用于检测人乳头状瘤病毒(HPV)的测定的制作方法

用于检测人乳头状瘤病毒(hpv)的测定
1.对相关申请的交叉引用本专利申请要求于2018年12月18日提交的美国临时专利申请号62/781,230的权益，所述美国临时专利申请通过引用并入本文。
2.引入作为参考的以电子方式提交的材料以其整体通过引用并入本文的是与此同时提交并如下标识的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：于2019年12月18日创建、命名为"37420
‑
601_st25.txt"的一个10,773字节ascii(文本)文件。


背景技术：

3.乳头状瘤病毒是感染人和动物的皮肤和粘膜的dna病毒。已鉴定了大约130个类型的人乳头状瘤病毒(hpv)，其中30
‑
40个类型通过性接触传播并感染肛门生殖器区。这些hpv类型中的一些导致生殖器疣，而其它类型并不导致任何明显的感染迹象。至少14种hpv基因型已与宫颈癌的高风险相关，即基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。因此，这些高风险类型的hpv的检测在宫颈癌的预防中是重要的。
4.所有hpv基因型的基因组都共享相似的组构，并且编码几种早期(e)和晚期(l)蛋白。e1和e2蛋白是dna复制所需要的。e4和e5蛋白是上皮的上层中的病毒基因组复制所需要的。e6和e7蛋白是致癌的，并且协作以使细胞永生化并诱导基因组不稳定性。l1和l2蛋白形成病毒衣壳，并且在上皮的上层感染的后期表达。基因组的长控制区(lcr)含有病毒基因组的正确复制和病毒基因的表达所需的大部分调控dna序列。
5.已开发了用于检测高风险类型的hpv的各种方法，其中许多方法依赖hpv基因组中的独特序列检测(参见例如，美国专利4,849,332；5,364,758；5,705,627；6,265,154；和9,090,948；以及kleter，b.等人，am. j. of pathology，153(6): 1731
‑
39(1998))。然而，仍然需要hpv检测方法和系统，其：(i)能够在单个反应中检测多种hpv基因型，同时将某些特定基因型的检测与其它基因型的检测区别开(例如，部分基因分型)，(ii)以消除或减少贮存要求和pcr试剂浪费的形式提供，并且(iii)可以快速执行。本公开内容提供了此类方法和系统。


技术实现要素：

6.本公开内容提供了用于扩增且检测样品中的基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68的人乳头状瘤病毒(hpv)的寡核苷酸序列集合。该集合包含：(a)包含seq id no: 1、seq id no: 2、seq id no: 3和seq id no: 4的正向引物寡核苷酸序列；(b)包含seq id no: 5和seq id no: 6的反向引物寡核苷酸序列；(c)包含seq id no: 7或seq id no: 25的第一探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型16特异性杂交；(d)包含seq id no: 8的第二探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型18特异性杂交；(e)包含seq id no: 9或seq id no: 26的第三探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型31特异性杂交；(f)包含seq id no: 10或seq id no: 27的第四探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型33特异性杂交；(g)包含
seq id no: 11的第五探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型45特异性杂交；(h)包含seq id no: 12或seq id no: 28的第六探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型52特异性杂交；(i)包含seq id no: 13或seq id no: 29的第七探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型58特异性杂交；(j)包含seq id no: 14的第八探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型35特异性杂交；(k)包含seq id no: 15或seq id no: 30的第九探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型39特异性杂交；(l)包含seq id no: 16或seq id no: 31的第十探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型51特异性杂交；(m)包含seq id no: 17或seq id no: 32的第十一探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型56特异性杂交；(n)包含seq id no: 18的第十二探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型59特异性杂交；(o)包含seq id no: 19的第十三探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型66特异性杂交；(p)包含seq id no: 20的第十四探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型68a特异性杂交；以及(q)包含seq id no: 21的第十五探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型68b特异性杂交，其中(c)
‑
(q)的探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。
7.本公开内容还提供了包含上述引物和探针集合的试剂盒，以及用于检测样品中的基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68的hpv的方法。
具体实施方式
8.本公开内容至少部分地基于引物和探针寡核苷酸序列的集合的开发，所述集合可以在单一反应中快速检测十四种高风险hpv基因型。使用快速样品制备化学和快速pcr化学来实现快速周转时间。另外，与其它核酸测试不同，本文所述的测定与冻干相容，消除了冷冻贮存的需要。与冻干的相容性还允许以单位剂量形式的测定递送，使得用户可以运行应用所需的确切数目的测试，伴随减少的pcr试剂浪费。
9.本公开内容提供了用于扩增且检测样品中的人乳头状瘤病毒(hpv)的寡核苷酸集合。如本文使用的，术语“寡核苷酸”指包含约2至约100个核苷酸(例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100个核苷酸，或由任何前述值限定的范围)的短核酸序列。如本文使用的，术语“核酸”和“多核苷酸”指任何长度的核苷酸的聚合形式，或核糖核苷酸(rna)或脱氧核糖核苷酸(dna)。这些术语指分子的一级结构，并且因此包括双链和单链dna、以及双链和单链rna。该术语包括作为等价物的由核苷酸类似物和修饰的多核苷酸(例如甲基化和/或加帽的多核苷酸)制备的rna或dna的类似物。核酸通常经由磷酸酯键连接，以形成核酸序列或多核苷酸，尽管许多其它键合是本领域已知的(例如硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)等等)。
10.寡核苷酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列两者的部分。寡核苷酸可以是dna、基因组和互补dna (cdna)两者、rna或杂交体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。寡核苷酸可以通过化学合成方法或重组方法获得。
11.引物和探针寡核苷酸寡核苷酸用于生物技术中的各种应用中，例如人工基因合成、作为聚合酶链反应(pcr)引物、dna测序中以及作为分子探针。在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸可以用作用于核酸扩增的引物或用作用于核酸杂交和检测的探针。如本文使用的，术语“引物”、
“
引物序列”和“引物寡核苷酸”指这样的寡核苷酸，当在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如，dna依赖性或rna依赖性聚合酶)的存在下，置于合适的扩增条件(例如缓冲液、盐、温度和ph)下时，所述寡核苷酸能够充当引物延伸产物的合成起始点，所述引物延伸产物是核酸(所有类型的dna或rna)的互补链。引物可以是单链或双链的。如果是双链的，则引物可以首先进行处理(例如，变性)，以允许其链在用于制备延伸产物前的分开。这种变性步骤通常使用热执行，但可以可替代地使用碱，随后为中和来进行。本公开内容的引物可以具有任何合适的大小，并且期望地包含约15至50个核苷酸，优选约20至40个核苷酸，且更优选约22至30个核苷酸，基本上由其组成或由其组成。除本文所述的那些之外，本公开内容的引物还可以含有另外的核苷酸。例如，取决于所采用的扩增方法的类型，引物可以包括例如对于靶结合序列5'的限制性内切核酸酶识别位点(参见例如，美国专利5,270,184和5,455,166)，或与引物的靶结合序列连接的rna聚合酶启动子。“正向引物”是与用于扩增的靶核酸序列(例如模板链)杂交(或退火)的引物。“反向引物”是在扩增过程中，与靶序列的互补链杂交(或退火)的引物。正向引物与相对于反向引物5'的靶序列杂交。
12.术语“探针”、“探针序列”和“探针寡核苷酸”指这样的寡核苷酸，其可以在适当的杂交条件下，与靶序列的至少一部分(例如，已扩增的靶序列的一部分)选择性杂交。一般而言，探针序列被鉴定为“互补的”(即，与编码链或有义链(+)互补)、或“反向互补的”(即，与反义链(
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)互补)。本公开内容的探针可以具有任何合适的大小，并且期望地包含约10
‑
50个核苷酸，优选约12
‑
35个核苷酸，且更优选约14
‑
25个核苷酸，基本上由其组成或由其组成。
13.如本文使用的，术语“集合”、“引物集合”、“探针集合”和“引物和探针集合”指两个或更多个寡核苷酸引物，其一起能够引发目的靶序列或靶核酸(例如，hpv内的靶序列)和/或至少一种探针的扩增，所述至少一种探针可以检测靶序列或靶核酸。在某些实施方案中，术语“引物集合”指一对引物，其包括与待扩增的靶序列或靶核酸的5'端杂交的正向引物(或5'(上游)引物)、以及与待扩增的靶序列或靶核酸的互补体杂交的反向引物(或3'(下游)引物)。在其它实施方案中，引物和探针集合可以包括多种引物和探针，其可以扩增且检测来自单一毒株或类型的生物的多种靶核酸序列(例如，来自hpv16的两个或更多个早期和/或晚期基因)、或者存在于不同毒株或类型的多种生物中的单个靶核酸(例如，hpv16、hpv18和hpv45的l1区)。
14.本文所述的寡核苷酸集合可以用于扩增且检测样品中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种)靶hpv核酸序列。术语“靶序列”和“靶核酸”在本文中可互换使用，并且指特定的核酸序列，其存在或不存在待通过所公开的方法进行检测。在本公开内容的上下文中，靶序列优选包括一种或多种引物将与其杂交并且扩增将从其开始的核酸序列。靶序列还可以包括探针杂交区，在适当的扩增条件下，探针可以与所述探针杂交区形成稳定的杂交体。靶序列可以是单链或双链的。本文所述的引物和探针序列可以靶向样品中存在的单一hpv基因型、或多种hpv基因型或毒株的基因组中存在的任何合适的核酸序列或序列的组合。
15.所有hpv都是无包膜的双链dna病毒。它们的基因组是环状的且大小为大约8千碱基对。大多数编码八种主要蛋白质，其中六种位于“早期”区中，且其中两个位于“晚期”区中(参见例如，graham，s.v.，future microbiol.，5(10): 1493
‑
1506(2010))。“早期”蛋白质具有调控功能，并且涉及例如hpv基因组复制和转录、细胞周期的控制、细胞信号传导和细
胞凋亡、免疫调节和受感染细胞的结构修饰。大多数早期蛋白质在感染周期自始至终表达。e4是感染晚期表达的第一种病毒蛋白质(doorbar等人，virol.，238:40
‑
52(1997))，随后为晚期蛋白质l1和l2，其在上皮的颗粒层中特异性表达。l1和l2蛋白包含病毒衣壳，其对于环境中的病毒传播、扩散和生存所需要的。hpv16和hpv18导致约70%的宫颈癌，并且通过性接触直接传播。本文所述的寡核苷酸集合可以包含任何数目的引物和探针寡核苷酸、基本上由其组成或由其组成，以便扩增且检测来自hpv基因型中的任何一种或组合的任何合适数目的hpv核酸序列，例如hpv基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68，或其组合。在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸集合包含引物以及与hpv扩增子杂交的探针、基本上由其组成或由其组成，所述引物扩增hpv基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68中的任何一种或其组合的基因组的l1基因区的至少一部分，以产生对应于样品中存在的每种hpv基因型的单一hpv扩增子。在这点上，引物和探针寡核苷酸序列理想地对于存在于样品中的各种hpv基因型(即，hpv类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68)是特异性的。如本文使用的，术语“扩增子”指天然或人工扩增反应的产物。核酸序列的“一部分”包含至少十个核苷酸(例如，约10至约5000个核苷酸)。优选地，核酸序列的“一部分”包含10个或更多(例如，15个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多、40个或更多、45个或更多、50个或更多、或者100个或更多)核苷酸，但少于5,000个(例如，4900个或更少、4000个或更少、3000个或更少、2000个或更少、1000个或更少、800个或更少、500个或更少、300个或更少、或者100个或更少)核苷酸。
16.在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸集合包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)包含seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4的正向引物寡核苷酸序列；(b)包含seqidno:5和seqidno:6的反向引物寡核苷酸序列；(c)包含seqidno:7或seqidno:25的第一探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型16特异性杂交；(d)包含seqidno:8的第二探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型18特异性杂交；(e)包含seqidno:9或seqidno:26的第三探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型31特异性杂交；(f)包含seqidno:10或seqidno:27的第四探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型33特异性杂交；(g)包含seqidno:11的第五探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型45特异性杂交；(h)包含seqidno:12或seqidno:28的第六探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型52特异性杂交；(i)包含seqidno:13或seqidno:29的第七探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型58特异性杂交；(j)包含seqidno:14的第八探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型35特异性杂交；(k)包含seqidno:15或seqidno:30的第九探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型39特异性杂交；(l)包含seqidno:16或seqidno:31的第十探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型51特异性杂交；(m)包含seqidno:17或seqidno:32的第十一探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型56特异性杂交；(n)包含seqidno:18的第十二探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型59特异性杂交；(o)包含seqidno:19的第十三探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型66特异性杂交；(p)包含seqidno:20的第十四探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型68a特异性杂交；以及(q)包含seqidno:21的第十五探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型68b特异性杂交。上述寡核苷酸集合也称为alinitym
™
highrisk(hr)hpvassay。
17.可以以任何合适的方式修饰本文所述的寡核苷酸中的任何一种或组合，以便稳定
或增强引物或探针寡核苷酸对于其靶的结合亲和力(也称为“解链温度”或“t
m”)。在这方面，如本文所述的寡核苷酸序列可以包含一个或多个修饰的寡核苷酸碱基。例如，寡核苷酸序列可以包含一个或多个丙炔修饰的碱基，其中所述寡核苷酸包含具有化学式ch3c≡ch的炔烃。一个或多个丙炔修饰的碱基可以包括例如5
‑
(1
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丙炔基)
‑
2'
‑
脱氧
‑
尿苷(pdu)和/或5
‑
(1
‑
丙炔基)
‑
2'
‑
脱氧胞苷(pdc)。在一些实施方案中，例如，上述某些探针寡核苷酸序列可以包含如表1中所示的丙炔修饰的序列。
18.表1.丙炔修饰的探针寡核苷酸序列本文所述的任何一种寡核苷酸序列可以包含本文公开的任何序列的互补体、基本上由其组成或由其组成。如本文使用的，术语“互补体”或“互补序列”指这样的核酸序列，其经由沃森
‑
克里克碱基配对规则，与本文所述的寡核苷酸形成稳定双链体，并且通常与所公开的寡核苷酸共享约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%或更大的同一性。核酸序列同一性可以使用本领域已知的任何合适的数学算法或计算机软件进行确定，例如clustal
‑
w、t
‑
coffee和align(用于核酸序列和氨基酸序列的比对)、blast程序(例如，blast2.1、bl2seq及其以后版本)、以及fasta程序(例如，fasta3
×
、fastm和ssearch)(用于序列比对和序列相似性搜索)。序列比对算法也公开于例如以下中：altschul等人，j.molecularbiol.，215(3):403
‑
410(1990)；beigert等人，proc.natl.acad.sci.usa，106(10):3770
‑
3775(2009)，durbin等人，编辑，biologicalsequenceanalysis:probalisticmodelsofproteinsandnucleicacids，cambridgeuniversitypress，cambridge，uk(2009)；soding，bioinformatics，21(7):951
‑
960(2005)；altschul等人，nucleicacidsres.，25(17):3389
‑
3402(1997)；以及gusfield，algorithmsonstrings，treesandsequences，cambridgeuniversitypress，cambridgeuk(1997))。
19.本文所述的寡核苷酸可以使用任何合适的方法进行制备，多种所述方法是本领域已知的(参见例如，sambrook等人，molecularcloning.alaboratorymanual，1989，2.supp.ed.，coldspringharbourlaboratorypress:newyork，n.y.；m.a.innis(编辑)，pcrprotocols.aguidetomethodsandapplications，academicpress:new
york，n.y.(1990)；p.tijssen，hybridizationwithnucleicacidprobes
‑
laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(partsiandii)，elsevierscience(1993)；m.a.innis(编辑)，pcrstrategies，academicpress:newyork，n.y.(1995)；以及f.m.ausubel(编辑)，shortprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons:secaucus，n.j.(2002)；narang等人，meth.enzymol.，68:90
‑
98(1979)；brown等人，meth.enzymol.，68:109
‑
151(1979)；以及belousov等人，nucleicacidsres.，25:3440
‑
3444(1997))。还可以使用各种工具来设计引物对，所述工具例如由美国国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation)(ncbi)提供的primer
‑
blast工具。寡核苷酸合成可以在寡核苷酸合成仪上执行，所述寡核苷酸合成仪例如从perkinelmer/appliedbiosystems，inc.(fostercity，ca)、dupont(wilmington，de)或milligen(bedford，ma)商购可得的那些合成仪。可替代地，寡核苷酸可以是从本领域众所周知的各种商业来源定制制备并获得的，所述商业来源包括例如midlandcertifiedreagentcompany(midland，tx)、eurofinsscientific(louisville，ky)、biosearchtechnologies，inc.(novato，ca)等等。寡核苷酸可以使用本领域已知的任何合适的方法进行纯化，所述方法例如天然丙烯酰胺凝胶电泳、阴离子交换hplc(参见例如，pearson等人，j.chrom.，255:137
‑
149(1983))、以及反相hplc(参见例如，mcfarland等人，nucleicacidsres.，7:1067
‑
1080(1979))。
20.可以使用本领域已知的任何合适的测序方法来验证引物和探针的序列，所述测序方法包括但不限于化学降解(参见例如，maxam等人，methodsofenzymology，65:499
‑
560(1980))、基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi
‑
tof)、质谱法(参见例如，pieles等人，nucleicacidsres.，21:3191
‑
3196(1993))、在碱性磷酸酶和外切核酸酶消化的组合后的质谱法(wu等人，anal.biochem.，290:347
‑
352(2001))等等。
21.本文所述的引物和探针寡核苷酸期望地包含在45℃至80℃范围内的解链温度(t
m
)。依据本公开内容，寡核苷酸与靶hpv核酸序列特异性杂交，而不显示出与非hpv核酸的显著杂交。另外，选择寡核苷酸，使得它们与hpv基因组中的保守区域杂交，因此使与靶序列的错配降到最低。这种选择确保寡核苷酸能够与来自所有基因型和亚型的hpv核酸杂交。此外，选择寡核苷酸，使得它们显示了二聚体形成的最小可能性并且含有最低限度的序列重复。此类性质可以通过本领域已知的方法进行确定，例如，使用计算机建模程序oligo
®
primeranalysissoftware(nationalbiosciences，inc.，plymouth，minn.)。
22.可检测标记本文所述的任何一种或多种引物和探针寡核苷酸序列可以包含可检测标记，使得引物和/或探针在与另一个实体(例如，扩增产物或扩增子)结合之后可以得到显现。在一个实施方案中，本文所述的探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。如本文使用的，术语“可检测标记”指生成信号的部分或化合物，所述信号可以进行测量，并且其强度和与其结合的实体的量有关(例如，成比例)。可以使用任何合适的可检测标记，其可以与寡核苷酸缀合或连接，以便检测寡核苷酸与靶序列的结合，所述可检测标记中的许多是本领域已知的。在一个实施方案中，可检测标记可以间接地进行检测。可间接检测的标记通常是与“缀合物”结合使用的特异性结合成员，所述“缀合物”与可直接检测的标记附着或偶联。用于合成此类缀合物的偶联化学是本领域众所周知的，并且设计为使得特异性结合成员的特异性结合性
质和标记的可检测性质保持完整。如本文使用的，“特异性结合成员”和“缀合物”指结合对的两个成员，即两种不同的分子，其中特异性结合成员与本公开内容的多核苷酸特异性结合，并且“缀合物”与特异性结合成员特异性结合。该对的两个成员之间的结合通常在性质中是化学或物理的。此类结合对的实例包括但不限于抗原和抗体、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白和生物素、半抗原和对于半抗原特异性的抗体、互补核苷酸序列、酶辅因子/底物和酶等等。
23.在另一个实施方案中，可检测标记可以直接地进行检测。这种可直接检测的标记包括例如放射性同位素、荧光团、化学发光团、酶、胶体颗粒、荧光微粒、嵌入染料(例如，sybrgreen或溴化乙锭)等等。在一个实施方案中，可检测标记可以是荧光团，例如荧光素家族染料、多卤代荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花青家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯合镧系元素家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料或bodipy
®
家族染料。荧光团的实例包括但不限于fam
™
、cal
‑
fluor
®
、quasar
®
、hex
™
、joe
™
、ned
™
、pet
®
、rox
™
、tamra
™
、tet
™
、texasred
®
和vic
®
。本领域技术人员将了解，可直接检测的标记可能需要另外的组分，例如底物、触发试剂、光等等，以允许标记的检测。用于标记寡核苷酸例如探针的方法是本领域众所周知的，并且在例如以下中进行描述：l.j.kricka，ann.clin.biochem.，39:114
‑
129(2002)；vangijlswijk等人，expertrev.mol.diagn.，1:81
‑
91(2001)；joos等人，j.biotechnol.，35:135
‑
153(1994)；smith等人，nucl.acidsres.，13:2399
‑
2412(1985)；connoly等人，nucl.acids.res.，13:4485
‑
4502(1985)；broker等人，nucl.acidsres.，5:363
‑
384(1978)；bayer等人，methodsofbiochem.analysis，26:1
‑
45(1980)；langer等人，proc.natl.acad.sci.usa，78:6633
‑
6637(1981)；richardson等人，nucl.acidsres.，11:6167
‑
6184(1983)；brigati等人，virol.，126:32
‑
50(1983)；tchen等人，proc.natl.acad.sci.usa，81:3466
‑
3470(1984)；landegent等人，exp.cellres.，15:61
‑
72(1984)；a.h.hopman等人，exp.cellres.，169:357
‑
368(1987)；以及temsamani等人，mol.biotechnol.，5:223
‑
232(1996)。
24.在另一个实施方案中，本文所述的任何一种或多种引物和探针寡核苷酸序列也可以包含猝灭剂部分。当可检测标记(例如荧光团)和猝灭剂部分例如在探针的端部处保持紧密接近时，猝灭剂部分阻止来自可检测标记的信号(例如荧光)的检测。当两个部分在物理上分开时，例如在被dna聚合酶切割后，信号变得可检测。猝灭剂可以选自本领域已知的任何合适的猝灭剂，例如，blackholequencher
®
1(bhq
‑1®
)、blackholequencher
®
2(bhq
‑2®
)、iowablack
®
fq和iowablack
®
rq。例如，寡核苷酸探针可以包含fam荧光团、cal
‑
fluor
®
或quasar荧光团和bhq
‑
1或bhq
‑
2猝灭剂。
25.探针寡核苷酸序列各自期望地包含可检测标记。探针各自可以用相同的可检测标记或不同的可检测标记进行标记。在一些实施方案中，一组本文描述的两种或更多种探针寡核苷酸可以包含相同的可检测标记，形成第一标记“组”，而第二标记“组”可以由一组本文所述的两种或更多种其它探针寡核苷酸组成，所述探针寡核苷酸各自包含相同的标记，但与第一标记组的标记不同。例如，在一个实施方案中，(i)本文所述的第一探针寡核苷酸序列、第二探针寡核苷酸序列和第五探针寡核苷酸序列各自可以包含不同的可检测标记，(ii)第三探针寡核苷酸序列、第四探针寡核苷酸序列、第六探针寡核苷酸序列和第七探针
寡核苷酸序列各自包含相同的可检测标记，和/或(iii)第八探针寡核苷酸到第十五探针寡核苷酸各自包含相同的可检测标记，并且(i)、(ii)和(iii)的可检测标记是不同的。在其它实施方案中，本文所述的所有探针都可以包含相同的可检测标记(例如，fam)，使得在实时pcr期间，hpv靶序列的扩增被检测为单一信号。当采用不同的可检测标记时，一种或多种hpv靶序列的扩增被检测为多种分开的信号，每种信号对应于特定的标记。
26.特定标记技术的选择将取决于几种因素，例如标记方法的容易和成本、使用的不同可检测标记之间的光谱间距、所需的样品标记质量、可检测部分对杂交反应(例如，杂交过程的速率和/或效率)的作用、使用的扩增方法的性质、检测系统的性质、由可检测标记生成的信号的性质和强度等等。
27.内部对照上述用于检测hpv基因型的寡核苷酸集合可以进一步包含用于扩增且检测内部对照(ic)序列的引物和探针寡核苷酸序列。在一个实施方案中，将内部对照序列加入每个样品制备反应中。然后在整个样品制备和扩增程序自始至终，连同测试样品和校准物(如果存在的话)一起处理内部对照，以证实正确的样品处理和测定有效性。内部对照可以是任何合适的非hpv核酸序列，包括例如编码gapdh、β2
‑
微球蛋白、β
‑
肌动蛋白、r18或16s rna的核酸序列。在一个实施方案中，例如，内部对照包含衍生自或得自人β
‑
珠蛋白基因的dna序列。在这点上，本文所述的寡核苷酸集合可以进一步包括包含seq id no: 22 (5'
‑
gttggtatcaaggttac
‑
3')的内部对照正向引物寡核苷酸序列、包含seq id no: 23 (5'
‑
cctaagggtgggaaaatagacc
‑
3')的内部对照反向引物寡核苷酸序列、以及包含seq id no: 24 (5'
‑
tttctgataggcactgactctctctgcc
‑
3')的内部对照探针寡核苷酸序列。内部对照探针期望地包含可检测标记，例如本文所述的那些中的任一种。在一个实施方案中，内部对照探针可以包含与用于检测hpv的探针不同的标记，这允许在同一反应内同时检测和区别内部对照和hpv扩增产物。在一个实施方案中，内部对照探针寡核苷酸序列的可检测标记是香豆素家族染料，例如香豆素47(c47)。内部对照探针还可以包含猝灭剂部分，例如本文所述的那些猝灭剂部分。
28.用于扩增且检测人乳头状瘤病毒的方法本公开内容提供了用于检测疑似含有hpv的样品中的基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68的hpv的方法。该方法包括：(a)使得自人的样品与本文所述的寡核苷酸序列集合以及用于扩增和检测核酸序列的试剂接触，(b)扩增样品中存在的一种或多种靶hpv核酸序列，(c)使一种或多种寡核苷酸探针与一种或多种扩增的靶hpv核酸序列杂交，(d)通过评价来自各可检测标记的信号来检测一种或多种探针寡核苷酸序列与一种或多种扩增的靶hpv核酸序列的杂交，由此(i)一种或多种信号的存在指示一种或多种探针寡核苷酸序列与一种或多种靶hpv核酸序列的杂交，以及样品中存在基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68 hpv，并且(ii)信号的不存在指示样品中不存在hpv。本文关于上述寡核苷酸集合阐述的引物和探针寡核苷酸的描述也适用于所公开方法的那些相同方面。
29.如本文定义的，如果样品得自疑似感染hpv的受试者优选人，则样品“疑似”含有基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68中的任何一种或组合的hpv。如果受试者具有关于hpv的增加风险，则该受试者被怀疑感染hpv。hpv风险因素包括但不限于性
伴侣的数目(例如，更多的性伴侣增加hpv风险)、年龄(例如，儿童处于寻常疣的更高风险中，而青少年和年轻人处于生殖器疣的更高风险中)、免疫系统减弱、皮肤受损和个人接触(例如，触摸疣)。
30.样品可以是从任何合适的受试者获得的任何合适的样品，所述受试者通常是哺乳动物(例如，犬、猫、兔、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、猪、马、非人灵长类动物或人)。优选地，受试者是人。样品可以得自任何生物来源，例如宫颈、阴道或肛门拭子或刷子(例如，经由巴氏涂片)，或生理流体，包括但不限于全血、血清、血浆、间质液、唾液、晶状体液、脑脊髓液、汗、尿、乳、腹水、粘液、鼻流体、痰、滑液、腹膜液、阴道液、月经、羊水、精液等等。在一个实施方案中，样品是已使用任何合适的收集方法或系统提取的宫颈组织样本，所述收集方法或系统例如alinitym
™
cervi
‑
collectspecimencollectionkit(abbottmolecular，abbottpark，il)或thinprep
™
preservcytsolution(hologic，inc.，marlborough，ma)。样品可以使用本领域技术人员已知的常规技术从受试者中获得，并且样品可以直接如从生物来源获得的那样使用或在预处理以改变样品的特性之后使用。此类预处理可以包括例如从血液制备血浆、稀释粘性流体、过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰组分的失活、试剂的添加、裂解等等。
31.在从受试者中获得样品后，可以使样品与如本文所述的包含正向引物和反向引物和探针的寡核苷酸集合接触，以形成反应混合物。然后将反应混合物置于扩增条件下。如本文使用的，术语“扩增条件”指促进引物序列的退火和/或延伸的条件。此类条件是本领域众所周知的，并且取决于所选择的扩增方法。例如，pcr扩增条件一般包括热循环，例如反应混合物在两个或更多个温度之间的循环。扩增条件包含所有反应条件，包括但不限于温度和温度循环、缓冲液、盐、离子强度、ph等等。本文所述的引物与样品中的一种或多种靶hpv核酸序列(例如，hpv基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68的l1基因)(如果存在的话)杂交，并且扩增样品中存在的靶hpv核酸序列中的任何一种或组合。
32.可以使用本领域已知的任何合适的核酸序列扩增方法来执行扩增样品中的hpv核酸序列，所述方法包括但不限于聚合酶链反应(pcr)、逆转录酶pcr(rt
‑
pcr)、实时pcr、转录介导的扩增(tma)、滚环扩增、基于核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)和连接酶链反应(lcr)。
33.hpv核酸序列的扩增期望地使用实时pcr来执行。如本文使用的，“实时pcr”指这样的pcr方法，其中随着反应进展，实时测量扩增产物的累积，伴随在每个循环后的产物定量，与其中扩增的dna产物在终点分析中检测的常规pcr形成对比。实时pcr在本领域中也称为“定量pcr(qpcr)”。pcr产物的实时检测通常涉及嵌入任何双链dna的非特异性荧光染料和序列特异性荧光标记dna探针的使用。实时pcr技术和系统是本领域已知的(参见例如，dorak，m.tevfik，编辑real
‑
timepcr.taylor&francis(2007)；以及fraga等人，“real
‑
timepcr,”currentprotocolsessentiallaboratorytechniques:10
‑
3(2008))，并且是从各种来源商购可得的(例如，m2000rtrealtime
™
pcr系统(abbottmolecular，inc.，desplaines，il)；cfxreal
‑
timepcrdetectionsystems(bio
‑
radlaboratories，inc.，hercules，ca)；以及taqman
™
real
‑
timepcrsystem(thermofisherscientific，waltham，ma))，其中任一种都可以用于本文所述的方法中。
34.在存在于样品中的一种或多种hpv病毒核酸序列(例如，hpv基因型16、18、31、33、
35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68的l1基因)的扩增之后，所公开的方法进一步包括使本文公开的一种或多种探针寡核苷酸序列与一种或多种扩增的靶hpv核酸序列杂交。在一个实施方案中，包含一种或多种hpv扩增子的反应混合物可以与本文公开的探针寡核苷酸序列接触，所述探针寡核苷酸序列在严格的杂交和洗涤条件下，以基因型特异性方式与扩增子的靶核酸序列(或其互补体)优先杂交，从而形成对于检测稳定的一种或多种杂交双链体。
35.如本文使用的，“杂交”指由于互补碱基配对，由两条单链核酸形成双链体结构。杂交可以在完全互补的核酸链之间或含有少量错配区域的“基本上互补的”核酸链之间发生。如本文使用的，“严格杂交条件”意指在其下强烈优选完全互补的核酸链的杂交的条件。在严格杂交条件下，例如在核酸的复杂混合物中，第一核酸序列(例如，引物)将与第二核酸序列(例如，靶序列)杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将是不同的。严格条件可以选择为比特定序列在限定的离子强度ph下的热解链温度(t
m
)低约5
‑
10℃。t
m
可以是在其下50%的与靶互补的寡核苷酸在平衡时与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、ph和核酸浓度下)(因为靶序列以过量存在，所以在t
m
下，50%的探针在平衡时被占据)。严格条件可以是这样的条件，其中在ph7.0至8.3下，盐浓度小于约1.0m钠离子，例如约0.01
‑
1.0m钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(例如，约10
‑
50个核苷酸)为至少约30℃，且对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可以用去稳定剂例如甲酰胺的添加来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括下述：50%甲酰胺、5xssc和1%sds，在42℃下温育，或5xssc、1%sds，在65℃下温育，伴随在0.2xssc和0.1%sds中在65℃下的洗涤。本领域已知的用于使寡核苷酸探针与靶hpv核酸序列杂交的任何合适的方法和条件，都可以用于所公开的方法中。
36.在一种或多种探针寡核苷酸序列与一种或多种扩增的靶hpv核酸序列杂交之后，该方法包括通过评价来自各可检测标记的信号，来检测一种或多种探针寡核苷酸序列与一种或多种扩增的靶hpv核酸序列的杂交，由此(i)一种或多种信号的存在指示一种或多种探针寡核苷酸序列与一种或多种靶hpv核酸序列的杂交，以及样品中存在基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68hpv，并且(ii)信号的不存在指示样品中不存在hpv。来自一种或多种探针寡核苷酸序列的信号的检测可以使用各种众所周知的方法来执行，所述方法包括例如均相或非均相技术。
37.均相检测方法涉及在扩增反应的产物形成时，即以实时方式检测它们。结果，在反应混合物处于扩增条件下时，形成并检测扩增产物/探针杂交体。均相检测方法包括但不限于fret标记的使用，所述fret标记附着至探针，并且在靶序列的存在下发出信号，分子信标(参见，tyagi等人，naturebiotechnol.，14:303
‑
308(1996)；tyagi等人，naturebiotechnol.，16:49
‑
53(1998)；kostrikis等人，science，279:1228
‑
1229(1998)；sokol等人，proc.natl.acad.sci.usa，95:11538
‑
11543(1998)；marras等人，genet.anal.，14:151
‑
156(1999)；以及美国专利5,846,726、5,925,517、6,277,581和6,235,504)，taqman
®
测定(参见例如，美国专利5,210,015；5,804,375；5,487,792和6,214,979，以及国际专利申请公开wo01/86001)，以及杂交保护测定(hpa)，其利用由吖啶鎓酯(ae)标记的探针(参见例如，weeks等人，clin.chem.，29:1474
‑
1479(1983)；berry等人，clin.
chem.，34: 2087
‑
2090(1988))。
38.非均相检测系统一般采用捕获剂，以使扩增的序列与反应混合物中的其它材料分开。捕获剂通常包含由一种或多种特异性结合序列包被的固体支持材料(例如，微量滴定孔、珠、芯片等等)。结合序列可以与加入本公开内容的寡核苷酸探针的尾部序列互补。可替代地，结合序列可以与捕获寡核苷酸的序列互补，所述捕获寡核苷酸本身包含与探针的尾部序列互补的序列。在与捕获剂结合的扩增产物/探针杂交体与剩余的反应混合物分开后，可以使用本领域已知的或本文所述的任何合适的检测方法来检测扩增产物/探针杂交体。
39.用于扩增且检测人乳头状瘤病毒核酸序列的试剂盒本公开内容还提供了用于扩增且检测样品中的基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68的人hpv的试剂盒。该试剂盒包含(a)包含seq id no: 1、seq id no: 2、seq id no: 3和seq id no: 4的正向引物寡核苷酸序列；(b)包含seq id no: 5和seq id no: 6的反向引物寡核苷酸序列；(c)包含seq id no: 7的第一探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型16特异性杂交；(d)包含seq id no: 8的第二探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型18特异性杂交；(e)包含seq id no: 9的第三探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型31特异性杂交；(f)包含seq id no: 10的第四探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型33特异性杂交；(g)包含seq id no: 11的第五探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型45特异性杂交；(h)包含seq id no: 12的第六探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型52特异性杂交；(i)包含seq id no: 13的第七探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型58特异性杂交；(j)包含seq id no: 14的第八探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型35特异性杂交；(k)包含seq id no: 15的第九探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型39特异性杂交；(l)包含seq id no: 16的第十探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型51特异性杂交；(m)包含seq id no: 17的第十一探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型56特异性杂交；(n)包含seq id no: 18的第十二探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型59特异性杂交；(o)包含seq id no: 19的第十三探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型66特异性杂交；(p)包含seq id no: 20的第十四探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型68a特异性杂交；(q)包含seq id no: 21的第十五探针寡核苷酸序列，其与hpv基因型68b特异性杂交，其中(c)
‑
(q)的探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。该试剂盒进一步包含用于扩增且检测核酸序列的试剂，以及用于扩增且检测hpv的说明书。本文关于上述方法阐述的引物寡核苷酸和探针寡核苷酸的描述也适用于本文中描述的试剂盒的那些相同方面。用于包括在试剂盒中的合适试剂(除本文所述的寡核苷酸引物和探针之外)的实例包括核酸扩增反应中采用的常规试剂，例如具有聚合酶活性的一种或多种酶、酶辅因子(例如镁或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad))、盐、缓冲液、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸三磷酸(dntp/rntp；例如，脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸)、阻断剂、标记剂等等。许多此类试剂在本文中进行描述，或以其它方式是本领域已知并且商购可得的。
40.试剂盒可以包含关于使用本文所述的扩增试剂以及引物和探针寡核苷酸的说明书，例如关于处理测试样品、提取核酸分子和/或执行测试；以及关于解释所获得的结果，以及以政府机构规定的形式的通知。此类说明书任选地可以是印刷形式或者在cd、dvd或其它形式的记录介质上。
41.上述试剂盒可以进一步包含引物和探针寡核苷酸，其扩增且检测内部对照核酸序
列，例如人β
‑
珠蛋白基因，如本文所述。在这点上，试剂盒和/或组合物可以包括包含seq id no: 22的内部对照正向引物寡核苷酸序列、包含seq id no: 23的内部对照反向引物寡核苷酸序列、以及包含seq id no: 24的内部对照探针寡核苷酸序列，其包含可检测标记。
42.试剂盒可以以固体(例如，冻干)或液体形式供应。在一个实施方案中，引物寡核苷酸、探针寡核苷酸和其它试剂是冻干的(即，冷冻干燥的)。本公开内容的试剂盒的各种组分可以任选地包含在用于每种个别组分(例如，引物寡核苷酸、探针寡核苷酸或缓冲液)的不同容器(例如，小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶)内。每种组分一般适当地在其分别的容器中等分或以浓缩形式提供。还可以提供适合于进行扩增/检测测定的某些步骤的其它容器。各个容器优选维持在密闭空间中用于商业销售。
43.下述实施例进一步说明了本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
44.实施例1本实施例证实了依据本公开内容用于扩增且检测样品中的hpv的方法。
45.利用实时rt
‑
pcr以扩增且检测从人宫颈样本中提取的高风险hpv基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和/或68的hpv检测测定，已由abbott molecular，inc.(abbott park，il)以商标名alinity m
™ꢀ
hr hpv assay开发。alinity m
™ꢀ
hr hpv测定预期用于下述用途：(1)筛查具有asc
‑
us(意义不明的非典型鳞状细胞)宫颈细胞学检测结果的患者，以确定对于阴道镜检查的转诊的需要；(2)与宫颈细胞学一起用于辅助筛查，以评价高风险hpv基因型的存在或不存在；(3)用作一线初步筛查测试，以鉴定处于发展宫颈癌的增加风险中或存在高级别疾病的女性；(4)评价hpv基因型16和18的存在或不存在，以在伴随或不伴随宫颈细胞学的情况下鉴定处于发展宫颈癌的增加风险中或存在高级别疾病的女性。
46.alinity m
™ꢀ
hr hpv测定由样品制备、pcr组装、扩增/检测、以及结果计算和报告组成。alinity m
™ꢀ
hr hpv测定程序的所有阶段都由alinity m
™
仪器自动执行。alinity m
™ꢀ
system设计为随机存取分析仪，其可以在同一仪器上与其它alinity m
™
测定平行执行alinity m
™ꢀ
hr hpv测定。
47.使用alinity m
™ꢀ
sample prep kit、alinity m
™ꢀ
lysis solution、alinity m
™ꢀ
ethanol solution和alinity m
™ꢀ
diluent solution，从样本中提取核酸。alinity m
™ꢀ
system采用磁性微粒技术，以促进核酸捕获、洗涤和洗脱。
48.然后将所得到的纯化的核酸与液体单位剂量的活化剂试剂、冻干的单位剂量的alinity m
™ꢀ
hr hpv扩增/检测试剂(包括pcr主混合物)组合，并且转移到反应容器内。然后将alinity m
™ꢀ
vapor barrier solution(矿物油)加入反应容器中，然后将所述反应容器转移到扩增/检测单元，用于pcr扩增以及实时荧光检测hr hpv和内源性人β珠蛋白(bg)。
49.引物寡核苷酸序列在表2中阐述，而探针寡核苷酸序列在表3中阐述。
50.表2. 用于alinity m
™ꢀ
hr hpv测定的引物序列
表3. 用于alinity m
™ꢀ
hr hpv测定的探针序列
pcr主混合物试剂制剂与冻干相容，并且允许快速pcr(即，在少于一小时内完成循环)。主混合物试剂通过将以下组合进行制备：寡核苷酸引物、寡核苷酸探针、dntp、pcr缓冲液组分(tris
‑
hcl、tween
‑
20和鱼明胶)、kapa2g fast dna聚合物、尿嘧啶
‑
dna糖基化酶(udg)、赋形剂(ficoll 400、ficoll 70、松三糖、海藻糖)和分子生物学级别水。kapa2g fast dna聚合酶是经由定向进化的更高持续合成能力和速度的改造酶，其显示出比野生型taq dna聚合酶明显更快的延伸率。它具有高度持续性的5'
‑
3' dna聚合酶，但缺乏3'
‑
5'外切核酸酶活性。尿嘧啶
‑
dna糖基化酶(udg)催化游离尿嘧啶从含尿嘧啶的dna中的释放，并且提供了用于含尿嘧啶的外部扩增子的污染控制手段。主混合物试剂以单位剂量形式填充到多孔板内并冻干。然后将冻干板密封并装袋。pcr主混合物试剂的制剂显示于表4中。
51.表4. pcr主混合物试剂制剂
活化剂溶液通过将分子生物学级水、氯化镁、四甲基氯化铵(tmac)、氯化钾和proclin 950混合进行制备。活化剂溶液以液体形式在密封和装袋的多孔板中供应，并且为pcr反应提供必要的盐，以激活pcr fast酶并确立最佳的离子强度环境。活化剂溶液的制剂显示于表5中。
52.表5. 活化剂试剂制剂组分浓度/孔氯化镁(mgcl2)8.5mm四甲基氯化铵(tmac)60mm氯化钾(kcl)60mmproclin9500.15%(v/v)分子生物学级别水n/aalinity m
™ꢀ
hr hpv测定所使用的pcr循环条件在表6中阐述。
53.表6. pcr循环条件可以进一步修改上述的pcr制剂和循环条件，以优化测定。
54.实施例2本实施例描述了本文公开的hpv检测方法用于检测宫颈疾病的临床灵敏度和特异性。
55.与hc2 high
‑
risk hpv dna test (hc2)和abbott realtime
ꢀ™ꢀ
high risk (hr) hpv相比较，确定了本文所述的alinity m
™ꢀ
hr hpv测定用于检测筛查群体(年龄≥ 30岁)中的宫颈疾病(称为“≥ cin2”)的临床灵敏度和特异性。所有样本都在thinprep preservcyt
™
溶液中收集。结果显示于表7中。
56.表7. 筛查群体中的临床灵敏度和特异性
a n表示检测到的≥ cin2样本的数目。n表示测试的≥ cin2样本的数目。
57.b n表示未检测到的疾病阴性样本的数目。n代表测试的疾病阴性样本的数目。当
组织学结果未知时，阴性疾病状态定义为< cin2组织学或阴性细胞学。
58.在68个≥ cin2样本中，34个为≥ cin3。关于≥ cin3检测的临床灵敏度对于alinity m
™ꢀ
hr hpv为100.0%(34/34；95% ci 89.8%至100.0%)，对于hc2为97.1%(33/34；95% ci 85.1%至99.5%)，并且对于abbott realtime
™ꢀ
hr hpv为100.0%(34/34；95% ci 89.8%至100.0%)。
59.实施例3本实施例描述了本文公开的hpv检测方法用于检测具有asc
‑
us细胞学的患者中的宫颈疾病的临床灵敏度。
60.asc
‑
us，也称为意义不明的非典型鳞状细胞，是巴氏测试中最常见的异常发现。它可能是感染某些类型的人乳头状瘤病毒(hpv)的迹象或良性生长。与hc2 high
‑
risk hpv dna test (hc2)和abbott realtime
ꢀ™ꢀ
high risk (hr) hpv相比较，确定了本文所述的alinity m
™ꢀ
hr hpv测定用于检测具有asc
‑
us细胞学的患者中的≥ cin2的临床灵敏度。所有样本都在thinprep preservcyt
™
溶液中收集。结果显示于表8中。
61.表8. asc
‑
us群体中的临床灵敏度实施例4本实施例描述了本文公开的hpv检测方法在具有正常细胞学的筛查群体中的临床特异性。
62.与hc2 high
‑
risk hpv dna test (hc2)和abbott realtime
ꢀ™ꢀ
high risk (hr) hpv相比较，确定了本文所述的alinity m
™ꢀ
hr hpv测定在具有正常细胞学的筛查群体(年龄≥ 30岁)中的临床特异性。所有样本都在thinprep preservcyt
™
溶液中收集。结果显示于表9中。
63.表9. 在具有正常细胞学的筛查群体中的临床特异性实施例5
本实施例描述了本文公开的hpv检测方法用于鉴定患有宫颈疾病的女性中的hpv16和/或hpv18的准确度。
64.基于来自如表10中所示的筛查群体(年龄≥30岁)以及如表11中所示的asc
‑
us群体的结果，评估alinitym
™
hrhpv测定在≥cin2中的hpv16和/或hpv18鉴定中的性能。在来自筛查群体的68个≥cin2样本中，68个具有来自alinitym
™
hrhpv和abbottrealtime
™
hrhpv两者的“检测到hrhpv”的解释。35个样本通过两种测定法均检测为hpv16和/或hpv18。33个样本通过两种测定法均检测为非hpv16/18。在alinitym
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hrhpv和abbottrealtime
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hrhpv之间，检测hpv16和/或hpv18的总体一致性为100.0%(68/68)。
65.表10.关于筛查群体中的hpv16和/或hpv18的基因分型准确度在来自asc
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us群体的31个≥cin2样本中，30个具有来自alinitym
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hrhpv和abbottrealtime
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hrhpv两者的“检测到hrhpv”的解释，如表11中所示。22个样本通过两种测定法均检测为hpv16和/或hpv18。8个样本通过两种测定法均检测为非hpv16/18。在alinitym
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hrhpv和abbottrealtime
™
hrhpv之间，检测hpv16和/或hpv18的总体一致性为100.0%(30/30)。
66.表11.关于asc
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us群体中的hpv16和/或hpv18的基因分型准确度实施例6本实施例证实了使用alinitym
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hrhpv测定来评估与不同基因型结果相关的相对疾病风险。
67.通过计算筛查群体(年龄≥ 30岁)和asc
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us群体中检测到的hpv 16和/或hpv 18相对于检测到的非hpv 16/18 hr hpv结果的绝对风险比，来评估患有宫颈疾病(≥ cin2)的相对风险。相对风险在筛查群体中为2.3，且在asc
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us群体中为2.1，如表12中所示。
68.表12. 与不同基因型结果(检测到的hpv 16和/或hpv 18相对于检测到的非hpv 16/18 hr hpv)相关的宫颈疾病的相对风险群体相对风险95%ci筛查2.3(1.6，3.5)asc
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us2.1(1.1，4.1)实施例7本实施例证实了alinity m
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hr hpv测定检测多种hpv基因型的能力。
69.评估了alinity m hr hpv检测14种hr hpv基因型(hpv 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)，并且特异性鉴定hpv基因型16、18和45，同时报告其它高风险基因型(其它hr hpv a：31/33/52/58；其它hr hpv b：35/39/51/56/59/66/68)的伴随检测的能力。如表13中列出的，测试了含有来自个别和组合的14种基因型的hpv dna靶的40个样品。准确地报告了来自所有样品的结果，包括具有单一基因型的14个样品、具有2种基因型的10个样品、具有3种基因型的10个样品、具有4种基因型的5个样品以及具有5种基因型的1个样品。在每种情况下，准确地确定了关于每个指定信号(hpv 16、hpv 18、hpv 45、其它hr hpv a和其它hr hpv b)的hpv dna的存在或不存在。
70.表13. 基因型检测和部分基因分型能力
实施例8本实施例证实了alinity m
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hr hpv测定的检测限(lod)的确定。
71.alinity m
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hr hpv的检测限(lod)通过在thinprep preservcyt
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溶液中针对14种hr hpv基因型序列(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)测试质粒进行确定，所述thinprep preservcyt
™
溶液含有hpv阴性人细胞系(c33a)背景。另外，通过在含有c33a细胞系背景的preservcyt
™
溶液中测试hpv阳性细胞系siha(hpv 16)和hela
(hpv18)来确定lod。每次测定使用四百微升的样品。每个质粒或细胞系稀释到4个浓度，包括处于、低于和高于预计的lod水平，并且用2个扩增试剂批次进行测试。对于每个质粒或细胞系，用每个扩增试剂批次跨越所有浓度(即4个浓度，每天6个重复，每个浓度经过3天)测试了总共72个重复。lod定义为具有≥95%检测率的浓度，其中所有更高的浓度具有≥95%的检测率。lod对于siha(hpv 16)和hela(hpv 18)为40个细胞/测定；对于hpv 16和18为240个拷贝/测定；对于hpv 45为500个拷贝/测定；对于hpv 33、35、51、52和59为2000个拷贝/测定；且对于hpv 31、39、56、58、66和68为5000个拷贝/测定。
72.实施例9本实施例证实了alinity m
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hr hpv测定的再现性。
73.在同一实验室内测试了总共581个样本，以评估alinity m hr hpv的再现性。每个样本由同一实验室的两名操作员测试两次。如表14中所示，两个测试之间的总体一致性百分比为97.9%(569/581；95% ci：96.4%至98.8%)，具有96.9%(370/382；95% ci：94.9%至98.5%)的平均阳性一致性和98.5%(768/780；95% ci：97.5%至99.2%)的平均阴性一致性。
74.表14. 实验室内的再现性使用不同的alinity m
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system测试了总共560个样本，以评估alinity m
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hr hpv在abbott的两个实验室之间的再现性。如表15中所示，两个测试之间的总体一致性百分比为97.5%(546/560；95% ci：95.8%至98.5%)，具有96.1%(342/356；95% ci：93.7%至97.9%)的平均阳性一致性和98.2%(750/764；95% ci：97.1%至99.0%)的平均阴性一致性。
75.表15. 实验室间的再现性实施例10本实施例证实了alinity m
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hr hpv测定的分析特异性。
76.alinity m
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hr hpv的分析特异性用一小组的微生物实验(参见表16)在hpv阴性样品和hr hpv阳性样品(含有检测限3倍的hpv)中进行评估。该小组包括低风险的hpv、细菌、病毒、原生动物、酵母和人细胞dna。在测试微生物的存在下，未观察到在alinity m
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hr hpv性能方面的交叉反应性或干扰。
77.表16. 测试的微生物
实施例11本实施例描述了潜在干扰的内源性和外源性物质对alinity m
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hr hpv测定的作用。
78.通过在含有c33a细胞系背景的thinprep preservcyt
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溶液中测试hpv阴性样品和hpv阳性样品(以检测限3倍的siha和hela细胞系)，来评价可能存在于宫颈样本中的潜在干扰的内源性和外源性物质对alinity m
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hr hpv性能的作用。血液以10%(v/v)的浓度进行评估，粘液以5%(v/v)的浓度进行评估，且外周血单核细胞(pbmc)约以大约1 x106个细胞/ml的浓度进行评估。通过掺入到样品内，以0.5%(w/v)评估了外源性干扰物质。在测试物
质(表17中所示)的存在下，未观察到alinity m
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hr hpv性能的干扰。
79.表17. 测试的物质实施例12本实施例描述了alinity m
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hr hpv测定的遗留率的确定。
80.alinity m
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hr hpv的遗留率通过分析来自多于10次运行的、从与10,000,000个拷贝/ml的高浓度hpv阳性样品交替的位置处理的hpv阴性样品的265个重复，进行确定。在任何hpv阴性样品中未检测到hpv，导致0.0%(95% ci：0.0%至1.4%)的总体遗留率。
81.实施例13本实施例证实了alinity m
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hr hpv测定在样本类型之间的一致性。
82.用alinity m
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hr hpv测试了在thinprep preservcyt
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溶液中以及用alinity cervi
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collect specimen collection kit从相同的277个患者中收集的样本。如表18中所示，两个样本类型的alinity m
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hpv解释之间的总体一致性百分比为94.6%(262/277；95% ci：91.3%至96.7%)，具有93.4%(214/229；95% ci：89.7%至96.5%)的平均阳性一致性和95.4%(310/325；95% ci：92.7%至97.6%)的平均阴性一致性。
83.表18. cervi
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collect和preservcyt样本之间的一致性用alinity m
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hr hpv测试了来自相同的276个患者的在surepath
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保存液和thinprep preservcyt
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溶液中收集的样本。如表19中所示，两个样本类型的alinity m
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hpv解释之间的总体一致性百分比为93.8%(259/276；95% ci：90.4%至96.1%)，具有91.5%(184/201；95% ci：87.2%至95.1%)的平均阳性一致性和95.2%(334/351；95% ci：92.6%至97.3%)的平均阴性一致性。
84.表19. surepath
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和preservcyt
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样本之间的一致性
用alinity m
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hr hpv测定测试了在细胞学处理之前和之后取出的119个preservcyt
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样本的等分试样(即，细胞学前和细胞学后样品)。如表20中所示，细胞学前和细胞学后样品(表14)的alinity m
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hpv解释之间的总体一致性百分比为97.5%(116/119；95% ci：92.8%至99.1%)，具有97.1%(102/105；95% ci：93.2%至100.0%)的平均阳性一致性和97.7%(130/133；95% ci：94.7%至100.0%)的平均阴性一致性。
85.表20. 细胞学前和细胞学后preservcyt
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样品之间的一致性本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都在此通过引用并入，其程度如同每篇参考文献个别且具体地指出通过引用并入并在本文中以其整体阐述一样。
86.在描述本发明的上下文中(尤其是在下述权利要求的上下文中)，术语“一个”和“一种”以及“该/所述”和“至少一个/种”以及类似指示物的使用被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一个/种”随后为一个或多个项目的列表(例如，“a和b中的至少一个/种”)的使用，应被解释为意指选自所列项目的一个项目(a或b)、或者两个或更多个所列项目的任何组合(a和b)，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。短语“基本上由
……
组成”也应被解释为开放式短语，意欲包括不实质上影响所述产物或方法的基本和新型特征的步骤或材料。短语“由
……
组成”应被解释为封闭式短语，其排除了说明书或权利要求中未明确规定的任何要素、步骤或成分。除非本文另有说明，否则在本文中的值范围的叙述仅预期充当个别地指落入该范围内的每个分开值的简写方法，并且每个分开的值并入说明书内，如同它在本文中个别地叙述一样。除非本文另有说明或以其他方式与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何合适的次序执行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如，“例如”)的使用，仅预期更好地阐明本发明，并不对本发明的范围造成限制，除非另有声明。说明书中的任何语言都不应该被解释为指示任何未请求保护的要素对于本发明的实践是必要的。
87.本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读上述说明书后，那些优选实施方案的变化对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。本发明人预计技术人员适当地采用这种变化，并且本发明人预期以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。相应地，本发明包括如由适用法律所许的与其附着的权利要求中叙述的主题的所有修改和等价物。此外，除非本文另有说明或以其他方式与上下文
明显矛盾，否则上述要素以其所有可能变化的任何组合都由本发明所涵盖。