一种CHO细胞内源性的温度敏感型启动子及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子及其应用。
背景技术：
：中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycells，cho)表达体系是生物制药领域最为常用的表达或生产系统。cho细胞可以在化学成分确定的(chemicallydefined,cd)无血清培养基中悬浮培养，可高密度生长，易于扩大培养，且所表达的重组蛋白的翻译后修饰与天然蛋白高度相似，因而具有较高的生物活性，因此成为重组蛋白药物生产最主要的宿主细胞。在cho细胞生物反应器发酵培养过程中，为提高发酵终末期活性蛋白的产量，常采用双温相细胞培养工艺，即前期在37℃培养使细胞快速增殖到一定密度，后期将温度降至亚生理低温(30℃-33℃)使细胞处于静止期(g1期)，此时为蛋白生产期。低温导致的细胞g1期停滞虽然会抑制细胞整体的蛋白表达水平，但能够提高mrna稳定性，抑制细胞过早凋亡，延长蛋白分泌周期，抑制蛋白酶活性，提高蛋白折叠效率，使蛋白产量会得到不同程度的提高。真核基因的转录是一个复杂的过程，包含有多种反式作用因子(如转录因子复合物)和顺式作用元件(如启动子和增强子)的复杂相互作用。目前cho细胞表达系统多采用转录活性高、组成型表达的病毒启动子，如人源或鼠源的cmv启动子、sv40启动子、rsv启动子或ltr启动子等，这些启动子具有持续表达和高表达的活性，但和双温相培养工艺相配合存在如下不足：1.低温时启动子转录活性普遍降低，有些启动子具有细胞周期依赖性，如cmv启动子在s期活性最高，而低温培养时细胞主要是停滞于g1期。2.病毒启动子驱动的重组蛋白表达经常发生基因沉默。3.可能会引起细胞应激反应。4.可能激活细胞凋亡途径。基因沉默是重组蛋白生产过程中最常遇到的问题。细胞株构建早期目的蛋白产量很高，但随着培养时间的延长和培养体系的扩大，部分基因的表达水平会下降甚至完全丢失。一般认为导致重组蛋白表达水平下降或消失的原因有：(1)细胞基因重组导致的基因丢失。但随着表达体系的扩大和表达时间的延长，目的基因在大量细胞中的大规模丢失是小概率事件。(2)表观遗传学修饰导致的基因沉默。在生产过程中随着培养体系的放大和培养时间的延长，异源蛋白的持续高度表达，细胞所受的内外界环境应激不断发生变化导致启动子cpg岛甲基化，以及染色体组蛋白的去乙酰化均会导致基因沉默。因此，从表观遗传学的层面来看，低cpg岛含量的启动子或不含cpg岛的启动子在表达稳定性方面要高于高cpg岛含量的启动子。此外，相较于异源性启动子尤其是病毒启动子，cho细胞内源性启动子能够更有效地与细胞内的各种转录因子相结合。因此，寻找在亚低温条件下具有高活性的cho细胞内源性启动子具有重要的理论价值和应用价值。在亚生理低温环境下，细胞中的冷休克应激蛋白会在mrna水平和蛋白水平上有所提高，如蛋白二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,pdi)、rna结合蛋白3(rna-bindingmotifprotein3,rbm3)、冷诱导rna-结合蛋白(coldinduciblerna-bindingprotein,cirp)、s100a6(calcyclin)等。产生这种现象的原因可能是由于这些冷休克相关蛋白的启动子区域有可能含有对温度敏感的元件以提高其在低温环境中的活性。haruthaithaisuchat等报道了cho-k1细胞基因组中s100a6基因翻译起始位点上游1.5kb区域内存在tata-box、tss、tfbs等启动子基序，并分析了该区域内不同片段的启动子活性和对低温的诱导效应。结果显示该区域内的大部分片段具有比sv40启动子更强的启动子活性，且在低温条件下启动子活性能提高2倍以上，并鉴定了s100a6基因的启动子核心区域为翻译起始位点上游-800～-579bp片段。同时，haruthaithaisuchat等人还提供了一种新型的cho内源性温度敏感型s100a6-ds18启动子，为哺乳动物细胞表达系统的优化提供了一种新的选择。但是s100a6-ds18启动子在37℃的活性不高，仅与sv40启动子活性相当，且启动子序列中含cpg岛，存在基因沉默风险。因此，寻找不含或少含cpg岛、亚生理低温效应更明显的cho内源性启动子对满足更高的蛋白表达需求具有重要意义。技术实现要素：本发明的首要目的在于提供一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子。本发明的另一目的是提供上述cho细胞内源性的温度敏感型启动子在稳定细胞株构建及蛋白表达中的应用。本发明的再一目的在于提供上述cho细胞内源性的温度敏感型启动子的筛选方法。本发明的上述目的通过以下方案予以实现：一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的cirp-p867启动子、核苷酸序列如seqidno.2所示的cirp-p2588启动子和核苷酸序列如seqidno.3所示的pdi-p598启动子中的至少一种。所述的cho细胞内源性的温度敏感型启动子在蛋白表达中的应用。一种重组慢病毒载体，包括上述cho细胞内源性的温度敏感型启动子和慢病毒载体骨架。所述的慢病毒载体骨架优选为含tet-off或tet-on启动子级联放大系统的慢病载体。所述的重组慢病毒载体，优选为将上述cho细胞内源性的温度敏感型启动子插入含tet-off或tet-on启动子级联放大系统的慢病载体中的tta或rtta表达元件的上游，用于驱动tta或rtta表达。所述的含tet-off或tet-on启动子级联放大系统的慢病载体包括但不限于：ptet-ires-egfp、ptet-off、ptet-on、plut-off和plut-off-egfp载体中的至少一种。一种重组慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：以含tet-on/off启动子级联放大系统的慢病毒载体为骨架，将目的蛋白基因插入载体多克隆位点(mcs)，然后将上述cho细胞内源性的温度敏感型启动子插入慢病毒载体中以驱动tta或rtta表达元件进行表达，得到重组慢病毒载体，其为通过cho细胞内源性启动子间接调控目的蛋白基因表达的重组慢病毒载体。所述的目的蛋白包括但不限于rfp、gfp及其突变系、荧光素酶、fc融合蛋白、hsa融合蛋白和单克隆抗体中的至少一种。所述的gfp的突变系优选为egfp。所述的重组慢病毒载体在制备高效表达稳定细胞株中的应用。所述的高效表达稳定细胞株优选通过慢病毒感染法获得。一种利用慢病毒感染法构建高效表达稳定细胞株的方法，包括如下步骤：(a)将上述重组慢病毒载体进行慢病毒包装，得到病毒液；(b)将获得的病毒液感染宿主细胞，得到高效表达稳定细胞库(cellpool)；当需要获得高效表达稳定的细胞株(cellline)时，对细胞库(cellpool)进一步筛选，即可得到高效表达稳定的细胞株(cellline)。步骤(a)中所述的重组慢病毒载体在进行慢病毒包装前，优选通过如下方式得到高浓度且高纯度的慢病毒载体：将所述的重组慢病毒载体转入大肠杆菌感受态细胞中，在大肠杆菌中复制扩增，提取质粒，得到高浓度且高纯度的慢病毒载体。所述的大肠杆菌感受态细胞包括但不限于大肠杆菌top10感受态细胞、大肠杆菌dh5α感受态细胞。所述的转化的方法包括但不限于热激法、电转法。步骤(b)中所述的宿主细胞为哺乳动物细胞；优选为cho细胞；所述的cho细胞包括但不限于cho-s细胞、cho-dg44细胞、cho-k1细胞等。一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子的筛选方法，包括如下步骤：(1)以cirp和pdi翻译起始位点上游的启动子区域为研究对象，生物信息学方法分析并选择置信度较高的基因片区作为假想启动子；(2)设计引物，从cho细胞基因组中克隆出假想启动子，并将假想启动子插入入慢病毒载体中，获得分别由上述假想启动子驱动目的蛋白基因表达的重组慢病毒载体；(3)通过慢病毒感染技术，将步骤(2)所述的慢病毒重组载体转入cho细胞中进行表达，获得慢病毒感染细胞库；(4)取步骤(3)中获得的慢病毒感染细胞库，进行低温诱导实验，比较细胞库中不同的cho内源启动子在37℃和32℃温度条件下的表达活性及不同启动子在亚生理低温条件下的低温诱导表达水平；(5)取步骤(3)中获得的慢病毒感染细胞库，进行稳定传代实验，探讨不同启动子的表达稳定性；(6)综合步骤(4)和步骤(5)的实验结果，得到cho细胞内源性的温度敏感型启动子。优选地，步骤(2)中所述的目的基因序列为cirp翻译起始位点上游-867～-55bp片段(cirp-p867)和-2588～-1768bp片段(cirp-p2588)，pdi翻译起始位点上游-598～-1bp(pdi-p598)序列，s100a6-ds18启动子序列。所述的cirp-p867的核苷酸序列如seqidno.1所示。所述的cirp-p2588的核苷酸序列如seqidno.2所示。所述的pdi-p598的核苷酸序列如seqidno.3所示。所述的s100a6-ds18的核苷酸序列如seqidno.4所示。步骤(2)中所述的慢病毒载体优选为含tet-off或tet-on启动子级联放大系统的慢病毒载体，包括但不限于ptet-ires-egfp、ptet-off、ptet-on、plut-off-egfp等载体。步骤(2)中的目的蛋白基因优选为报告基因，包括但不限于红色荧光蛋白(redfluorescenceprotein,rfp)基因、绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,gfp)基因、荧光素酶(luciferase)基因等；更优选为绿色荧光蛋白(gfp)基因。优选地，步骤(2)中所述的重组慢病毒表达载体的构建方法包含以下步骤：(21)以含tet-on/off系统的慢病毒载体为骨架，选择适当的酶切位点将目的蛋白基因插入载体的多克隆位点(multiplecloningsite,mcs)。(22)接着将慢病毒载体中驱动tta或rtta表达元件的启动子更换为假想启动子，获得由不同cho内源性启动子间接驱动目的蛋白基因表达的重组慢病毒表达载体。步骤(3)中所述的慢病毒感染技术包括包装和感染步骤。所述的包装步骤优选如下：将所述的慢病毒载体与包装质粒共同转染入hek293t细胞中培养；接着更换新鲜培养基，继续培养，获得病毒液；更优选如下：(31)共转染前24小时，待转染hek293t细胞以适当密度传代；(32)转染当天，显微镜下观察hek293t细胞生长状况，细胞汇合度70％～90％且状态良好时进行转染实验；(33)按照转染试剂说明书进行dna-转染试剂复合物配制；(34)将dna-转染试剂复合物滴加入待转染hek293t细胞中，继续培养；(35)培养28～32小时后更换新鲜的dmem培养基；(36)转染后46～48小时，取培养液离心，取上清经过0.45μm滤膜过滤后即可获得重组慢病毒悬液。步骤(31)中所述的传代的培养基包括但不限于dmem完全培养基、dmemglumax培养基、advancceddmem培养基、advanceddmem/f12培养基等。所述的dmem完全培养基是含fbs、l-谷氨酰胺的dmem培养基。所述的fbs在所述的dmem完全培养基中的浓度优选为体积百分比10％。所述的l-谷氨酰胺在所述的dmem完全培养基中的浓度优选为2～4mmol/l。步骤(34)中所述dna-转染试剂复合物配制过程中，转染试剂包括但不限于lipofectamine2000,lipofectamine3000,turbiofect等脂质体类转染试剂。所述的感染步骤优选如下：取经过离心、过滤处理的慢病毒悬液，感染适当密度的待感染细胞；病毒液感染细胞后4～6小时，补加新鲜的cd培养基，继续培养；病毒液感染细胞后46～48小时更换新鲜培养基；病毒液感染细胞后4～5天，进行蛋白表达强度检测，得到高效稳定表达细胞库；更优选如下：(31)将经过离心、过滤处理的慢病毒液加入事先准备好的待感染宿主细胞中，轻轻混匀后放入摇床，130rpm，8％co2、37℃进行培养；(32)病毒感染后4～6小时，补加新鲜的cd培养基，继续培养；(33)病毒感染后46～48小时，更换新鲜的cd完全培养基；(34)慢病毒感染后4～5天，取样检测细胞活率(viability)，活细胞密度(vcd)并镜检观察细胞状态，检测蛋白浓度或者报告基因表达强度，获得细胞库。优选地，步骤(4)中所述的亚生理低温诱导实验包含以下步骤：(41)取慢病毒感染后4～5天的细胞库或复苏培养慢病毒感染细胞库，以适当浓度和培养体积进行传代在37℃培养，得到37℃培养的细胞；(42)将37℃培养的细胞进行降温处理，培养条件为32℃摇床培养；降温培养的第2d、4d、6d、8d和10d(降温当天为第0d)取样检测目的蛋白表达强度；期间每隔一天(46～48小时)进行一次传代培养；(43)分析目的蛋白检测结果，比较不同启动子在32℃培养后的目的蛋白表达强度相对于降温前的增涨幅度。步骤(42)中所述的降温培养的细胞的起始培养密度优选为1.0×106～2.0×106个细胞/ml。优选地，步骤(5)中所述的稳定传代实验包含以下步骤：(51)复苏培养慢病毒感染细胞库，以0.2×106～0.3×106个细胞/ml的密度在37℃摇床中传代培养60天；(52)取37℃条件下传代培养40～45天的细胞，进行目的蛋白强度检测，比较含不同启动子的细胞库在37℃条件下的表达稳定性；(53)取37℃条件下传代培养40～45天的细胞，进行降温培养，培养条件为32℃摇床培养；降温培养的第2d、4d、6d、8d和10d(降温当天为第0d)取样检测目的蛋白表达强度；期间每隔一天(46～48h)进行一次传代培养；(54)分析目的蛋白检测结果，比较37℃条件下培养40～45天后，不同启动子在32℃降温培养后的目的蛋白表达强度相对于降温前的增长幅度。步骤(51)中所述的密度优选为0.2×106个细胞/ml或0.3×106个细胞/ml。步骤(53)中所述的降温培养的细胞的起始培养密度优选为1.0×106～2.0×106个细胞/ml。本发明以冷休克应激蛋白(cirp)和蛋白二硫键异构酶(pdi)翻译起始位点上游的启动子区域为研究对象，通过生物信息学方法分析了cirp基因翻译起始位点上游3kb的dna序列和pdi基因翻译起始位点上游1kb的dna序列，选择置信度较高的基因片区作为假想启动子；然后设计引物，从cho细胞基因组中分别克隆获得目标基因序列，并将目的序列作为假想启动子插入适合的载体中使其驱动目的基因的表达；再将由不同启动子序列驱动相同目的基因表达的重组载体转入cho细胞中进行表达，比较在37℃和32℃培养条件下，不同启动子的表达活性，以及在亚生理低温条件下不同启动子的低温诱导水平和表达稳定性。本发明发现了cho细胞基因组中cirp基因翻译起始位点上游-867～-55bp区域具有较强的启动子活性，对温度非常敏感，在37℃条件下表达强度大幅度减小，而在亚生理低温条件下(32℃)其表达强度可快速大幅度提高。与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：(1)cho内源性；本发明所述的启动子能够更有效地与细胞内的各种转录因子相结合，促使外源基因在宿主细胞中活跃且稳定的表达。(2)无cpg岛；本发明所述的启动子能够避免细胞在生产过程中由于内外界环境的刺激而导致的启动子cpg岛甲基化，以及由于染色体组蛋白去乙酰化而导致的基因沉默。(3)表达活性高且稳定；本发明中的启动子在亚生理低温条件下均具有较高的启动活性，其中cirp-p867启动子在亚生理低温条件下的表达强度更是s100a6-ds18启动子的2.5倍；且经传代培养42天后，亚生理低温条件下本发明启动子启动表达的强度几乎没有下降。(4)低温诱导水平高；本发明中cirp-p867启动子在降温后(32℃)的表达水平比降温前(37℃)启动子的表达水平提高120倍以上。附图说明图1是plut-off-x-egfp重组载体的构建流程图；其中，x为cirp-p867、cirp-p2588、pdi-p598或s100a6-ds18。图2是慢病毒感染后6天，慢病毒细胞库中不同启动子在37℃驱动的目的蛋白表达强度结果图。图3是刚复苏的细胞库在亚生理低温(32℃)条件下培养10天内的目的蛋白表达强度变化曲线图。图4是刚复苏的细胞库在亚生理低温(32℃)条件下培养10天内的目的蛋白表达强度与降温前相比，不同启动子的表达强度提高幅度图。图5是37℃条件下传代培养42天后，含不同cho内源性启动子的细胞库目的蛋白表达强度与刚复苏时表达强度的比较结果图。图6是37℃条件下传代培养42天后的细胞库与刚复苏时的细胞库在亚生理低温(32℃)条件下的目的蛋白表达强度的比较结果图。图7是在37℃条件下传代培养42天后的细胞库，在亚生理低温(32℃)条件下培养10天内的目的蛋白表达强度与降温前相比，不同启动子的表达强度提高幅度图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。cho-k1、cho-s细胞购自invitrogen；plut-off载体为本公司构建，序列如seqidno.5所示；hek293t细胞购自atcc；阳性质粒plvx-ires-zsgreen1购自美国clontech公司，货号：cat#632187；plegfp-c1载体购自美国clontech公司，货号：cat#6058-1。实施例1plut-off-x-egfp重组慢病毒载体的构建构建流程如图1所示：以plegfp-c1(clontech)为模板，通过seqpf和seqpr引物(序列见表1)扩增获得ecori-egfp-xhoi片段，并用ecori和xhoi双酶切pcr产物和plut-off载体，分别获得带粘性末端的egfp片段和plut-off线性化载体。用t4连接酶连接片段和线性化载体得到连接产物，连接方法参照产品使用说明。然后利用热激法将连接产物转化到大肠杆菌top10感受态细胞中，通过菌液pcr和酶切鉴定两步筛选阳性单克隆并对筛选的阳性单克隆进行dna测序验证，即得序列正确的plut-off-egfp重组载体。以cho-k1细胞基因组为模板，利用表1中引物扩增目标序列。表1egfp、cirp-p867、cirp-p2588、pdi-p598和s100a6-ds18的pcr扩增引物用xhoi和spei分别双酶切cirp-p867、cirp-p2588、s100a6-ds18的基因片段和plut-off-egfp重组载体；用sali和spei双酶切pdi-p598的基因片段，获得带粘性末端的相应基因片段和plut-off-egfp线性化载体。用t4连接酶(takara,cat#2011)连接酶切后的片段和线性化载体得到连接产物，连接方法参照产品使用说明。然后利用热激法将连接产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，通过菌液pcr和酶切鉴定两步筛选阳性单克隆并对筛选的阳性单克隆进行dna测序验证，即得序列正确的plut-off-x-egfp重组载体，其中x为cirp-p867、cirp-p2588、pdi-p598、s100a6-ds18的其中一种；其中cirp-p867为cirp翻译起始位点上游-867～-55bp片段，对应的dna序列如seqidno.1所示；cirp-p2588为cirp翻译起始位点上游-2588～-1768bp片段，对应的dna序列如seqidno.2所示；pdi-p598为pdi翻译起始位点上游-598～-1bp片段，对应的dna序列为seqidno.3；s100a6-ds18为haruthaithaisuchat等报道的启动子序列(haruthaithaisuchat,martinabaumann,et.identificationofanoveltemperaturesensitivepromoterinchocells.bmcbiotechnology,2011,11:51)，对应的dna序列如seqidno.4所示。实施例2慢病毒细胞库(cellpool)的构建慢病毒包装：(1)共转染前一天，将0.3×105个细胞/ml的hek293t细胞和10mldmem完全培养基(含4mm/l谷氨酰胺，10％fbs，下同)接种于25t细胞培养瓶中，在二氧化碳培养箱中进行培养；当镜检观察结果发现，细胞状态良好，汇合度约80％时，可用于转染实验。(2)将4.6μg核心质粒、2.7μgpspax2载体质粒和2.7μgpmd2.g载体质粒(质量比约为5:3:3)加入无血清dmem培养基中，轻轻混匀；随后加入20μl转染试剂turbofecttmtransfectionreagent(invitrogen,cat#r0531)轻轻混匀，使最终体积为1ml；室温静置反应20分钟最终形成dna-转染试剂复合物。其中，上述核心质粒为plut-off-x-egfp重组表达载体和阳性质粒plvx-ires-zsgreen1(clontech,cat#632187)；其中x分别为cirp-p867、cirp-p2588、pdi-p598、s100a6-ds18，同时设置不转染dna的阴性对照组。(3)将dna-转染试剂复合物加入待转染hek293t细胞中，在37℃、5％co2培养箱中孵育28～32小时。(4)将原培养基更换为3ml的dmem培养基，放回培养箱继续培养。(5)继续培养15～18小时后(共转染约48小时后)，取病毒包装细胞培养上清，经800rpm离心5min后，取离心后的上清经过0.45μm滤膜过滤，获得可用于感染的慢病毒液。慢病毒感染：1)待感染cho-s悬浮细胞进行密度、存活率检测并观察其生长状态：本实施例中待感染cho-s悬浮细胞密度为4.0×106个细胞/ml，活率为99％，直径为11.9μm，镜下观察状态良好，可用于病毒感染实验。2)将待感染的cho-s悬浮细胞用expressionmedium(mirus,cat#mir6200)(含4mml-谷氨酰胺，0.3％泊洛沙姆poloxamer188，下同)将细胞密度稀释至0.5×106个细胞/ml，并分装至50ml摇管中，每管1ml并做好标记。3)取经过0.45μm滤膜过滤后的慢病毒液，加入待感染的cho-s悬浮细胞中，每管2ml病毒液，即2ml病毒液感染0.5×106个细胞(1ml)，轻轻混匀后，放回摇床继续培养。4)病毒感染后4小时，补加5ml新鲜的expressionmedium继续培养。5)病毒感染后48小时，800rpm离心5min，移去上清后，加8ml新鲜expressionmedium重悬，实验组和阴性对照组(nc)加嘌呤霉素至终浓度5μg/ml(5p)，继续培养。(6)病毒感染后4天，取培养后的细胞检测活细胞密度、细胞活率并观察细胞状态。检测结果如下表2所示：表2慢病毒感染后4天，同时5p加压48小时后各细胞库(cellpool)活细胞密度及细胞活率所有细胞库800rpm离心5min后用3ml新鲜expressionmedium重悬；以0.5×106个细胞/ml，5ml体系传代，实验组和阴性对照组(nc)添加嘌呤霉素至终浓度10μg/ml(10p)，继续培养。(7)慢病毒感染后6天，同时5p加压48小时+10p加压2天后，取细胞检测活细胞密度、细胞活率并观察细胞状态。检测结果如下表3所示。表3慢病毒感染后6天，同时5p加压48小时+10p加压2天后各细胞库活细胞密度及细胞活率细胞库vcd(×106个细胞/ml)细胞活率(％)nc0.2820plvx-ires-zsgreen14.797plut-off-cirp-p2588-egfp3.596plut-off-cirp-p867-egfp3.495plut-off-pdi-p598-egfp2.995plut-off-s100a6-ds18-egfp4.497取细胞样品经pbs洗涤并稀释后进行荧光强度检测；剩余细胞进行细胞库冻存。感染后6天的不同启动子的细胞库在37℃的目的蛋白表达强度如图2所示。结果显示，慢病毒感染后6天的启动子在37℃的表达强度大小比较为：s100a6-ds18>cirp-p2588>cirp-p867>pdi-p598。实施例3病毒感染细胞库低温诱导实验细胞复苏培养：以cdfortichotmmeidum(gibco,cat#a1148301)完全培养基(含8mml-谷氨酰胺，下同)复苏含plut-off-x-egfp载体(其中x分别为cirp-p867、cirp-p2588、pdi-p598、s100a6-ds18)和plegfp-c1载体(clontech,cat#6058-1)的细胞库；其中，plegfp-c1载体为cmv强启动子驱动egfp报告基因表达的重组载体。含plegfp-c1载体细胞库的构建过程如实施例2，所不同的是包装质粒为gag-pol(addgene)和pmd2.g。低温诱导实验：将刚复苏的细胞库于37℃、110rpm，8％co2环境中正常培养2代后，细胞恢复至正常生长状态。将正常生长状态的细胞以1×106个细胞/ml的密度接种5ml于cdforticho完全培养基中，将温度降至32℃继续培养，在降温培养后的第2天、4天、6天、8天、10天分别取细胞进行荧光强度检测，同时以最初接种时的传代密度继续进行传代培养。比较降温培养(32℃)10天内，不同启动子在亚生理低温条件下的表达强度。gfp荧光强度检测方法：分别在降温后的第2天、4天、6天、8天、10天取细胞样品，经pbs缓冲液洗涤后，用pbs缓冲液稀释至0.25×106个细胞/ml，以100μl/孔接种至全黑96孔板。用多功能酶标仪(biotek,synergeh1m)在488/520nm波长下检测gfp荧光强度。实验结果：含不同cho内源性启动子的细胞库从37℃降温至32℃培养10天的gfp表达强度变化曲线，如图3所示。各启动子在降温6～8天表达强度提高至最大值，其中cirp-p867在亚生理低温条件下表达强度涨幅最高，为降温前的14倍，而plegfp-c1载体在降温后6天表达强度达到最大值，为降温前表达强度的3.5倍。不同启动子降温培养10天内的表达强度最高涨幅如图4所示。实施例4不同cho内源性启动子长期表达稳定性实验细胞复苏培养：以cdfortichotmmeidum完全培养基复苏含plut-off-x-egfp载体(其中x分别为cirp-p867、cirp-p2588、pdi-p598、s100a6-ds18)和plegfp-c1载体的细胞库；其中，plegfp-c1为cmv强启动子驱动egfp报告基因表达的重组载体。长期培养实验：细胞库复苏后，在37℃条件下以0.2×106个细胞/ml或者0.3×106个细胞/ml的接种密度传代培养42天后，将细胞培养温度降至32℃继续培养。分别在降温培养后的第2天、4天、6天、8天、10天取细胞样品进行荧光强度检测，同时以最初接种时的传代密度进行传代继续培养。比较传代培养42天后的细胞库，在降温培养的10天内，不同启动子在亚生理低温条件下的表达强度。gfp荧光强度检测方法：取上述细胞样品，经pbs缓冲液洗涤后，用pbs缓冲液稀释至0.25×106个细胞/ml，以100μl/孔的量接种至全黑96孔板。用多功能酶标仪在488/520nm波长下检测gfp荧光强度。实验结果：37℃条件下传代培养42天后不同启动子驱动表达的gfp强度与刚复苏时gfp表达强度比较如图5所示，所有启动子在37℃传代42天后的表达强度均降至初始水平的70％以下，其中cirp-p867启动子降幅最大，为初始水平的10％左右。而亚生理低温条件下cho内源性启动子的表达强度几乎没有下降，为初始水平93％以上，其中cirp-p867,cirp-p2588和pdi-p598为初始水平的100％或接近100％，而plegfp-c1(cmv启动子)仅有初始水平的90％，亚生理低温条件下不同启动子的表达稳定性见图6。取在37℃条件下传代42天后的细胞库再次降温培养10天，cho内源性启动子的表达强度仍有大幅度提高，如图7所示，cirp-p867启动子在降温培养后，其表达强度可提高至降温前的130倍，对亚生理低温条件极其敏感。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>珠海联邦制药股份有限公司<120>一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子及其应用<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>813<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<223>cirp-p867<400>1gttgagggtaggaagtcgctgtcatctgtgtccccaaccacacacaccctcttgcgaagt60gaagaaatttccagcatgccattctggttgggtggtccagactttggggtcctgtggcca120gggctaatggagggccactgcaggctagaagtcagttgttttaggccatagaaccaccat180ttaaggtcagctcagttgtatgacagtcttacatgtggttttgggatgataaaagcagaa240gacatccctgtgtcgtgtcccccccttgaaaatacctgttttccagacagggtttctctg300tacctttggagcttgtcctggaactctatagcaggctggcttcgtactcacagatccacc360tgcctctgcctcccgagtgctgggactaaaggtgtgtgccaccaccacccagtgtgtttg420ttcatttttgacatagagcatgtagcccaggctggtatcagacttgctgtgtagttgcaa480atggttttggacttctgatccttgtgcctccaatatcccaaaggctaggagtgacaggat540tgtttggaaacactctcccaagttgttccacagagtcctttgtctcattgagtgactgga600tgaccggtgtgaccccgcacttatggctcaggttccccaggaaggtcatggattactttt660atatacaaaagtagggaaggaaaggggcaggaagctttcagtgactgtcaccctagcact720aaagcttatgcagggcatttcaagaccagtctggcctataaagggaggtcatgtctcaaa780aactaaaagactgagtgtgctatctggcttcag813<210>2<211>821<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<223>cirp-p2588<400>2ggatgtggtcaggggtgaagccccgccagaaccctccagtgaggggctgagggcatggtc60aggagtcccttcagatggcatgcttgaagccctgggtgtatgcagaagagcagtgctctg120ccagctgtaatgtgcacctggttgggggtgagcagaaagcaggattcaaatggcagttaa180gttatggagcaggttgagatttgcaggcaaactgagttgggttcaggagagacgctgcag240caagtctgaaggaggagtactgactttgtggttaatattgtgatgaaagtgttaggactg300atcttatggaatgtctgagagccttgggtccagagaatcattaggagtcagttgttttgg360gagtcagctcagtggataacggggcttgctgctaatcctgaatttgatcctaaggatgga420aggagagacaccagaaaattgccttctggctttcacacacgcacttcagctaataaatgt480aatattaaaaagaaaagaaaaaaaaaagcagtgcgttgaagctctttgttcgccgccgca540gaccaaccgcgcggagagcaacgaagtgggtcagctccgcccctgaaccgcgctgtcacc600gccctccggccgctagggggcgggagaatgcggccggggcacatcccagccaatcaaaac660gctcagcgcctccgcgcgggcagggacgaagccggggatagtcccgcccctccactgaag720cgcagctgccgaatctggcgcgtcggattggtcagctaggcgtagtgggcggttctgggg780ggcgtgcccgaatgggtggggtatatcaggcgggactcagc821<210>3<211>595<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<223>pdi-p598<400>3cagtacggaaacgcggtccagtcagaatgcaacacgaggggcttcgggggcgcaggcgca60gctccacccaggggcccgggactccgccccctgccacgttcgacgaagaaccgcgcaggg120tgcgcgcatctctcggccaatcaggagccgccgggccgggccgtggccagcggcggcccc180tccgggcgtggggaaggcgtgggaaaagtcgccagtcacaagtccagaaagagaaagttc240gcctcggccagccaatcagaggctggggaacgcggcgtgtgagcgcgcgcgcgcgcgctg300cgggccaatcccgggcgaggacggcagggcctccgggtccttccgggctccgcggccccg360cctcgagtgggtgtccagtcctcgcgcggagagggtgggcctctcagcgcctcggccaat420cagacggcggggcggcgcgcgtgcgcgcggcggctggcgcgcgcggcgagggggcggtgt480gggcgcgtccccggcccaggatttataaaggcgaggtccggacccaggcgcgctctcgtc540gccttggctgtcccggcggcgccaacccaaccgccccgcccgctgccgacgtccg595<210>4<211>222<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<223>s100a6-ds18<400>4cctcatgccactcccaatccgggacagtcctggcagcagaggcgtggaaaactgaggggg60ttgttggggtgtgttttgctagcctcaggcgccgggtggggctcggggcgggccggcact120ccttgggcgggcctcccggatgctagccgctataaggccagccggactgcgacacagtcc180atcccctcgaccactcctttggctcttcgctgtctacctgcc222<210>5<211>9494<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<223>plut-off<400>5acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagca60acatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggta120cgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactga180attgccg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