的示例性有机酸包括单-、二-和三羧酸。例如，这些酸的示例为乙酸、乙醇酸、乳酸、焦葡萄酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、p-甲苯磺酸及其它磺酸，如甲磺酸和2-羟乙基磺酸。可以形成单-或二-酸盐，并且这些盐可以作为水合、溶剂化或基本无水的形式存在。通常，这些化合物的酸加成盐更可溶于水和多种亲水性有机溶剂，并且一般地显示出比它们的游离碱形式更高的熔点。
在一些实施方式中，最适合地由药用酸形成酸加成盐，并且例如，其包括与无机酸如盐酸、硫酸或磷酸和有机酸如琥珀酸、马来酸、乙酸或延胡索酸形成的那些。
形成适合的盐的示例性无机碱包括但不限于氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡。形成适合的盐的示例性有机碱包括脂族、脂环族或芳族有机胺，如甲胺、三甲胺和甲基吡啶或氨。适当的盐的选择标准将是本领域技术人员已知的。
衍生自适当的碱的盐包括碱金属、碱土金属、铵和n+((c1-c4)烷基)4盐。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。当适当时，其它药用盐包括使用反离子，如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根所形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。
另外，除非另作说明，否则本文所示的结构还表示包括仅在存在一种或多种同位素富集原子的情况下不同的化合物。例如，通过用氘或氚替换氢或者用13c-或14c-富集的碳替换碳所产生的化合物在本发明的范围内。例如，这些化合物作为分析工具、作为生物测定中的探针或者作为根据本发明的治疗剂是有用的。
当介绍本文所公开的要素时，冠词“一”、“一种”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含”、“具有”和“包括”旨在是开放的并且表示可以存在除所列要素外的其它要素。
化合物
第一实施方式是结构式i所示的化合物：
或其药用盐，其中：
r1和r5各自独立地为氢或(c1-c6)烷基；
r2、r3和r4各自独立地为氢、卤素、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、(c1-c3)硫代烷氧基、卤代(c1-c3)烷氧基、氨基、(c1-c3)烷基氨基、(c1-c3)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基；
l是-c(o)-、-c(r6)(r7)-、-c(ch2ch2)-、-c(och2)-或-c(n(h)ch2)-；
r6和r7各自独立地为氢、羟基、巯基、卤素、(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、(c1-c3)硫代烷氧基或卤代(c1-c3)烷氧基；
x1、x2、x3、x4和x5各自独立地为-c(r8)-或-n-；和
每个r8独立地为氢、卤素、卤代(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)硫代烷氧基、卤代(c1-c6)烷氧基、氨基、(c1-c6)烷基氨基、(c1-c6)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基。
在第一实施方式的第一方面，该化合物不是mbe1、mbe2、mbe3.1、mbe3.2、mbe3.3、mbe3.4、mbe3.5或mbe3.6，或任何上述化合物的药用盐。变量值如第一实施方式中所述。
在第一实施方式的第二方面，r2和r4分别为氢。其余变量值如第一实施方式或其第一方面中所述。
在第一实施方式的第三方面，r1是氢。其余变量值如第一实施方式或其第一或第二方面中所述。
在第一实施方式的第四方面，r5为氢。其余变量值如第一实施方式或其第一至第三方面中所述。
在第一实施方式的第五方面中，r3是氢或卤素(例如，卤素)。其余变量值如第一实施方式或其第一至第四方面中所述。
在第一实施方式的第六方面中，r3是卤素(例如，氟)。其余变量值如第一实施方式或其第一至第五方面中所述。
在第一实施方式的第七方面，l为-c(o)-或-c(r6)(r7)-。其余变量值如第一实施方式或其第一至第六方面中所述。
在第一实施方式的第八方面，l为-c(o)-。其余变量值如第一实施方式或其第一至第七方面中所述。
在第一实施方式的第九方面，l为-ch2-。其余变量值如第一实施方式或其第一至第八方面中所述。
在第一实施方式的第十方面，x1、x2、x3、x4和x5之一为-n-。其余变量值如第一实施方式或其第一至第九方面中所述。
在第一实施方式的第十一方面，x3为-n-；并且x1、x2、x4和x5各自独立地为-c(r8)-。其余变量值如第一实施方式或其第一至第十方面中所述。
在第一实施方式的第十二方面，每个r8独立地为氢、卤素、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、(c1-c3)硫代烷氧基、卤代(c1-c3)烷氧基、氨基、(c1-c3)烷基氨基、(c1-c3)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基。其余变量值如第一实施方式或其第一至第十一方面中所述。
在第一实施方式的第十三方面，每个r8独立地为氢、卤素或(c1-c6)烷基(例如，氢或(c1-c6)烷基)。其余变量值如第一实施方式或其第一至第十二方面中所述。
在第一实施方式的第十四方面，r6和r7各自独立地为氢、羟基、卤素、(c1-c3)烷基或(c1-c3)烷氧基，例如，r6和r7各自独立地为氢、羟基或卤素，例如，r6和r7分别为氢。其余变量值如第一实施方式或其第一至第十三方面中所述。
结构式i所示的化合物包括mbe1、mbe1.2、mbe1.3、mbe1.5、mbe1.6、mbe2、mbe3.1、mbe3.2、mbe3.3、mbe3.4、mbe3.5和mbe3.6，或者任何上述化合物的药用盐。结构式i所示的化合物还包括mbe1.5a、mbe1.5b、mbe1.5c和mbe1.5d或上述化合物的药用盐。
在第二实施方式中，该化合物是由结构式ii表示的化合物：
或其药用盐，其中：
r1和r5各自独立地为氢或(c1-c6)烷基；
r2和r4各自独立地为氢、卤素、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、(c1-c3)硫代烷氧基、卤代(c1-c3)烷氧基、氨基、(c1-c3)烷基氨基、(c1-c3)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基；
r3为卤素、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、(c1-c3)硫代烷氧基、卤代(c1-c3)烷氧基、氨基、(c1-c3)烷基氨基、(c1-c3)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基；
l是-c(o)-、-c(r6)(r7)-、-c(ch2ch2)-、-c(och2)-或-c(n(h)ch2)-；
r6和r7各自独立地为氢、羟基、巯基、卤素、(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、(c1-c3)硫代烷氧基或卤代(c1-c3)烷氧基；
每个r9独立地为卤素、卤代(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)硫代烷氧基、卤代(c1-c6)烷氧基、氨基、(c1-c6)烷基氨基、(c1-c6)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基；和
n是0、1、2、3、4、或5。变量的替代值如第一实施方式或其任何方面中所述。
在第二实施方式的第一方面，每个r9独立地为卤素、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、(c1-c3)硫代烷氧基、卤代(c1-c3)烷氧基、氨基、(c1-c3)烷基氨基、(c1-c3)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基。其余变量值如第一实施方式或其任何方面或第二实施方式中所述。
在第二实施方式的第二方面，每个r9独立地为卤素或(c1-c6)烷基(例如，卤素或(c1-c3)烷基)。其余变量值如第一实施方式或其任何方面或第二实施方式或其第一方面中所述。
在第二实施方式的第三方面，n是0、1或2(例如，n是0、n是1或n是2)。其余变量值如第一实施方式或其任何方面或第二实施方式或其第一或第二方面中所述。
在第二实施方式的第四方面，每个r9独立地为(c1-c6)烷基。其余变量值如第一实施方式或其任何方面或第二实施方式或其第一至第三方面中所述。
在第二实施方式的第五方面，n是1或2(例如，1)。其余变量值如第一实施方式或其任何方面或第二实施方式或其第一至第四方面中所述。
结构式ii所示的化合物包括mbe1.5或其药用盐。结构式ii所示的化合物还包括mbe1.5a、mbe1.5b、mbe1.5c和mbe1.5d或上述化合物的药用盐。
第三实施方式是结构式iii所示的化合物：
或其药用盐，其中变量值如第一或第二实施方式或上述任何方面中所述。
第四实施方式是结构式iv所示的化合物：
或其药用盐，其中：
每个r9独立地为卤素、卤代(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)硫代烷氧基、卤代(c1-c6)烷氧基、氨基、(c1-c6)烷基氨基、(c1-c6)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基；和
m是0、1、2、3或4。变量r9的替代值或其余变量的值如第一或第二实施方式或上述任何方面中所述。
在第四实施方式的第一方面，x3为-c(r8)-。其余变量的值如第一或第二实施方式或上述任何方面或第四实施方式中所述。
在第四实施方式的第二方面，x3为-n-。其余变量的值如第一或第二实施方式或上述任何方面或第四实施方式或其第一方面中所述。
在第四实施方式的第三方面，m为0、1或2。其余变量的值如第一或第二实施方式或上述任何方面或第四实施方式或其第一或第二方面中所述。
在第四实施方式的第四方面，r3为卤素、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、(c1-c3)硫代烷氧基、卤代(c1-c3)烷氧基、氨基、(c1-c3)烷基氨基、(c1-c3)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基。其余变量的值如第一或第二实施方式或上述任何方面或第四实施方式或其第一至第三方面中所述。
在第四实施方式的第五方面，该化合物不是mbe1或mbe3.6或者上述化合物的药用盐。其余变量的值如第一或第二实施方式或上述任何方面或第四实施方式或其第一至第四方面中所述。
第五实施方式是结构式v所示的化合物：
或其药用盐。变量值如第一、第二或第四实施方式或上述任何方面中所述。
结构式v所示的化合物包括mbe1.2、mbe1.3和mbe1.6，或者上述化合物的药用盐。
第六实施方式是结构式vi所示的化合物：
或其药用盐，其中r8'是氢、卤素、卤代(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)硫代烷氧基、卤代(c1-c6)烷氧基、氨基、(c1-c6)烷基氨基、(c1-c6)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基(例如，氢或(c1-c6)烷基)。其余变量值如第一、第二或第四实施方式或上述任何方面中所述。
在第六实施方式的第一方面，r8为(c1-c6)烷基。其余变量值如第一、第二或第四实施方式或上述任何方面或第六实施方式中所述。
第七实施方式是结构式vii所示的化合物：
或其药用盐，其中r8'是氢、卤素、卤代(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)硫代烷氧基、卤代(c1-c6)烷氧基、氨基、(c1-c6)烷基氨基、(c1-c6)二烷基氨基、氰基、硝基、羟基或巯基(例如，氢或(c1-c6)烷基)。其余变量值如第一、第二、第四或第六实施方式或上述任何方面中所述。
组合物和试剂盒
本文提供了包含抑制aldh1a3的试剂(例如，结构式i-v中任一项所示的化合物或者上述化合物的药用盐)和药用载体或赋形剂的组合物(例如，药用组合物)。在某些实施方式中，将本发明的组合物配制用于向需要所述组合物的受试者(例如，患者)施用。在一些实施方式中，将本发明的组合物配制用于向对其有需要的受试者口服、静脉内、皮下、腹膜内或皮肤施用。
短语“药用载体或赋形剂”是指不破坏与之一起配制的试剂的药理学活性并且当以足以递送治疗量的所述试剂的剂量施用时无毒的无毒载体或赋形剂。可以在本发明所述的组合物中使用的药用载体或赋形剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素类(基于纤维素的，cellulose-based)物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
可以口服、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻部、口腔、阴道或通过植入药盒(implantedreservoir)施用本文所述的组合物。在一些实施方式中，所提供的化合物或组合物是静脉内和/或腹膜内可施用的。
如本文所使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、眼内、玻璃体内、关节内、动脉内、滑液内、胸骨内、鞘内、病灶内、肝内、腹膜内病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，口服、皮下、腹膜内或静脉内施用该组合物。
可以以任何口服可接受的剂型口服施用本文提供的组合物，该剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、水混悬剂、分散剂和溶液剂。在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，如硬脂酸镁。就胶囊剂形式的口服施用而言，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水混悬液和/或乳液用于口服使用时，可以将活性成分混悬或溶解于油相中并与乳化和/或助悬剂混合。如果需要，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
在一些实施方式中，将口服制剂配制用于立即释放或缓释/延迟释放。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉末剂(散剂，powders)和颗粒剂。在这些固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性、药用赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸氢二钙和/或以下各项混合：(a)填充剂(填料，fillers)或补充剂(增量剂，extenders)，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；(b)粘结剂，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)稀释剂，如甘油；(d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(e)溶液缓凝剂(solutionretardingagents)，如石蜡；(f)吸收加速剂，如季铵盐；(g)润湿剂，如乙酰基醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸收剂，如高岭土(白陶土，kaolin)和膨润土；和(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。就胶囊剂、片剂和丸剂而言，剂型还可以包含缓冲剂。
适合于口腔或舌下施用的组合物包括片剂、锭剂(lozenges)和糖锭(pastilles)，其中将活性成分与载体如糖和阿拉伯胶、黄芪胶或明胶和甘油一起配制。
类似类型的固体组合物还可以在使用赋形剂如乳糖(lactose)或奶糖(乳糖，milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的软和硬填充明胶胶囊中用作填充剂。可以将片剂、糖丸剂(dragees)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型与涂层和外壳如肠溶衣及药物配制领域中熟知的其它涂层一起制备。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是它们仅或优先在肠道的某些部分，任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
试剂还可以处于用如上所述的一种或多种赋形剂微包封的形式。在这些固体剂型中，该试剂可以与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。如正常实践中一样，这些剂型还可以包含惰性稀释剂以外的其它物质，例如，压片润滑剂及其它压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。
用于口服施用的组合物可以设计以保护活性成分在通过消化道时抵抗降解，例如，通过制剂在片剂或胶囊剂上的外涂层。
在另一个实施方式中，可以以延长(或“延迟”或“缓释”)释放组合物提供试剂。这种延迟释放组合物包含与延迟释放组分组合的试剂。这种组合物使得所提供的试剂能够靶向释放至下胃肠道，例如，小肠、大肠、结肠和/或直肠。在某些实施方式中，延迟释放组合物还包含肠或ph依赖性涂层，如邻苯二甲酸醋酸纤维素及其它邻苯二甲酸酯(例如，聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯,甲基丙烯酸酯(eudragits))。作为另外一种选择，延迟释放组合物通过提供ph敏感性甲基丙烯酸酯涂层、ph敏感性聚合物微球或通过水解经历降解的聚合物向小肠和/或结肠提供控制释放。延迟释放组合物可以与疏水性或胶凝赋形剂或涂层一起配制。还可以通过以下方式提供结肠递送：通过细菌酶类水解的涂层，如直链淀粉或果胶，通过ph依赖性聚合物，通过随时间膨胀的水凝胶塞(pulsincap)，通过时间依赖性水凝胶涂层和/或通过与偶氮芳香族键涂层连接的丙烯酸。
还可以以用于直肠施用的栓剂施用本文所述的组合物。这些可以如下制备：将试剂与适合的无刺激性的赋形剂混合，该赋形剂在室温下是固体，但是在直肠温度下是液体并因此将在直肠中融化以释放药物。这些材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
还可以将本文所述的组合物局部施用，特别是当治疗目标包括通过局部施用易接近的区域或器官时，包括眼部、皮肤或下肠道疾病。针对这些区域或器官中的每一种，容易地制备适合的局部制剂。
用于下肠道的局部施用可以在直肠栓剂制剂(参见上文)中或在适合的灌肠溶药剂制剂中实现。还可以使用局部透皮贴剂。
对于其它局部施用，可以在适合的软膏剂中配制组合物，该软膏剂含有混悬或溶解于一种或多种载体中的活性组分。用于试剂的局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体矿脂、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水和渗透增强剂。作为另外一种选择，可以在适合的洗剂或乳膏剂中配制组合物，该洗剂或乳膏剂含有混悬或溶解于一种或多种药用载体中的活性组分。作为另外一种选择，可以与适合的洗剂或乳膏剂一起配制组合物，该洗剂或乳膏剂含有混悬或溶解于具有适合的乳化剂的载体中的活性化合物。在一些实施方式中，适合的载体包括但不限于矿物油、单硬脂酸山梨聚糖酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。在其它实施方式中，适合的载体但不限于矿物油、单硬脂酸山梨聚糖酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水和渗透增强剂。
对于眼科应用，可以将组合物配制为在等渗、ph调节的无菌盐水中的微粒化悬浮液，或者优选地，配制为在等渗、ph调节的无菌盐水中的溶液，含有或不含防腐剂如苯扎氯铵。作为另外一种选择，对于眼科应用，可以在软膏剂如矿脂(石蜡油，petrolatum)中配制组合物。
还可以通过鼻部气溶胶或吸入来施用组合物。根据药物制剂领域熟知的技术制备这些组合物，并且可以使用苯甲醇或其它适合的防腐剂、吸收促进剂(以提高生物利用度)、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂制备为盐水中的溶液。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的组合物的试剂的量将随治疗宿主、具体施用形式以及所使用的试剂活性而变化。优选地，应配制组合物，从而使得可以向接受组合物的受试者施用约0.01mg/kg至约100mg/kg体重/天的试剂剂量。
还应理解针对任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，其包括所使用的具体试剂的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合、治疗医师的判断以及正在治疗的特定疾病的严重程度。组合物中的试剂的量还将取决于组合物中具体的试剂。
可以在本发明的组合物中使用的其它药用载体、佐剂和载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(sedds)如d-α-维生素e聚乙二醇1000琥珀酸酯、在药物剂型中使用的表面活性剂如吐温或其它类似的聚合物递送基质、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素类物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。也可以有利地使用环糊精，如α-、β-和γ-环糊精，或者化学修饰的衍生物，如羟烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-β-环糊精，或者其它溶解的衍生物以提高本文所述的试剂的递送。
组合物可以处于无菌可注射制剂形式，例如，作为无菌可注射水性或油性混悬液。可以根据本领域已知的技术，使用适合的分散剂或润湿剂(例如，吐温80)和助悬剂(suspendingagents)配制这种混悬液。无菌可注射制剂还可以是处于无毒胃肠外可用的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可用的载体和溶剂是甘露糖醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常用作溶剂或混悬介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸(如油酸和它的甘油酯衍生物)在制备注射剂中是有用的，天然药用油(如橄榄油或蓖麻油)也是如此，特别是其聚氧乙基化形式。这些油性溶液或混悬液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂或者羧甲基纤维素或在药用剂型的制剂，如乳液和/或混悬液中常用的类似分散剂。其它常用的表面活性剂如吐温或span和/或在药用固体、液体或其它剂型的生产中常用的其它类似的乳化剂或生物利用度增强剂也可以用于制剂的目的。
在一些实施方式中，包含抑制aldh1a3的试剂(例如，结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐)的组合物还可以包含一种或多种其它治疗剂(例如，化疗剂，例如，紫杉醇、多柔比星、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬(tamoxifen)、奥曲肽)。当本发明的组合物包含抑制aldh1a3的试剂和一种或多种其它治疗剂的组合时，该试剂应以通常在单一疗法方案中施用的剂量的约1至100％，并且更优选地约5％至约95％的剂量水平存在。可以与抑制aldh1a3的试剂分开、作为多剂量方案的一部分施用其它试剂。作为另外一种选择，其它试剂可以是在单一组合物中与抑制aldh1a3的试剂混合在一起的单一剂型的一部分。
例如，可以通过静脉内、动脉内、眼内、玻璃体内、真皮下、口服、口腔、鼻部、经粘膜、局部注射、在眼科制剂中注射或者通过吸入以约0.5mg/kg至约100mg/kg体重的剂量范围，或者作为另外一种选择，以约1mg/剂量至约1000mg/剂量的剂量范围每4至120小时，或者根据特定药物的要求施用本文的组合物。通常，每天将施用约1至约6次组合物，或者作为另外一种选择，将作为连续输注施用组合物。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将基于所治疗的宿主和特定施用形式而改变。典型的制剂将含有约5％至约95％的活性化合物(w/w)。作为另外一种选择，制剂可以含有约20％至约80％的活性化合物(w/w)。
可能需要低于或高于以上列举那些的剂量。针对任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，其包括所使用的具体试剂的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合、疾病、病况或症状的严重程度和进程、患者对疾病、病况或症状的易感性以及治疗医师的判断。
一旦受试者病况改善，则如有必要，可以施用本发明的试剂(例如，结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐)、组合物或组合的维持剂量。随后，当症状已减轻至所期望的水平时，与症状相关，可以将施用剂量或频率或两者降低至保持改善病况的水平。然而，受试者可能在疾病症状复发时以长期方式需要间歇治疗。
本文还提供了包含本文所述的试剂(例如，结构式i-vii中任一项所示的化合物或者上述化合物的药用盐)和其它试剂(附加试剂，additionalagent)的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒包含有效量的本文所述的试剂以治疗本文所述的疾病、病症或病况(例如，癌症、2型糖尿病)和有效量的其它试剂以治疗所述疾病、病症或病况。在一些实施方式中，该试剂盒还包含向受试者施用所述试剂和其它试剂以治疗本文所述的疾病、病症或病况(例如，癌症、2型糖尿病)的书面说明书。
方法
醛脱氢酶(aldh)属于通过不可逆催化内源和外源产生的醛氧化为其各自的羧酸在醛代谢中起作用的nad(p+)-依赖性酶超家族。aldh具有广谱生物活性，包括视黄酸(ra)的生物合成和醇代谢等。
aldh酶家族含有具有不同功能的19个成员。该家族内的酶不可逆催化醛氧化为相应羧酸，同时将nad+/nadp+还原为nadh/nadph。这些酶存在于几个细胞区室中，然而，大部分定位至胞液或线粒体。一些aldh酶通过在肝脏中的表达参与全局代谢，在此它们起作用以使醇脱氢酶所形成的乙酰醛(acetylaldehyde)解毒，从视黄醛立体异构体生物合成维生素a或者使其它反应性醛解毒。相反，大部分aldh酶以细胞-或疾病-特异性方式表达并且调节细胞生物化学，经常通过未知的作用机制。
醛脱氢酶同工型1a3(aldh1a3)是在ra的生物合成和ra信号转导调控中重要的aldh1a亚家族的同工型/同工酶并且是细胞-和疾病-特异的。在2000年前，aldh1a3被称为aldh6，并且在2000-2007年被称为raldh3。在标准情况下，仅在胚胎发育期间需要aldh1a3并且aldh1a3对于健康成年小鼠是可有可无的。与其在正常生理学中的次要作用相反，最近已显示aldh1a3是大部分癌症类型中aldefluortm反应性的主要决定因素。aldefluortm活性长期被用作区分侵袭性癌细胞和主体肿瘤的标志物，尽管对于aldefluortm活性是否/如何影响肿瘤发展仍明显未知。
已发现通过aldh1a3驱动的aldefluortm活性是癌症侵袭性的功能性驱动因子，并且对于肿瘤发展、转移和化疗耐受性至关重要。因此，人aldh1a3(uniprotkb登录号：p47895)是癌症包括乳腺癌中化疗耐受性和转移性表型的功能性驱动因子。因此，aldh1a3代表了多种病变中的潜在治疗靶标，并且靶向aldh1a3可以克服当前治疗其肿瘤耐受常规疗法形式的3/4期患者中的障碍。
因此，本文提供了治疗对其有需要的受试者中的癌症(例如，转移性癌症、化疗耐受性癌症)的方法，其包括向受试者施用有效量的抑制aldh1a3的试剂(例如，结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐，或者包含结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐的组合物)。因此，在一些实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中的癌症(例如，转移性癌症、化疗耐受性癌症)的方法，其包括向受试者施用有效量的结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐，或者包含结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐的组合物。在其它实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中的癌症(例如，转移性癌症、化疗耐受性癌症)的方法，其包括向受试者施用有效量的表1所示的化合物(例如，mbe1、mbe1.5、mbe1.5a、mbe1.5b、mbe1.5c、mbe1.5d)或其药用盐或者包含表1所示的化合物(例如，mbe1、mbe1.5、mbe1.5a、mbe1.5b、mbe1.5c、mbe1.5d)或其药用盐的组合物。
本文还提供了治疗对其有需要的受试者中的2型糖尿病的方法，其包括向受试者施用有效量的抑制aldh1a3的试剂(例如，结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐，或者包含结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐的组合物)。因此，在一些实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中的2型糖尿病的方法，其包括向受试者施用有效量的结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐，或者包含结构式i-vii中任一项所示的化合物或上述化合物的药用盐的组合物。在其它实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中的2型糖尿病的方法，其包括向受试者施用有效量的表1所示的化合物(例如，mbe1、mbe1.5、mbe1.5a、mbe1.5b、mbe1.5c、mbe1.5d)或其药用盐或者包含表1所示的化合物(例如，mbe1、mbe1.5、mbe1.5a、mbe1.5b、mbe1.5c、mbe1.5d)或其药用盐的组合物。
如本文所使用的，术语“治疗”表示对抗医学病况(例如，与癌症有关的病况)以达到根据临床可接受的标准，医学病况得到改善(例如，受试者中癌症转移数目减少)的程度。
在一个实施方式中，受试者(例如，患者)是哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、母牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛、羊、马、狗、猫或啮齿类生物)。在具体的实施方式中，受试者是人。“对其有需要的受试者”是指具有或处于发生本文所述的疾病或病况(例如，癌症、转移性癌症)的风险的受试者。医学专业技术人员(例如，医师)可以容易地确定受试者是否具有或处于发生本文所述的疾病或病况(例如，癌症)的风险。
在一个实施方式中，对其有需要的受试者患有癌症(例如，转移性癌症、化疗耐受性癌症)。该癌症可以是实体瘤、白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在具体的实施方式中，对其有需要的受试者患有乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、骨癌、血癌、脑癌或肝癌。在一些实施方式中，该癌症是乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、透明细胞肾细胞癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、鳞状细胞肺癌、结肠直肠癌或者神经胶质瘤(例如，低级别胶质瘤)。
癌症包括：成人急性淋巴母细胞性白血病；儿童急性淋巴母细胞性白血病；成人急性髓细胞性白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；aids-相关淋巴瘤；aids-相关恶性肿瘤；肛门癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童脑干神经胶质瘤；成人脑肿瘤；儿童脑肿瘤，脑干神经胶质瘤；儿童脑肿瘤，小脑星形细胞瘤；儿童脑肿瘤，脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤；儿童脑肿瘤，室管膜瘤；儿童脑肿瘤，成神经管细胞瘤；儿童脑肿瘤，幕上原始神经外胚层瘤；儿童脑肿瘤，视通路和下丘脑神经胶质瘤；儿童脑肿瘤(其它)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；儿童乳腺癌；雄性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌瘤；儿童类癌瘤；胃肠类癌瘤；肾上腺皮质癌瘤；岛细胞癌瘤；未知原发性癌瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性粒性白血病；慢性脊髓增生病；腱鞘的透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结肠直肠癌；皮肤t-细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食道癌；儿童食道癌；尤因氏肉瘤家族；儿童颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，成视网膜细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；儿童胃(胃部)癌；胃肠道类癌瘤；儿童颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童脑干神经胶质瘤；儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；成人(原发性)肝细胞(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；成人霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期间的霍奇金淋巴瘤；舌癌；儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波济氏肉瘤；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性成淋巴细胞白血病；儿童急性成淋巴细胞白血病；成人急性脊髓白血病；儿童急性脊髓白血病；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；毛细胞白血病；唇癌和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性淋巴细胞性白血病；儿童急性淋巴细胞性白血病；慢性淋巴细胞白血症；aids-相关淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)淋巴瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；成人霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期间的霍奇金淋巴瘤；成人非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；妊娠期间的非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；外套细胞淋巴瘤；儿童成神经管细胞瘤；黑素瘤；眼内黑素瘤；merkel细胞癌；恶性间皮瘤；原发灶隐匿的转移性颈鳞癌；儿童多发性内分泌瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；阿利贝尔氏病；脊髓发育不良综合征；慢性粒细胞性白血病；儿童急性骨髓性白血病；多发性骨髓瘤；慢性脊髓增生病；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；成神经细胞瘤；成人非霍奇金氏淋巴瘤；儿童非霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期间的非霍奇金氏淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口腔癌；口腔癌和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低度恶性潜能肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌；岛细胞胰腺癌；鼻窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺胚细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金淋巴瘤；妊娠和非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾脏细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌症；成视网膜细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；儿童唾液腺癌；尤因氏肉瘤家族肉瘤；卡波西肉瘤；肉瘤(骨肉瘤)/恶性骨纤维组织细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；塞扎里综合征；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑素瘤)；merkel细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；转移性原发灶隐匿的颈鳞癌；胃(胃)癌；儿童胃(胃)癌；儿童幕上原始神经外胚层瘤；皮肤t-细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童未知原发位点癌症；儿童罕见癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌症；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；和韦尔姆斯氏瘤。
还可以根据本文所述的方法治疗上述癌症的转移。因此，在一些实施方式中，癌症是转移性癌症。
如本文所使用的“转移性癌症”是指从其原始原发位点或其最初形成位点扩散至受试者身体的其它区域的癌症。转移性癌症的实例包括转移性乳腺癌、转移性结肠癌、转移性肺癌、转移性胰腺癌、转移性前列腺癌、转移性骨癌、转移性血癌、转移性脑癌和转移性肝癌。在一个实施方式中，受试者患有乳腺癌的骨转移(例如，自发骨转移)。在另一个实施方式中，受试者患有乳腺癌的肺转移。在另一个实施方式中，受试者患有骨转移。
在具体的实施方式中，对其有需要的受试者患有乳腺癌(例如，转移性乳腺癌)。特别适合于使用本文所述的方法治疗的乳腺癌亚型包括但不限于基底细胞样乳腺癌和her2-阳性乳腺癌。
如本文所使用的“耐受性癌症”是对治疗无应答的癌症。“耐受性癌症”包括在治疗开始时对治疗无应答的那些和在治疗期间对治疗变得无应答的那些。在一个实施方式中，癌症是耐受性癌症。
在一个实施方式中，对其有需要的受试者患有对使用一种或多种化疗剂的治疗耐受的癌症或者化疗耐受性癌症。如本文所使用的“化疗耐受性癌症”是指对使用一种或多种化疗剂的治疗无应答的癌症。“化疗耐受性癌症”包括在治疗开始时对使用一种或多种治疗剂的治疗无应答的那些和在治疗期间对使用一种或多种治疗剂的治疗变得无应答的那些。特别适合于使用本文所述的方法的治疗的化疗耐受性癌症包括但不限于对使用紫杉醇和/或多柔比星的治疗耐受的癌症。
在一个实施方式中，对其有需要的受试者患有侵袭性癌症。如本文所使用的，“侵袭性癌症”是指快速发展(例如，形成、生长和/或转移)的癌症，或者需要比用于相同类型的癌症的典型癌症治疗更严苛和强烈的治疗的癌症。侵袭性癌症包括但不限于对常规治疗，例如，化疗(包括紫杉烷、蒽环类抗生素、烷化剂等)、放射疗法(例如，质子束辐射)或靶向生物治疗(例如，赫塞汀、可瑞达(keytruda)等)无应答或者在使用任何接受的方式的治疗期间发展或者诊断时已转移(iii/iv期癌症)的肺癌、乳腺癌、胰癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、脑癌、肝癌和前列腺癌或者血液系统癌症。作为具体实例，侵袭性前列腺癌丧失了对于抗雄激素疗法或辐射的应答并且通常骨转移，而侵袭性黑素瘤是扩散至真皮以外的任何肿瘤。所有多形性胶质母细胞瘤的诊断被认为是侵袭性的。侵袭性癌症通常扩散至远端位点并且由于缺少靶向治疗而引起显著的发病率。
在一些实施方式中，对其有需要的受试者患有晚期(例如，iii/iv期)癌症。
在一些实施方式中，癌症是原发癌(例如，原发性实体瘤)。如本文所使用的，“原发癌”是指癌症(例如，肿瘤)在受试者身体中的原始位点。
如本文所使用的，“有效量”是指当向受试者施用时，足以在施用条件下，在受试者中实现所期望的治疗效果的试剂的量，如足以在患有癌症的受试者(例如，患者)中抑制(例如，降低、减少、预防)肿瘤形成、肿瘤生长(例如，增殖、大小)、肿瘤血管化、肿瘤发展(例如，侵袭、转移)和/或化学抗性的量。可以通过本领域技术人员已知的任何适合的方法(例如，原位免疫组织化学、成像(例如，超声波、ct扫描、mri、nmr)、3h-胸腺嘧啶核苷掺入)确定疗法的有效性(例如，肿瘤转移的减少和/或预防)。
具有常规技术的临床医师可以使用本文所提供的指南以及本领域中已知的其它方法确定要施用的试剂的有效量，并且有效量取决于几种因素，例如，包括所选择的具体试剂、受试者的年龄、对药物的敏感度和耐受性以及整体健康状况。例如，适合的剂量可以为每次治疗约0.001mg/kg至约100mg/kg，约0.01mg/kg至约100mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约0.01mg/kg至约1mg/kg体重。对具体试剂、受试者和癌症的剂量的确定完全处于本领域技术人员的能力范围内。优选地，剂量不引起或产生最小的不良副作用(例如，免疫原性反应、恶心、眩晕、胃扰乱、高粘稠度综合征、充血性心力衰竭、中风、肺水肿)。
可以在单一剂量或作为多个剂量，例如，以适合于实现所期望的治疗效果(例如，癌症转移的抑制)的顺序和日程安排施用抑制aldh1a3的试剂。可以通过具有常规技术的临床医师确定适合的施用剂量和方案。
还可以与一种或多种其它疗法组合施用抑制aldh1a3的试剂。相对于与一种或多种其它疗法(佐剂、靶向、癌症治疗相关疗法等)组合的试剂施用，通常作为单一剂量(例如，通过注射、输注、口服)施用试剂，随后如果需要或指明，以特定间隔(例如，一小时或多个小时)重复剂量。
在一个实施方式中，可以以节律性(metronomic)剂量施用方案施用试剂，其中相对于最大耐受剂量施用，更经常施用低剂量。一些临床前研究已证实了与相应的最大耐受剂量(mtd)相比，节律性方案的优良抗肿瘤效力、有效抗血管生成作用和降低的毒性和副作用(例如，骨髓抑制)(bocci,etal.,cancerres,62:6938-6943,(2002)；bocci,etal.,proc.natl.acad.sci.,100(22):12917-12922,(2003)；和bertolini,etal.,cancerres,63(15):4342-4346,(2003))。节律性化疗似乎在克服与化疗有关的一些缺点方面是有效的。
可以作为主要疗法(例如，作为疗法或治疗方案中的主要治疗剂)；作为辅助疗法(例如，作为疗法或治疗方案中与另一种治疗剂一起使用的治疗剂，其中治疗剂的组合提供了所期望的治疗；“辅助疗法(adjuncttherapy)”也称为“辅助性疗法(adjunctivetherapy)”；与辅助疗法组合；作为佐剂疗法(adjuvanttherapy)(例如，作为已提供疗法或治疗方案中的主要治疗剂后，向对其有需要的受试者施用的治疗剂)；或者与佐剂疗法组合，向对其有需要的受试者施用抑制aldh1a3的试剂。例如，佐剂疗法包括化疗(例如，紫杉醇、多柔比星、他莫昔芬、顺铂、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、索拉非尼、奥曲肽、达卡巴嗪(dtic)、顺铂、西眯替丁、环磷酰胺)、放射疗法(例如，质子束疗法)、激素疗法(例如，抗雌激素疗法，雄激素阻断疗法(adt)、黄体生成素释放激素(lh-rh)激动剂、芳香酶抑制剂(ai，如阿那曲唑、依西美坦、来曲唑)、雌激素受体调节剂(例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬)或生物学疗法。还可以在癌症治疗方案期间施用多种其它疗法以减轻疾病的影响和/或癌症治疗的副作用，其包括控制疼痛(麻醉剂、针灸)、胃部不适(抗酸剂)、眩晕(抗眩晕药物治疗)、恶心(抗恶心药物治疗)、感染(例如，提高红/白血球计数的药物治疗)的疗法等，其均是本领域技术人员容易理解的。
在一些实施方式中，该方法包括与一种或多种其它疗法(例如，化疗、辐射和/或肿瘤的手术去除)组合施用有效量的抑制aldh1a3的试剂。当在组合疗法中施用时，可以在另一种疗法(例如，化疗剂，如紫杉醇或多柔比星的施用)之前、之后或同时施用试剂。当同时(例如，共同地)共施用时，试剂及其它治疗剂可以处于单独的制剂中或者处于相同的制剂中。作为另外一种选择，可以在如通过熟练的临床医师所确定的适当的时间框(例如，癌症治疗期/间隔内，如约1.5至约5小时)(例如，足以使疗法的药物作用重叠的时间)内，作为单独组合物，顺序施用试剂及其它治疗剂。
基于试剂和要治疗的具体癌症，可以通过多种施用途径施用抑制aldh1a3的试剂，例如，其包括口服、饮食、局部、透皮、直肠、肠胃外(例如，动脉内、静脉内、肌内、皮下、皮内注射)、静脉内输注和吸入(例如，支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴剂)施用途径。如所指明的，施用可以是局部或全身性的。优选的施用形式可以基于所选择的具体试剂而改变。
例如，医师可以通过考虑癌症性质(原发性或转移性)、肿瘤数目和大小、所提供的其它疗法和受试者特征来确定治疗剂的真实剂量和治疗方案。
本文还提供了抑制癌细胞(例如，转移性癌细胞、化疗耐受性癌细胞)增殖的方法。该方法包括向细胞施用(例如，有效量的)抑制aldh1a3的试剂(例如，结构式i-vii中任一项所示的化合物或者上述化合物的药用盐，或者包含结构式i-vii中任一项所示的化合物或者上述化合物的药用盐的组合物)。在具体的实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞(例如，基底细胞样乳腺癌细胞或者her-2阳性乳腺癌细胞)。细胞可以是培养细胞(例如，细胞系)或者受试者中的细胞。在具体的实施方式中，细胞存在于人受试者(例如，患有癌症的人受试者)中。
本文还提供了在对其有需要的受试者中抑制aldh1a3的方法。该方法包括向受试者施用(例如，有效量的)抑制aldh1a3的试剂(例如，结构式i-vii中任一项所示的化合物或者上述化合物的药用盐，或者包含结构式i-vii中任一项所示的化合物或者上述化合物的药用盐的组合物)。
本文还提供了治疗对其有需要的受试者中通过aldh1a3所介导的疾病或病症如本文所述的癌症类型的方法。该方法包括向受试者施用有效量的抑制aldh1a3的试剂(例如，结构式i-vii中任一项所示的化合物或者上述化合物的药用盐，或者包含结构式i-vii中任一项所示的化合物或者上述化合物的药用盐的组合物)。aldh1a3还涉及2型糖尿病。因此，2型糖尿病是aldh1a3-介导的疾病或病症的另一种实例。
例证
n-(7-氟-2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)异烟酰胺(mbe1.2)的合成
3-氯-n-(3-氟苯基)丙烯酰胺：向2-l圆底烧瓶中放置3-氟苯胺(48.0g，0.432mol，1.00当量)和二氯甲烷(440ml)的混合物。依次滴加吡啶(85.8ml，1.08mol，2.50当量)和3-氯丙酰氯(49.5ml，0.518mol，1.20当量)。将反应混合物在室温下搅拌3小时直至如通过tlc分析所示，起始材料消失。然后，用水(440ml)稀释反应混合物并用乙酸乙酯萃取(2.2l×3)。用盐水(1.0l×2)清洗合并的有机层，用无水硫酸钠干燥并真空浓缩以提供64.0g(75％)浅棕色固体状的3-氯-n-(3-氟苯基)丙酰胺。lc-ms(es)[m+1]+m/z:202.1。
7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮：向1-l圆底烧瓶中放置3-氯-n-(3-氟苯基)丙酰胺(64.0g，0.317mol，1.00当量)和三氯化铝(148g，1.11mol，3.50当量)的混合物。将反应混合物在120℃-125℃搅拌2小时直至如通过tlc分析所示，起始材料消失。将反应混合物倒入冰水(1.2l)中并过滤。收集并用水(60ml×3)和甲基叔丁基醚(60ml×3)清洗滤饼。这导致产生了47.8g(91％)浅棕色固体状的7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮。lc-ms(es)[m+1]+m/z:166.1。
7-氟-6-硝基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮：向2-l圆底烧瓶中放置7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮(47.8g，0.289mol，1.00当量)和浓硫酸(290ml)的混合物。滴加硝酸(20.8ml，0.304mol，1.05当量)。将反应混合物在0℃搅拌2小时直至如通过tlc分析所示，起始材料消失。将反应混合物倒入冰/水(600ml)中并过滤。收集并用水(60ml×3)和甲基叔丁基醚(60ml×3)清洗滤渣。这导致产生了37.0g(粗)浅棕色固体状的7-氟-6-硝基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮。lc-ms(es)[m+1]+m/z:211.1。1hnmr(dmso-d6,300mhz)与具有7-氟-6-硝基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮的结构的化合物一致。
6-氨基-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮：向3-l圆底烧瓶中放置7-氟-6-硝基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮(37.0(粗)，0.176mol，1.00当量)、甲醇(1800ml)和pd/c(3.70g)的混合物。将反应混合物在氢气氛下，在室温下搅拌4小时直至如通过tlc分析所示，起始材料消失。过滤反应混合物并浓缩滤液。通过柱色谱硅胶纯化残余物(dcm/meoh＝200/1)。这导致产生了12.1g(两步，24％)橙色固体状的6-氨基-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮。lc-ms(es)[m+1]+m/z:211.1。
n-(7-氟-2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)异烟酰胺(mbe1.2)：向40-ml小瓶中放置6-氨基-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮(180mg，1.00mmol，1.00当量)、n,n-二甲基甲酰胺(5ml)，异烟酸(135mg，1.10mmol，1.10当量)、n-乙基-n-异丙基丙-2-胺(387mg，3.00mmol，3.00当量)和1-((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)-1h-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(v)(570mg，1.50mmol，1.50当量)的混合物。将反应混合物在室温下搅拌2小时。过滤反应混合物并通过制备-hplc纯化滤液。这导致产生了175mg(61％)黄白色固体状的n-(7-氟-2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)异烟酰胺。lc-ms(es)[m+1]+m/z:286.0。1hnmr(dmso-d6,300mhz)与具有n-(7-氟-2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)异烟酰胺的结构的化合物一致。
6-((3-乙基吡啶-4-基)甲基氨基)-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮(mbe1.3)的合成
6-氨基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮：向100-ml圆底烧瓶中放置6-硝基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮(1.92g，10.0mmol，1.00当量)、甲醇(50ml)和pd/c(200mg)的混合物。将反应混合物在氢气氛下，在室温下搅拌4小时直至如通过tlc分析所示，起始材料消失。过滤反应混合物并浓缩滤液。这导致产生了1.60g(99％)浅绿色固体状的6-氨基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮。lc-ms(es)[m+1]+m/z:163.1。
甲基3-乙基异烟酸酯：向1-l3-颈圆底烧瓶中放置甲基3-溴代异烟酸酯(21.6g，100mmol，1.00当量)、二噁烷(300ml)和pd(dppf)cl2(3.66g，5.00mmol，0.05当量)的混合物。在室温下滴加二乙基锌在甲苯中的溶液(100ml，100mmol，1.00当量)。将反应混合物在氮气氛下，在70℃搅拌4小时。将反应混合物倒入水中(100ml)，用乙酸乙酯萃取(200ml×3)。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤并真空浓缩。通过用pe/etoac(10/1)洗脱的快速硅胶纯化残余物以提供12.0g(73％)浅黄色液体状的甲基3-乙基异烟酸酯。lc-ms(es)[m+1]+m/z:166.0。
(3-乙基吡啶-4-基)甲醇：向100-ml圆底烧瓶中放置甲基3-乙基异烟酸酯(3.75g，22.7mmol，1.00当量)、甲醇(50ml)和氯化钙(2.52g，22.7mmol，1.00当量)的混合物。在0℃，分部分加入硼氢化钠(1.72g，45.5mol，2.00当量)。将反应混合物在室温下搅拌2小时直至如通过tlc分析所示，起始材料消失。将反应混合物倒入水中(50ml)，用乙酸乙酯萃取(100ml×3)。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤并浓缩。这导致产生了1.80g白色固体状的(3-乙基吡啶-4-基)甲醇。lc-ms(es)[m+1]+m/z:138.1。
3-乙基异烟醛：向100-ml圆底烧瓶中放置(3-乙基吡啶-4-基)甲醇(823mg，6.00mol，1.00当量)、二氯甲烷(25ml)和dmp(510mg，7.20mol，1.20当量)的混合物。将反应混合物在室温下搅拌4小时直至如通过tlc分析所示，起始材料消失。用二氯甲烷稀释(25ml)反应混合物并用碳酸氢钠饱和溶液清洗(25ml×3)。通过含水硫酸钠干燥有机层，过滤并浓缩。通过柱色谱硅胶(pe/etoac＝3/1)纯化残余物。这导致产生了橙色固体状的350mg(43％)的3-乙基异烟醛。lc-ms(es)[m+1]+m/z:136.1。
6-((3-乙基吡啶-4-基)甲基氨基)-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮：向40-ml小瓶中放置6-氨基-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮(252mg，1.40mmol，1.00当量)、甲醇(5ml)、3-乙基异烟醛(189mg，1.00mmol，1.00当量)、氯化钙(776mg，6.99mmol，5.00当量)和氰基硼氢钠(132mg，1.50mmol，2.10当量)的混合物。将反应混合物在70℃下搅拌2小时。过滤反应混合物并通过制备-hplc纯化滤液。这些导致产生了69.9mg(17％)的黄白色固体状的6-((3-乙基吡啶-4-基)甲基氨基)-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮。lc-ms(es)[m+1]+m/z:300.1。1hnmr(dmso-d6,300mhz)与具有6-((3-乙基吡啶-4-基)甲基氨基)-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮的结构的化合物一致。
2-乙基-n-(7-氟-2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)苯甲酰胺(mbe1.5)的合成
2-乙基-n-(7-氟-2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)苯甲酰胺：向40-ml小瓶中放置6-氨基-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮(180mg，1.00mmol，1.00当量)、n,n-二甲基甲酰胺(5ml)、2-乙基苯甲酸(135mg，1.10mmol，1.10当量)、n-乙基-n-异丙基丙-2-胺(387mg，3.00mmol，3.00当量)和1-((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)-1h-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(v)(570mg，1.50mmol，1.50当量)的混合物。将反应混合物在室温下搅拌2小时。过滤反应混合物并通过制备-hplc纯化滤液。这导致产生了181mg(58％)黄白色固体状的2-乙基-n-(7-氟-2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)苯甲酰胺。lc-ms(es)[m+1]+m/z:313.1。1hnmr(dmso-d6,300mhz)与具有2-乙基-n-(7-氟-2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)苯甲酰胺的结构的化合物一致。
3-乙基-n-(2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)异烟酰胺(mbe1.6)的合成
3-乙基异烟酸：向100-ml圆底烧瓶中放置甲基3-乙基异烟酸酯(3.30g，20.0mmol，1.00当量)、甲醇(20ml)、水(4ml)和氢氧化钠(1.60g，40.0mmol，2.00当量)的混合物。将反应混合物在室温下搅拌6小时。用2m盐酸溶液将ph调节至ph约4。过滤混合物并收集滤饼。这导致产生了2.60g(86％)白色固体状的3-乙基异烟酸。lc-ms(es)[m+1]+m/z:152.0。
3-乙基-n-(2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)异烟酰胺：向40-ml小瓶中放置6-氨基-7-氟-3,4-二氢喹啉-2(1h)-酮(180mg，1.00mmol，1.00当量)、n,n-二甲基甲酰胺(5ml)、3-乙基异烟酸(166mg，1.10mmol，1.10当量)、n-乙基-n-异丙基丙-2-胺(387mg，3.00mmol，3.00当量)和1-((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)-1h-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(v)(570mg，1.50mmol，1.50当量)的混合物。将反应混合物在室温下搅拌2小时。过滤反应混合物并通过制备-hplc纯化滤液。这导致产生了260mg(88％)3-乙基-n-(2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)异烟酰胺。lc-ms(es)[m+1]+m/z:296.1。1hnmr(dmso-d6,300mhz)与具有3-乙基-n-(2-氧-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)异烟酰胺的结构的化合物一致。
细胞系和细胞培养物
在dmem+10％fbs中培养mda-mb-468、mcf7、293t、b16f10、hct116、hepg2、ln229、htb140和sw480细胞；在rpmi-1640+10％fbs中培养du145细胞及其衍生物pc3、aspc-1、nci-h358；并且在补充有10％fbs、10μg/ml胰岛素和20ng/mlegf的f12培养基中培养sum159细胞及其衍生物。用具有gfp/萤火虫荧光素酶的双顺反子表达的反转录病毒载体标记细胞系以有利于成像和流式细胞术实验。通过每月的pcr分析验证所有细胞系对于支原体污染是阴性的。本文所使用的细胞系未出现在常见错误识别细胞系(iclac)数据库中。通过str分析验证所有细胞系并与ncbi资料库数据相比较。
克隆、病毒产生和转导
从混合人参考rna样品所制备的cdna中克隆aldh1a1、aldh1a2、aldh1a3和aldh3a1的编码序列。将通过age1和xho1限制性位点侧接的克隆序列插入plex慢病毒质粒中。对克隆测序并出于准确性，对ncbi表达序列标记(est)比较。通过使用pei以及pspax2和vsvg包装载体向293t包装细胞系的转染进行每种酶的病毒产生。收集病毒并以0.45μm过滤，然后使用聚凝胺(8g/ml)转导细胞12小时，随后在整个实验期间与1g/ml嘌罗霉素一起培养。在细胞群范围的基础上进行所有病毒转导和选择。
发育和成人生理学中的aldh1a3；作用机制
尽管aldh家族内的某些酶具有良好鉴定的底物偏好性、调控和功能，但是该家族大部分成员的研究较浅或者主要作用机制不明。例如，已表明aldh1l1和aldh1l2如何通过氧化10-甲酰基-thf在叶酸代谢中起作用。良好鉴定的aldh酶的另一个重要实例是aldh3a1，其构成50％的可溶性角膜蛋白并且起作用以通过氧化4-羟基壬烯醛来保护抵抗uv-引起的视网膜和角膜的氧化损害。或许研究最多的aldh酶是aldh2，它是肝脏线粒体中乙酰醛(acetylaldehyde)氧化成乙酸的关键催化剂。通过
aldh1a亚家族是aldh家族中最有生物学意义的组，并且考虑到其对发育生物学的重要性和aldefluortm测定(stemcelltechnology)鉴别干细胞，特别是在癌症中鉴别干细胞的值得注意的能力，最近已成为大量研究的关注焦点。如本文所述，aldefluortm测定主要测量来自aldh1a3的活性。
aldh1a3的全部敲除由于鼻部闭合缺陷而导致出生后小鼠死亡。重要地，可以通过在短暂的妊娠窗期间的全反式视黄酸添加来挽回这种表型，从而导致产生正常的成人。在人中，aldh1a3中的纯合突变与小-眼病有关，但是该表型未完全外显(penetrant)并且未提及其它病变。为了进一步支持aldh1a3是发育受限的观点，近期研究已显示在某些发育组织中特异性抑制aldh1a3以防止维生素a信号转导。其它分析已显示发育中的卵巢不需要aldh1a3并且它仅在成人的前列腺和唾液腺中表达。在结肠、肝脏、肺、膀胱、前列腺和卵巢中，仅卵巢具有显著的aldefluortm-群并且该小群仅受到aldh1a3抑制剂的部分抑制。
在代谢疾病中，aldh1a3是坏死胰岛细胞的标志物。其它研究表明aldh1a3表达直接降低胰岛细胞克隆的胰岛素分泌，同时提高高血糖素的分泌。这表明aldh1a3还可以驱使2型糖尿病病变。
总体上，这些结果表明可以潜在消除aldh1a3而无明显的中靶毒性。数据表明aldh1a3对于成年哺乳动物是可有可无的。妊娠期间aldh1a3的抑制将可能是禁用的。
已发表的研究对于aldh1a3的癌症促进作用主要主张两种机制。它们在活性氧物质的解毒或视黄醛向生物活性视黄酸的氧化之间产生分歧。与其作用机制相比，它与对于详细说明aldh1a3表达的功能性后果的论文数目之间的差异存在多种原因。首先，活性氧物质是瞬时且难以检测的。当前方法使用荧光报告子，如dcfda和dhe，两者都是不灵敏的。此外，体外条件下的氧胁迫不能反映体内条件。我们已尝试用紫杉醇体外诱导氧胁迫并通过dcfda检测，然而，这种测定的检测范围小于数据内固有的偏差。然而，其它文献证据的确支持ros-相关机制：已在公马精液样品中发现aldh1a3使4-hne解毒，其导致运动性改善。还通过放射疗法在头颈鳞状细胞癌(scc)中诱导了aldh1a3，这表明它可以对细胞损害起反应。
有趣地，黑素瘤中引人注目的工作已表明氧胁迫是转移性扩散的主要决定因素。在本研究中，已表明原发肿瘤中不存在氧胁迫，然而它剧烈诱导并影响转移性细胞的健康。然后，全身性抗氧化剂递送可以有助于在通常未转移的细胞中的肺转移。aldh1a3表达调控不会强烈影响原发肿瘤生长直至通过氧化应激物，如化疗激发。另一方面，已观察到aldh1a3抑制的最大影响在肺或骨转移，它们是具有高氧胁迫水平的位点(图5a-6b)。
依赖于aldh1a3的视黄酸(ra)信号转导的研究同样是困难的，因为它们需要在组织培养条件下外源添加视黄醛并且与肿瘤微环境条件相差甚远。已发展了显示每种aldh1a酶和来自乳腺癌患者的肿瘤中的ra信号通路的每个组分之间基因相关性的数据，并且其表明在aldh1a1、aldh1a2和aldh1a3中，aldh1a3显示出与乳腺肿瘤中ra信号通路组分的最小相关性。此外，如果aldh1a3影响ra信号通路，则预计组织培养生长或原发肿瘤生长将受影响。在对乳腺癌细胞的研究中未观察到原发肿瘤或体外生长中的差异。
aldh1a3在大部分实体瘤类型中对治疗耐受性、肿瘤发展和转移的功能重要性使其成为药物发现的有吸引力的靶标。与中靶毒性的低概率结合，预计aldh1a3单独或与其它治疗剂(例如，批准的治疗剂)结合的全身性药理学抑制将对于治疗原发癌以及生长缓慢和明显转移性疾病是有用的。
aldefluortm测定
aldefluortm测定评价细胞将bodipy-氨基乙醛(baaa)氧化成bodipy-氨基乙酸酯(baa)的能力，其自发酯化以形成非细胞膜可渗透的产物。这种活性可以用于分选活细胞并借此在异种群内的aldh活性水平之间进行区分。当在2007年首先发现aldefluortm-阳性癌细胞的致癌性更强且预测具有更差的临床结果时，假设aldefluortm活性是促进肿瘤侵袭性的更广泛的转录程序的标志物。由于这些早期研究，aldefluortm活性已成为评价肿瘤细胞群的“干细胞性”或侵袭性的引用最多的方法。
在这一重大发现之后，通常评价aldefluortm活性而很少考虑aldh1酶的功能。然后，出版物显示aldefluortm测定分离出侵袭性或转移性癌细胞，而不考虑原发肿瘤位点。因此，数百篇论文已使用aldefluortm测定来评价几乎所有癌症类型中的癌细胞特性。正是仅从marcato及其同事在2011年开始显示在大部分乳腺癌细胞系中，aldh1a3负责aldefluortm活性。
由于marcato及其同事的出版物，快速出现的研究已确立aldh1a3不仅负责大部分癌症类型中的aldefluortm活性，而且它还在功能上促进癌症生长、治疗耐受性和转移。不同质量的研究已确立aldh1a3表达并且对黑素瘤患者来源的异种移植或细胞系中的生长、间质样神经胶质瘤或成胶质细胞瘤中的代谢、化疗耐受性和辐射耐受性、肺癌中的致瘤性和顺铂耐受性、胰腺癌中的生长和辐射耐受性、结肠和甲状腺细胞中的fak抑制剂耐受性、间皮瘤中的顺铂耐受性、前列腺癌中的gleason得分和生长、乳腺癌中的细胞凋亡耐受性和转移以及肝胆管型肝癌中的预后是重要的。在本文中已表明aldh1a3是大部分实体瘤类型中主要的aldefluortm-诱导酶(参见图3a和3b)。
表达和预后研究进一步表明aldh1a3强烈指示癌症类型中的不良结局。导致低aldh1a3表达的aldh1a3启动子的高甲基化是原发性成胶质细胞瘤患者组中有利结局的最强预测因子。高aldh1a3预测肝胆管型肝癌患者中的淋巴结转移。在前列腺癌中通过雄激素驱动aldh1a3表达，其中雄激素是前列腺癌细胞的主要有丝分裂原，而mir187在前列腺癌中靶向aldh1a3并且高mir187与预后良好相关。
在本文所使用的aldefluortm测定中，使细胞生长直至它们达到50-80％汇合，通过0.25％胰蛋白酶/edta(sigma)收获并通过离心/再混悬(在4℃，190g，5min)用pbs清洗一次。对细胞计数，离心并以1,000,000个细胞/ml在aldefluortm缓冲液(stemcelltechnologies)中再混悬。将aldefluortm底物(stemcelltechnologies，1:200)和测试化合物或1mmdeab加入至细胞悬液中并在37℃培育45分钟，其中每15分钟进行涡旋混合。将细胞离心并在具有5μg/mldapi的aldefluortm缓冲液中再混悬。通过bdlsr2流式细胞术平台分析样品。使用deab作为阴性对照，进行设门。
图1a是在存在本文所述的多种化合物的情况下，aldefluortm-阳性细胞的百分比的柱状图，并且其显示了在使用本文所述的标准aldefluortm规程，以100nm浓度的化合物培育后，如通过流式细胞术所检测的高于背景荧光水平的sum159-m1a-aldh1a3细胞的百分比。使用1毫摩尔deab作为阴性对照，对背景荧光设门。图1a证实mbe1-5、mbe1和mbe1-6对于aldh1a3活性抑制是高亲合力化合物。
图1b是在存在不同浓度的mbe1或mbe1.5的情况下，aldefluortm-阳性细胞的百分比的折线图，并且其显示了在与mbe1或mbe1-5的剂量滴定组合的根据本文所述的标准aldefluortm规程培育之后，如通过流式细胞术所检测的高于背景荧光水平的sum159-m1a-aldh1a3细胞的百分比。将[inh-min]阈值设置为对照样品的两个标准偏差的下限，而将ic50阈值设置为对照样品平均值的50％。图1b证实mbe1和mbe1-5显示出8-10纳摩尔范围内的ic50值，其在低至2纳摩尔的浓度检测到抑制活性。
图1c是在存在不同浓度的mbe1或mbe1.5的情况下，高aldh百分比的折线图，并且其显示了在与mbe1或mbe1.5的剂量滴定组合的根据本文所述的aldefluortm规程培育之后，如通过流式细胞术所检测的处于高荧光水平的sum159-m1a-aldh1a3细胞的百分比。在10纳摩尔的mbe1.5浓度，将高活性设门在第99细胞百分位。将[inh-min]阈值设置为对照样品的两个标准偏差的下限。图1c证实mbe1.5比mbe1更擅长抑制高aldh1a3-活性细胞。
图2a是使用人aldh1a1、aldh1a3或aldh3a1稳定转导并通过与dmso或处于所列浓度的mbe1组合的流式细胞术使用aldefluortm规程分析的mcf7细胞的柱状图，并且其显示了dmso或mbe1对通过每种酶所诱导的aldefluortm活性的影响。图2a证实在低于10μm的浓度，mbe1不抑制aldh1a1或aldh3a1活性，尽管它对于单独的癌细胞系mcf7中aldh1a3活性的抑制是有效的。
图2b是使用人aldh1a2或aldh1a3瞬时转染并通过与dmso或处于所列浓度的mbe1.5组合的流式细胞术使用aldefluortm规程分析的293t细胞的柱状图，并且其显示了dmso或mbe1.5对通过每种酶所诱导的aldefluortm活性的影响。图2b证实在低于10μm的浓度，mbe1.5不抑制aldh1a2活性，尽管它对于用人aldh1a3转染的293t中aldh1a3活性的抑制是有效的。
图3a是在存在deab或mbe1的情况下，在多种癌症类型中的aldefluortm-阳性细胞的柱状图，并且其显示除了sum159-m1a(乳腺)和mda-468(乳腺)外，在多种癌症类型中观察到了aldh1a3活性，并且在多种癌症类型中通过mbe1抑制所述aldh1a3活性。图3b是在存在1mmdeab(pan-aldh抑制剂)或100nmmbe1.5(特异性aldh1a3抑制剂)的情况下，在多种癌症类型中的aldefluortm-阳性细胞的柱状图，并且其显示了显示aldh1a3活性的大部分人癌细胞系。值得注意的例外是肝癌，其中预期存在大的aldefluortm-阳性群并且其是通过aldh1a1驱动的。
aldefluortm测定还用于评价本文所述的几种化合物对sum159-m1a-aldh1a3细胞的相对活性。表1中报道了在100nm浓度，几种化合物在测定中的活性，以及与每种化合物有关的化学结构和化合物名称。
表1.
图12是aldefluortm活性相对于浓度的图，并且其显示了在10nm和100nm的浓度下本文所述的几种化合物对sum159-m1a-aldh1a3细胞的aldefluortm活性。与对照(dmso)或deab处理的细胞相比，在10nm浓度，mbe1.5c几乎是mbe1.5、mbe1.5a或mbe1.5d效力的两倍。
在mcf7或sum159细胞中表达aldh同工型1a1、1a2、1a3和3a1，并随后在aldefluortm测定中使用。图13a是western印迹并且其显示了每种aldh同工型在所指明的细胞中的表达。图13b是表达所指明的aldh同工型的aldefluortm-阳性mcf7细胞的百分比相对于mbe1.5浓度的对数的图，并且其显示在低于10μm的浓度，mbe1.5特异性抑制aldh1a3。图13c是表达所指明的aldh同工型的aldefluortm-阳性sum159细胞的百分比相对于mbe1.5浓度的对数的图，并且其显示在低于10μm的浓度，mbe1.5特异性抑制aldh1a3。
aldh活性在鼠科淋巴细胞中的离体分析
通过用pbs冲洗胫骨和股骨，从12周大的c56bl6小鼠采集骨髓细胞并使其通过100-μm细胞筛。从相应组织分离胸腺细胞和脾细胞并通过对100μm细胞筛的物理破裂使其分离。通过离心/再混悬清洗细胞，然后以107个细胞/ml混悬。然后，除了在培育期内以1:200添加抗
图4a是流式细胞谱图，并且其显示cd45-阳性骨髓细胞是aldefluortm-阳性的，但是不受mbe1.5的影响。图4b是流式细胞谱图，并且其显示cd11c-阳性骨髓细胞是aldefluortm-阳性的，但是不受mbe1.5的影响。在所测试的其它群，包括cd45-阳性和cd3e-阳性(cd45+cd3e+)以及cd11c-阳性和cd317-阳性(cd11+cd317+)中获得了类似的结果(未显示)。因此，所测试的所有群均是aldefluortm-阳性的，但是不受mbe1.5影响，从而显示了较小的毒性潜能。
小鼠模型和异种移植
所有小鼠最初定购自jacksonlaboratory(barharbor,me)并且在无特定病原(spf)的屏障设施(barrierfacility)中实施繁殖。对8-12周大的雄性和雌性c57bl6小鼠进行毒性实验。将mbe1以50mg/ml溶解在dmso中，随后1:2稀释至kolliphorel，随后1:5稀释至pbs以获得5mg/mlmbe1溶液(10％dmso，10％kolliphorel，80％pbs)。将其在3只小鼠的组中，以24h间隔，以从12.5至200mg/kg体重的升高剂量，通过ip注射施用。作为毒性读数测量身体状况得分、食物吸收、粪便/尿液产生、行为和体重。然后，每3天用25mg/kgmbe1处理5只小鼠18天。任何实验均未显示急性或慢性毒性的任何指征。
对8周大的雌性小鼠(无胸腺nu/nu或者nod/scidγ)实施所有异种移植实验。对于尾静脉或心内注射，使用100μlpbs中的125,000个sum159-m1a细胞进行异种移植实验。注射后，对小鼠随机分组。使用ivis200系统和眶后萤光素注射进行生物发光成像(bli)。对于药物治疗，以图5a(尾静脉注射)和图6a(心内注射)中所指明的时间间隔和剂量，与紫杉醇(5mg/ml，在10％乙醇、10％kolliphorel、80％pbs中的溶液)结合，通过ip注射向小鼠提供(如上制备的)mbe1。
图5b是相对于时间(天)的肺转移的折线图，如使用生物发光成像(bli)所测量的，并且在来自图5a中所列实验的小鼠中比较了在存在和不存在mbe1的情况下的肺转移。图6b是相对于时间(天)的骨转移的折线图，如使用bli所测量的，并且在来自图6a中所列实验的小鼠中比较了在存在和不存在mbe1的情况下的骨转移。图5b和6b证实mbe1是治疗确立的转移性疾病的有效治疗剂并且确定mbe1和本文所公开的化合物可以用于有效体内抑制aldh1a3及其下游作用。
在另一个异种移植实验中，如上所述，通过尾静脉注射向小鼠注射sum159-m1-p44细胞并且在注射后随机分组。在第16天通过活体成像对转移性负荷成像。然后，在第17、19和21天，用紫杉醇(25mg/kg)和载体或mbe1.5(50mg/kg)处理小鼠。然后，在第22天对肺转移性负荷成像。对第16天归一化信号。
图14是如通过生物发光成像(bli)所测量的肺转移相对于时间(天)的折线图，并且其显示在小鼠异种移植模型中，在第17、19和21天施用的3剂量的与25mg/kg紫杉醇组合的50mg/kgmbe1.5引起所确立的转移性疾病的消退。
在另一个异种移植实验中，通过乳房脂肪垫向小鼠注射mda-mb-468细胞，并且在注射后随机分组。用mbe1.5(25mg/kg每天，n＝6)或者载体(n＝12)和紫杉醇(12.5mg/kg，每隔一天)处理小鼠12天。在每个处理组之间通过卡尺进行原发肿瘤测量。
图15a是体重(g)相对于时间(天)的折线图，并且其显示在该实验中不存在与mbe1.5治疗有关的总毒性。图15b是肿瘤体积(mm3)相对于时间(天)的折线图，并且其显示用mbe1.5的12天治疗引起原发性乳腺肿瘤消退。通过治疗完全消除了mbe1.5处理组中的两只小鼠的肿瘤。
在另一个异种移植实验中，通过尾静脉注射向小鼠注射sum-159-m1a-aldh1a3细胞并在注射后随机分组。用mbe1.5(25mg/kg每天)或载体和紫杉醇(12.5mg/kg，每隔一天)处理小鼠12天。通过活体生物发光追踪肺转移发展。
图16a是肺转移生物发光相对于时间(天)的折线图，并且其显示用mbe1.5或载体治疗前后肺转移的发展。图16b是作为处理组的函数，小鼠存活随时间的kaplan-meier图，并且其显示用mbe1.5的12天治疗在具有晚期确立的乳腺癌肺转移的小鼠中的延长存活。
药物动力学评价
对16周大的c57bl6雄性小鼠进行药物动力学实验。通过ip注射向小鼠施用mbe1.5(15％dmso，5％kolliphorel，80％pbs)。在注射后第15分钟、30分钟、1小时、3小时和24小时，通过末端心脏穿刺采集血液。通过以16200rcf离心1min，通过血液分离获得血清。然后，在放血后收集组织。将血清和组织在液氮中快速冷冻并提交药物动力学评价。
对于小鼠pk研究，通过lc/ms/ms的mbe1.5的血浆浓度定量
在小鼠pk研究中，通过lc/ms/ms测定测量了血浆mbe1.5浓度。
化学品：作为具有1％dmso的meoh中的储液(1mg/ml)提供mbe1.5和mbe2.0。mbe2.0用作内标。hplc级乙腈和水购自j.t.baker(centervalley,pa)。小鼠血浆购自innovativeresearch(novi,mi)以用于制备血浆校准标准品。
lc/ms/ms测定：
标准溶液的制备：将mbe1.5储液在对照小鼠血浆中稀释以获得8.2ng/ml至18μg/ml的校准范围。将1μg/mlmbe2.0在甲醇中的溶液用作工作内标(is)。
样品制备：向血浆标准品和小鼠血浆样品(20μl)加标5μlis并用120μl乙腈和甲醇(v/v5:1)脱蛋白。在以13000rpm离心15分钟后，通过lc-ms分析25μl上清液。
液相色谱/质谱：使用配备有api电喷雾电离(esi)源、surveyorms泵、surveyor自动进样器的tsqquantum三重四极杆质谱仪，通过xcalibur数据采集软件(thermoelectron,sanjose,ca,usa)进行mbe1.5的定量。
lc条件如下所示：流动相a：水溶液(0.1％甲酸)；流动相b：乙腈(0.1％甲酸)；流速500μl/min；梯度洗脱，0至1分钟，60％a；1至2.5分钟，60％至20％a；2.5至7.0分钟，0％a，7.0至9.0分钟，0％a，9.0至11.0分钟，0％至60％a；并且柱：
ms/ms条件如下所示：以单一反应监控方式，m/z313.2/178.2(mbe1.5)，m/z281.2/119.1(mbe2.0，is)；离子喷雾电压，4500v；毛细管温度350℃；鞘气压力20任意单位；辅助气压力50任意单位；碰撞气压力1.5任意单位。对每种化合物优化碰撞能和管镜。
计算：将血浆校准标准品用于血浆样品中mbe的定量。将log线性回归用于校准曲线以确定血浆样品中的浓度。
结果：
lc/ms/ms测定：使用8.2ng/ml至18μg/ml的浓度范围对mbe1.5的血浆校准曲线作图。定量限为8.2ng/ml(lod)。lc/ms/ms测定在校准范围内处于良好的线性度(r2>0.99)。表2总结了测定内的准确度和精确度。在该测定中未观察到基质效应。
表2.mbe1.5lc/ms/ms测定的测定内准确度和精确度
小鼠中mbe1.5的血浆pk：在表3中列出了小鼠pk研究中的mbe1.5的血浆浓度。通过winnolin2.0，使用非隔室模型分析基本pk数据。表4中总结了pk参数。
表3.小鼠血浆中mbe1.5的浓度(μg/ml)。
*积分峰面积小于lod(检测限)，强制进行计算。
表4.小鼠中mbe1.5的药物动力学参数(剂量25mg/kg，i.p.)
aldh1a3的基因敲除
通过慢病毒感染，将含有cas9基因和包含基因组aldh1a3的同源序列的grna序列两者的crispr-cas9载体转导至mda-mb-468细胞中，随后对病毒整合进行嘌罗霉素(puromycin)选择，并通过aldefluortm测定分析所得细胞。将两个aldh1a3-靶向grna载体用于产生两个衍生细胞系，并且将具有加扰序列的一个grna用于产生对照衍生细胞系。
图7a是流式细胞谱图，并且其显示与对照mda-mb-468细胞(最左侧谱图)相比，mda-mb-468乳腺癌细胞中aldh1a3(中间和最右侧谱图)的基因敲除显著降低了aldefluortm活性。图7b是肿瘤体积(mm3)相对于时间(天)的折线图，并且其显示mda-mb-468乳腺癌细胞中aldh1a3的基因敲除减缓了原发肿瘤生长并且使肿瘤对紫杉醇敏感。图7c是肿瘤质量(g)相对于基因敲除的柱状图，并且其显示mda-mb-468乳腺癌细胞中aldh1a3的基因敲除减缓了原发肿瘤生长并且使肿瘤对紫杉醇敏感。
将含有cas9基因和包含基因组aldh1a3的同源序列的grna序列两者的crispr-cas9载体转染至sum159-m1a细胞中，随后通过流式细胞术选择阳性转染细胞。然后，通过含有载体主链或全长人aldh1a3的慢病毒载体病毒转导阳性转染细胞。通过嘌罗霉素选择阳性转导子，并通过aldefluortm测定分析所得细胞。在异种移植实验中，通过心内注射将敲除-载体或敲除-aldh1a3或者野生型载体或野生型-aldh1a3细胞注射至小鼠中，并通过活体生物发光成像追踪骨转移生长。通过生物发光追踪无骨转移存活，并使用kaplan-meier模型作图。
图9a是流式细胞谱图，并且其显示sum159-m1a乳腺癌细胞中aldh1a3的基因敲除几乎消除了所述细胞中的aldefluortm活性并且可以通过用挽回载体转导所述细胞来挽回aldefluortm活性。图9b是相对于时间(天)的骨转移的折线图，如通过生物发光(ph/s)所测量的，并且其显示sum159-m1a乳腺癌细胞中aldh1a3的敲除减缓了骨转移生长。图9c是无骨转移存活随时间的kaplan-meier图，并且其显示sum159-m1a乳腺癌细胞中aldh1a3的敲除显著提高了存活时间。
aldh1a3的基因表达
通过病毒转导将编码三种人aldh基因aldh1a1、aldh1a3或aldh3a1之一的慢病毒载体引入到荧光素酶标记的sum159-m1b细胞中，随后通过嘌罗霉素进行阳性选择，并通过尾静脉注射将转导细胞注射到小鼠中。每周通过活体生物发光成像追踪肺转移生长一次。离体计数肺结节。
图8a是生物发光(ph/s)相对于时间(天)的折线图，并且其显示在注射了用编码三种aldh酶aldh1a1、aldh1a3和aldh3a1的载体转染的sum159-m1b细胞的小鼠中肺转移的发生。图8b是在图8a中所述的实验终点离体计数的肺结节的图。
存活预测
将tcga和kaplan-meierplotter(kmplot.com)数据用于产生表达数据和多种癌症与aldh1a3表达水平有关的存活曲线。根据中值表达值或最优划分值，通过高或低aldh1a3表达划分来自每个数据组的癌症患者。然后，将kaplan-meier分析用于绘制患者存活(无论测量无远端转移或整体存活)以评价患者间的aldh1a3相对水平和相应存活量度之间的关系。
图10a-10h是基于通过kmplot.com托管的数据分析工具，通过高(红色)和低(黑色)aldh1a3表达所划分的预后患者存活曲线，并且其显示了三阴乳腺癌患者的无远端转移存活(图10a)和与aldh1a3表达水平有关的肾脏透明细胞癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、肺鳞癌、结肠直肠癌和低级别胶质瘤癌症患者的整体存活(分别为图10b-10h)。
在另一组预测中，通过肿瘤类型和使用化疗的在先治疗离析了来自metabric临床乳腺癌数据组的aldh1a3的mrna表达。通过根据亚型的患者分类和通过中值aldh1a3表达的划分，产生了emc-msk数据组中的存活曲线。
图11a是来自metabric临床乳腺癌数据组的aldh1a3的mrna表达图，并且其显示了乳腺癌亚型的aldh1a3表达和化疗史。图11b是基于emc-msk数据组的预测存活曲线，并且其显示了按亚型和中值aldh1a3表达水平的乳腺癌患者的预测存活时间。
表5报告了衍生自kaplan-meierplotter数据库的雌激素受体-阴性(er)乳腺癌中的表达高aldh1a1或aldh1a3的患者的危险比(p-值)，并且包括处于发生转移的高风险的her2和三阴乳腺癌(tnbc)群。aldh1a3是er-阴性乳腺癌患者(该群体很可能发生转移)中的不良预后预测因子。
表5.衍生自kaplan-meierplotter数据库的er-阴性乳腺癌患者群中的表达高aldh1a1或aldh1a3的患者的危险比(p-值)
参考文献
1vasiliou，v.，thompson，d.c.，smith，c.，fujita，m.&chen，y.aldehydedehydrogenases：fromeyecrystallinstometabolicdiseaseandcancerstemcells.chembiolinteract202，2-10，doi：10.1016/j.cbi.2012.10.026s0009-2797(12)00233-5[pii](2013).
2dupe，v.etal.anewbornlethaldefectduetoinactivationofretinaldehydedehydrogenasetype3ispreventedbymaternalretinoicacidtreatment.procnatlacadsciusa100，14036-14041，doi：10.1073/pnas.23362231002336223100[pii](2003).
3anthony，t.e.&heintz，n.thefolatemetabolicenzymealdh1l1isrestrictedtothemidlineoftheearlycns，suggestingaroleinhumanneuraltubedefects.jcompneurol500，368-383，doi：10.1002/cne.21179(2007).
4ducker，g.s.etal.reversalofcytosolicone-carbonfluxcompensatesforlossofthemitochondrialfolatepathway.cellmetab24，640-641，doi：s1550-4131(16)30491-0[pii]10.1016/j.cmet.2016.09.011(2016).
5pappa，a.etal.humanaldehydedehydrogenase3a1inhibitsproliferationandpromotessurvivalofhumancornealepithelialcells.jbiolchem280，27998-28006，doi：m503698200[pii]10.1074/jbc.m503698200(2005).
6black，w.etal.molecularmechanismsofaldh3a1-mediatedcellularprotectionagainst4-hydroxy-2-nonenal.freeradicbiolmed52，1937-1944，doi：10.1016/j.freeradbiomed.2012.02.050s0891-5849(12)00156-6[pii](2012).
7blanco-gandia，m.c.&rodriguez-arias，m.pharmacologicaltreatmentsforopiateandalcoholaddiction：ahistoricalperspectiveofthelast50years.eurjpharmacol，doi：s0014-2999(18)30451-5[pii]10.1016/j.ejphar.2018.08.007(2018).
8rodriguez-torres，m.&allan，a.l.aldehydedehydrogenaseasamarkerandfunctionalmediatorofmetastasisinsolidtumors.clinexpmetastasis33，97-113，doi：10.1007/s10585-015-9755-910.1007/s10585-015-9755-9[pii](2016).
9plaisancie，j.etal.incompletepenetranceofbiallelicaldh1a3mutations.eurjmedgenet59，215-218，doi：10.1016/j.ejmg2016.02.004s1769-7212(16)30015-5[pii](2016).
10yao，h.etal.chd7repressestheretinoicacidsynthesisenzymealdh1a3duringinnereardevelopment.jciinsight3，doi：10.1172/jci.insight.9744097440[pii](2018).
11minkina，a.etal.retinoicacidsignalingisdispensableforsomaticdevelopmentandfunctioninthemammalianovary.devbiol424，208-220，doi：s0012-1606(16)30849-1[pii]10.1016/j.ydbio.2017.02.015(2017).
12wang，s.etal.aldh1a3correlateswithluminalphenotypeinprostatecancer.tumourbiol39，1010428317703652，doi：10.1177/1010428317703652(2017).
13kim-muller，j.y.etal.aldehydedehydrogenasela3definesasubsetoffailingpancreaticbetacellsindiabeticmice.natcommun7，12631，doi：10.1038/ncomms1263lncomms12631[pii](2016).
14shimamura，m.，karasawa，h.，sakakibara，s.&shinagawa，a.raldh3expressionindiabeticisletsreciprocallyregulatessecretionofinsulinandglucagonfrompancreaticislets.biochembiophysrescommun401，79-84，doi：10.1016/j.bbrc.2010.09.013s0006-291x(10)01688-8[pii](2010).
15berenguer，m.，lancman，j.j.，cunningham，t.j.，dong，p.d.s.&duester，g.mousebutnotzebrafishrequiresretinoicacidforcontrolofneuromesodermalprogenitorsandbodyaxisextension.devbiol441，127-131，doi：s0012-1606(18)30290-2[pii]10.1016/j.ydbio.2018.06.019(2018).
16niederreither，k.，subbarayan，v.，dolle，p.&chambon，p.embryonicretinoicacidsynthesisisessentialforearlymousepost-implantationdevelopment.natgenet21，444-448，doi：10.1038/7788(1999).
17feng，r.etal.retinoicacidhomeostasisthroughaldh1a2andcyp26a1mediatesmeioticentryinniletilapia(oreochromisniloticus).scirep5，10131，doi：10.1038/srep10131srep10131[pii](2015).
18hall，j.a.，grainger，j.r.，spencer，s.p.&belkaid，y.theroleofretinoicacidintoleranceandimmunity.immunity35，13-22，doi：10.1016/j.immuni.2011.07.002s1074-7613(11)00270-6[pii](2011).
19mucida，d.etal.reciprocalth17andregulatorytcelldifferentiationmediatedbyretinoicacid.science317，256-260，doi：1145697[pii]10.1126/science.1145697(2007).
20lee，s.w.etal.cuttingedge：4-1bbcontrolsregulatoryactivityindendriticcellsthroughpromotingoptimalexpressionofretinaldehydrogenase，jimmunol189，2697-2701，doi：10.4049/jimmunol.1201248jimmunol.1201248[pii](2012).
21zhu，b.etal.il-4andretinoicacidsynergisticallyinduceregulatorydendriticcellsexpressingaldh1a2.jimmunol191，3139-3151，doi：10.4049/jimmunol.1300329jimmunol.1300329[pii](2013).
22guilliams，m.etal.skin-draininglymphnodescontaindermis-derivedcd103(-)dendriticcellsthatconstitutivelyproduceretinoicacidandinducefoxp3(+)regulatorytcells.blood115，1958-1968，doi：10.1182/blood-2009-09-245274blood-2009-09-245274[pii](2010).
23spiegl，n.，didichenko，s.，mccaffery，p.，langen，h.&dahinden，c.a.humanbasophilsactivatedbymastcell-derivedil-3expressretinaldehydedehydrogenase-iiandproducetheimmunoregulatorymediatorretinoicacid.blood112，3762-3771，doi：10.1182/blood-2008-01-135251blood-2008-01-135251[pii](2008).
24fan，x.etal.targeteddisruptionofaldhla1(raldh1)providesevidenceforacomplexmechanismofretinoicacidsynthesisinthedevelopingretina.molcellbiol23，4637-4648(2003).
25bowles，j.etal.male-specificexpressionofaldh1a1inmouseandchickenfetaltestes：implicationsforretinoidbalanceingonaddevelopment.devdyn238，2073-2080，doi：10.1002/dvdy.22024(2009).
26levi，b.p.，yilmaz，o.h.，duester，g.&morrison，s.j.aldehydedehydrogenase1a1isdispensableforstemcellfunctioninthemousehematopoieticandnervoussystems.blood113，1670-1680，doi：10.1182/blood-2008-05-156752blood-2008-05-156752[pii](2009).
27chute，j.p.etal.inhibitionofaldehydedehydrogenaseandretinoidsignalinginducestheexpansionofhumanhematopoieticstemcells.procnatlacadsciusa103，11707-11712，doi：0603806103[pii]10.1073/pnas.0603806103(2006).
28cooper，t.t.etal.inhibitionofaldehydedehydrogenase-activityexpandsmultipotentmyeloidprogenitorcellswithvascularregenerativefunction.stemcells36，723-736，doi：10.1002/stem2790(2018).
29arnold，s.l.etal.importanceofaldh1aenzymesindetermininghumantesticularretinoicacidconcentrations.jlipidres56，342-357，
doi：10.1194/jlr.m054718jlr.m054718[pii](2015).
30kiefer，f.w.etal.retinaldehydedehydrogenase1regulatesathermogenicprograminwhiteadiposetissue.natmed18，918-925，doi：10.1038/nm.2757nm.2757[pii](2012).
31kim，j.i.etal.aldehydedehydrogenase1a1mediatesagabasynthesispathwayinmidbraindopaminergicneurons.science350，102-106，doi：10.1126/science.aac4690350/6256/102[pii](2015).
32ginestier，c.etal.aldh1isamarkerofnormalandmalignanthumanmammarystemcellsandapredictorofpoorclinicaloutcome.cellstemcell1，555-567，doi：10.1016/j.stem.2007.08.014s1934-5909(07)00133-6[pii](2007).
33charafe-jauffret，e.etal.aldehydedehydrogenase1-positivecancerstemcellsmediatemetastasisandpoorclinicaloutcomeininflammatorybreastcancer.clincancerres16，45-55，doi：10.1158/1078-0432.ccr-09-16301078-0432.ccr-09-1630[pii](2010).
34charafe-jauffret，e.etal.breastcancercelllinescontainfunctionalcancerstemcellswithmetastaticcapacityandadistinctmolecularsignature.cancerres69，1302-1313，doi：10.1158/0008-5472.can-08-27410008-5472.can-08-2741[pii](2009).
35brooks，m.d.，bumess，m.l.&wicha，m.s.therapeuticimplicationsofcellularheterogeneityandplasticityinbreastcancer.cellstemcell17，260-271，doi：10.1016/j.stem.2015.08.014s1934-5909(15)00369-0[pii](2015).
36marcato，p.etal.aldehydedehydrogenaseactivityofbreastcancerstemcellsisprimarilyduetoisoformaldh1a3anditsexpressionispredictiveofmetastasis.stemcells29，32-45，doi：10.1002/stem.563(2011).
37luo，y.etal.aldh1aisozymesaremarkersofhumanmelanomastemcellsandpotentialtherapeutictargets.stemcells30，2100-2113，doi：10.1002/stem.1193(2012).
38perez-alea，m.etal.aldh1a3isepigeneticallyregulatedduringmelanocytetransformationandisatargetformelanomatreatment.oncogene36，5695-5708，doi：10.1038/onc.2017.160onc2017160[pii](2017).
39sullivan，k.e.，rojas，k.，cerione，r.a.，nakano，i.&wilson，k.f.thestemcell/cancerstemcellmarkeraldh1a3regulatestheexpressionofthesurvivalfactortissuetransglutaminase，inmesenchymalgliomastemcells.oncotarget8，22325-22343，doi：10.18632/oncotarget.1647916479[pii](2017).
40flahaut，m.etal.aldehydedehydrogenaseactivityplaysakeyroleintheaggressivephenotypeofneuroblastoma.bmccancer16，781，doi：10.1186/s12885-016-2820-110.1186/s12885-016-2820-1[pii](2016).
41mao，p.etal.mesenchymalgliomastemcellsaremaintainedbyactivatedglycolyticmetabolisminvolvingaldehydedehydrogenase1a3.procnatlacadsciusa110，8644-8649，doi：10.1073/pnas.12214781101221478110[pii](2013).
42wu，w.etal.aldehydedehydrogenase1a3(aldh1a3)isregulatedbyautophagyinhumanglioblastomacells.cancerlett417，112-123，doi：s0304-3835(18)30009-0[pii]10.1016/j.canlet.2017.12.036(2018).
43zhang，w.etal.aldh1a3：amarkerofmesenchymalphenotypeingliomasassociatedwithcellinvasion.plosone10，e0142856，doi：10.1371/journal.pone.0142856pone-d-15-27556[pii](2015).
44cheng，p.etal.foxd1-aldh1a3signalingisadeterminantfortheself-renewalandtumorigenicityofmesenchymalgliomastemcells.cancerres76，7219-7230，doi：0008-5472.can-15-2860[pii]10.1158/0008-5472.can-15-2860(2016).
45shao，c.etal.essentialroleofaldehydedehydrogenase1a3forthemaintenanceofnon-smallcelllungcancerstemcellsisassociatedwiththestat3pathway.clincancerres20，4154-4166，doi：10.1158/1078-0432.ccr-13-32921078-0432.ccr-13-3292[pii](2014).
46yun，x.etal.targetingusp22suppressestumorigenicityandenhancescisplatinsensitivitythroughaldh1a3downregulationincancer-initiatingcellsfromlungadenocarcinoma.molcancerres16，1161-1171，doi：10.1158/1541-7786.mcr-18-00421541-7786.mcr-18-0042[pii](2018).
47jia，j.etal.anintegratedtranscriptomeandepigenomeanalysisidentifiesanovelcandidategeneforpancreaticcancer.bmcmedgenomics6，33，doi：10.1186/1755-8794-6-331755-8794-6-33[pii](2013).
48kim，i.g.，lee，j.h.，kim，s.y.，kim，j.y.&cho，e.w.fibulin-3negativelyregulatesaldh1viac-metsuppressionandincreasesgamma-radiation-inducedsensitivityinsomepancreaticcancercelllines.biochembiophysrescommun454，369-375，doi：10.1016/j.bbrc.2014.10.084s0006-291x(14)01893-2[pii](2014).
49golubovskaya，v.etal.down-regulationofaldh1a3，cd44ormdr1sensitizesresistantcancercellstofakautophosphorylationinhibitory15.jcancerresclinoncol141，1613-1631，doi：10.1007/s00432-015-1924-3(2015).
50canino，c.etal.astat3-nfkb/ddit3/cebpbetaaxismodulatesaldh1a3expressioninchemoresistantcellsubpopulations.oncotarget6，12637-12653，doi：3703[pii]10.18632/oncotarget.3703(2015).
51cortes-dericks，l.，froment，l.，boesch，r.，schmid，r.a.&karoubi，g.cisplatin-resistantcellsinmalignantpleuralmesotheliomacelllinesshowaldh(high)cd44(+)phenotypeandsphere-formingcapacity.bmccancer14，304，doi：10.1186/1471-2407-14-3041471-2407-14-304[pii](2014).
52dimartino，s.etal.hsp90inhibitionaltersthechemotherapy-drivenrearrangementoftheoncogenicsecretome.oncogene37，1369-1385，doi：10.1038/s41388-017-0044-810.1038/s41388-017-0044-8[pii](2018).
53casanova-salas，i.etal.mir-187targetstheandrogen-regulatedgenealdh1a3inprostatecancer.plosone10，e0125576，doi：10.1371/journal.pone.0125576pone-d-14-46743[pii](2015).
54kashii-magaribuchi，k.etal.inducedexpressionofcancerstemcellmarkersaldh1a3andsox-2inhierarchicalreconstitutionofapoptosis-resistanthumanbreastcancercells.actahistochemcytochem49，149-158，doi：10.1267/ahc.16031jst.jstage/ahc/16031[pii](2016).
55marcato，p.etal.aldehydedehydrogenase1a3influencesbreastcancerprogressionviadifferentialretinoicacidsignaling.moloncol9，17-31，doi：10.1016/j.molonc2014.07.010s1574-7891(14)00165-3[pii](2015).
56thomas，m.l.etal.citralreducesbreasttumorgrowthbyinhibitingthecancerstemcellmarkeraldh1a3.moloncol10，1485-1496，doi：s1574-7891(16)30085-0[pii]10.1016/j.molonc.2016.08.004(2016).
57chen，m.h.etal.aldh1a3，themajoraldehydedehydrogenaseisoforminhumancholangiocarcinomacells，affectsprognosisandgemcitabineresistanceincholangiocarcinomapatients.clincancerres22，4225-4235，doi：10.1158/1078-0432.ccr-15-18001078-0432.ccr-15-1800[pii](2016).
58zhang，w.etal.genome-widednamethylationprofilingidentifiesaldh1a3promotermethylationasaprognosticpredictoring-cimp-primaryglioblastoma.cancerlett328，120-125，doi：10.1016/j.canlet.2012.08.033s0304-3835(12)00534-4[pii](2013).
59yang，z.l.etal.positivealdh1a3andnegativegpx3expressionsarebiomarkersforpoorprognosisofgallbladdercancer.dismarkers35，163-172，doi：10.1155/2013/187043(2013).
60trasino，s.e.，harrison，e.h.&wang，t.t.androgenregulationofaldehydedehydrogenase1a3(aldh1a3)intheandrogen-responsivehumanprostatecancercelllinelncap.expbiolmed(maywood)232，762-771，doi：232/6/762[pii](2007).
61coyle，k.m.etal.breastcancersubtypedictatesdnamethylationandaldh1a3-mediatedexpressionoftumorsuppressorrarres1.oncotarget7，44096-44112，doi：10.18632/oncotarget.98589858[pii](2016).
62croker，a.k.etal.differentialfunctionalrolesofaldh1a1andaldh1a3inmediatingmetastaticbehaviorandtherapyresistanceofhumanbreastcancercells.intjmolsci18，doi：e2039[pii]10.3390/ijms18102039ijms18102039[pii](2017).
63shimamura，m.，kurashige，t.，mitsutake，n.&nagayama，y.aldehydedehydrogenaseactivityplaysnofunctionalroleinstemcell-likepropertiesinanaplasticthyroidcancercelllines.endocrine55，934-943，doi：10.1007/s12020-016-1224-y10.1007/s12020-016-1224-y[pii](2017).
64moreb，j.s.etal.aldhisozymesdownregulationaffectscellgrowth，cellmotilityandgeneexpressioninlungcancercells.molcancer7，87，doi：10.1186/1476-4598-7-871476-4598-7-87[pii](2008).
65moreb，j.s.etal.theenzymaticactivityofhumanaldehydedehydrogenases1a2and2(aldh1a2andaldh2)isdetectedbyaldefluor，inhibitedbydiethylaminobenzaldehydeandhassignificanteffectsoncellproliferationanddrugresistance.chembiolinteract195，52-60，doi：10.1016/j.cbi.2011.10.007s0009-2797(11)00311-5[pii](2012).
66liu，y.etal.aldh1a1mrnaexpressioninassociationwithprognosisoftriple-negativebreastcancer.oncotarget6，41360-41369，doi：10.18632/oncotarget.60236023[pii](2015).
67tomita，h.，tanaka，k.，tanaka，t.&hara，a.aldehydedehydrogenase1a1instemcellsandcancer.oncotarget7，11018-11032，doi：10.18632/oncotarget.69206920[pii](2016).
68koppaka，v.etal.aldehydedehydrogenaseinhibitors：acomprehensivereviewofthepharmacology，mechanismofaction，substratespecificity，andclinicalapplication.pharmacolrev64，520-539，doi：10.1124/pr.111.005538pr.111.005538[pii](2012).
69yasgar，a.etal.ahigh-contentassayenablestheautomatedscreeningandidentificationofsmallmoleculeswithspecificaldh1a1-inhibitoryactivity.plosone12，e0170937，doi：10.1371/journal.pone.0170937pone-d-16-39942[pii](2017).
70gibb，z.，lambourne，s.r.，curry，b.j.，hall，s.e.&aitken，r.j.aldehydedehydrogenaseplaysapivotalroleinthemaintenanceofstallionspermmotility.biolreprod94，133，doi：10.1095/biolreprod.116.140509biolreprod.116.140509[pii](2016).
71kurth，i.etal.cancerstemcellrelatedmarkersofradioresistanceinheadandnecksquamouscellcarcinoma.oncotarget6，34494-34509，doi：10.18632/oncotarget.54175417[pii](2015).
72piskounova，e.etal.oxidativestressinhibitsdistantmetastasisbyhumanmelanomacells.nature527，186-191，doi：10.1038/nature15726nature15726[pii](2015).
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