本发明属于提取技术领域。更具体地，本发明涉及一种天然花青素的提取方法。
背景技术：
梅花(prunusmume)为蔷薇科李亚科李属植物，是我国传统十大名花之一。梅花为落叶乔木或小灌木，叶片卵形或椭圆形，花瓣倒卵形，白色至粉红色，花期冬春季。丰后梅(prunusmume‘fenghou’)是一种常见的梅花品种，以杏和梅杂交而成。丰后梅树形高大，开花繁茂，花色一般为正面深粉红至浅粉红，花瓣大，花量多，常达到16～22枚，为我国著名观赏花木。
梅花中存在丰富的苯甲酸、苯甲酸苄酯、槲皮素、异鼠李素以及花青素等物质，其中，花青素是梅花花色形成的主要因素。梅花花青素是一种类黄酮物质，具有抗炎症、提高免疫力、抗心血管疾病、美白护肤、抗衰老、抗癌等多种功效，适用于食品、医疗、美容等行业。采用现有技术中对梅花进行提取时，提取物的组分类别繁杂而且多为挥发性物质，提取物组成不稳定，影响使用效果，花青素整体应用受到限制。梅花，系蔷薇科李属的落叶乔木，稀灌木；小枝绿色，光滑无毛；叶片卵形或椭圆形，梅花耐寒耐热，无论是在-10℃的低温环境还是在40℃的高温中都可以很好地存活。丰后梅，落叶小乔木。树冠扁圆开张。干红褐色，皮孔中多，中大；枝条直上或斜出，小枝灰绿，多为古铜褐紫晕所掩，似杏，特粗壮。花1～2朵着生于中、短及束花枝上，以2朵者为多。
申请人通过大量的研究和试验,完成了本发明。目的旨在提供一种安全高效提取天然花青素的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种天然花青素的提取方法，花青素的提取率在90％以上，纯度在90％以上。本发明的方法适用于批量化制备花青素，制得的花青素中含有活性物质，组分稳定，有效的避免了花青素在提取过程中的损失，操作简单。
为实现以上目的，本发明采用的技术方案是：
一种天然花青素的提取方法，该方法包括以下步骤：
s1、预处理：对新鲜的梅花叶或丰后梅梅花进行洗净，避光吹干表面水分、磨碎，加入温度为20～35℃的水溶液，梅花叶或丰后梅梅花与水的质量体积比为1：6～70，在密封避光条件下，搅拌10-30min，得到混合物；
s2、去除挥发性油状物和沉淀：将s1中所述混合物进行超声波提取，静置去除上层油状物后，沥去沉淀物，取溶液，重复3-5次；
s3、粗提：加入醇水溶液浸提，调节ph＝5～6，得到粗提取液；
s4、超临界提取：使用超临界提取法提取所述粗提取液，得到花青素提取液；
s5、吸附和洗脱：使用大孔树脂对所述花青素提取液进行吸附，所述花青素提取液使用大孔树脂吸附后使用纯化水冲洗至无色，再依次使用醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含花青素的洗脱液；依次使用超滤膜和纳滤膜对所述花青素提取液进行过滤，并收集滤液；
s6、浓缩冷冻干燥：将所述富含花青素的洗脱液减压浓缩至粘稠状，回收乙醇，得到花青素浓缩液，使用冷冻法对所述花青素浓缩液进行干燥，得到花青素粉末，置-15～-30℃冷冻储藏。
进一步的，所述醇水溶液为乙醇溶液、异丙醇和聚乙醇溶液中的任一种。
进一步的，s2中超声波提取时，温度为20～40℃，时间为10-60min。
进一步的，s2中进行超声波提取的过程具体为：将s1中所述混合物，在30℃下经过超声法提取1-4次，每次提取时间为10-40min，合并三次提取液，得到提取液。
进一步的，s3中水溶液的ph值为5.5。
进一步的，s3中用柠檬酸溶液调节ph。
进一步的，s4中超临界提取的条件为：使用40％的醇水溶液，超临界提取温度为30～50℃，超临界提取时间为10～50min，超临界提取压力为20～50mpa，co2流速为5～12l/min。
进一步的，s5中大孔树脂为改性大孔树脂，对所述滤液吸附的吸附时间为1～3小时。
进一步的，s5中所述梯度洗脱为依次使用15％醇水溶液、20％醇水溶液、25％醇水溶液及30％醇水溶液进行洗脱。
本发明制备的天然花青素在促进视网膜细胞生成的应用。
本发明制备的天然花青素在皮肤美白中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的超临界从梅花叶或丰后梅梅花中提取花青素的方法对花青素的提取速度快，效率高，能耗少，实现了溶剂的回收利用，绿色环保，无毒无污染；提取过程简单，适宜工业化生产，满足了市场需求，提高了梅花叶和丰后梅梅花的利用价值。
2、本发明制得的花青素可用于美容、养生、健康、保健；所制得的天然花青素能抑制外界环境对视网膜细胞的损害，修复并促进视网膜细胞中生成，增强视力，缓解眼疲劳；所制得的天然花青素可以用于抑制黑色素细胞生成，同时抗氧化能力强，从而保护皮肤细胞，抑制色斑形成，使皮肤白皙。
3、本发明s1和s2步骤包括下列过程：第一，在较低温度的水溶液中，磨碎的的细胞混合物与水溶液作用，细胞膜破裂，细胞膜中各组分逐步进入水溶液中；20～35℃的水溶液能有效保持花青素活性，降低槲皮素等在水溶液中的溶解度，方便后续有效滤除；梅花叶或丰后梅梅花与水的质量体积比为1：6～70能使溶出的花青素完全溶解于水溶液中，不沉淀，提高得率。第二，s2中超声波提取时，低温的水溶液中加速细胞膜完全破裂，使各细胞中组分完全脱离细胞壁和细胞膜，重复超声波提取，使细胞内组分完全进入溶液中；s2中超声波提取时，温度为20～40℃，时间为10-60min，能有效分离细胞中各组分，使之进入溶液，同时保护花青素活性降低其他物质在水溶液中的溶解度。第三，静置溶液后，溶液分层，上层为易挥发性油性物质，底层为细胞壁、细胞膜沉淀和不溶于水的物质，花青素在充足的水溶液中完全溶于水溶液。滤去沉淀和去除油状物得到相对稳定的花青素提取物。没有采用现有技术中离心分离沉淀和水溶液，而采用重复该步骤，能有效保护花青素组分的温度和分散性，避免离心造成的活性破坏，分解和沉淀。s1、s2步骤共同作用，保证了细胞中各种成分有效浸出，使挥发性物质和不溶于水的各物质在低温环境中与花青素进行有效初步分离，保证了粗提的混合物中各组分的相对稳定；不仅良好的保护了花青素的活性，提高花青素的得率，又有效的滤去了不稳定物质，有利于后续花青素的提纯，对提高花青素的得率、纯度和稳定性起到了起到了重要作用。
4、本发明中改性大孔树脂能有效去花青素中的多种等杂质，并保持产品的纯天然、无污染；使用醇水溶液进行梯度洗脱，避免花青素的在大孔树脂中的残留浪费，提高花青素得率。
5、本制备方法是一种绿色环保经济路线，提取、纯化、浓缩采用密闭的体系，制备体系中的醇和水可分别回收并继续用于制备体系，降低物料的损失，并提高产品得率，所制备的花青素的提取率在90％以上，纯度在90％以上，品质高，活性和稳定性好。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
一种天然花青素的提取方法，该方法包括以下步骤：
s1、预处理：对新鲜的梅花叶或丰后梅梅花进行洗净，避光吹干表面水分、磨碎，加入温度为20～35℃的水溶液，梅花叶或丰后梅梅花与水的质量体积比为1：6～70，在密封避光条件下，搅拌10-30min，得到混合物；
s2、去除挥发性油状物和沉淀：将s1中所述混合物进行超声波提取，静置去除上层油状物后，沥去沉淀物，取溶液，重复3-5次；
s3、粗提：加入醇水溶液浸提，调节ph＝5～6，得到粗提取液；
s4、超临界提取：使用超临界提取法提取所述粗提取液，得到花青素提取液；
s5、吸附和洗脱：使用大孔树脂对所述花青素提取液进行吸附，所述花青素提取液使用大孔树脂吸附后使用纯化水冲洗至无色，再依次使用醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含花青素的洗脱液；依次使用超滤膜和纳滤膜对所述花青素提取液进行过滤，并收集滤液；
s6、浓缩冷冻干燥：将所述富含花青素的洗脱液减压浓缩至粘稠状，回收乙醇，得到花青素浓缩液，使用冷冻法对所述花青素浓缩液进行干燥，得到花青素粉末，置-15～-30℃冷冻储藏。
优选的，所述醇水溶液为乙醇溶液、异丙醇和聚乙醇溶液中的任一种。
优选的，s2中超声波提取时，温度为20～40℃，时间为10-60min。
优选的，s2中进行超声波提取的过程具体为：将s1中所述混合物，在30℃下经过超声法提取1-4次，每次提取时间为10-40min，合并三次提取液，得到提取液。
优选的，s3中水溶液的ph值为5.5。
优选的，s3中用柠檬酸溶液调节ph。
优选的，s4中超临界提取的条件为：使用40％的醇水溶液，超临界提取温度为30～50℃，超临界提取时间为10～50min，超临界提取压力为20～50mpa，co2流速为5～12l/min。
优选的，s5中大孔树脂为改性大孔树脂，对所述滤液吸附的吸附时间为1～3小时。
优选的，s5中所述梯度洗脱为依次使用15％醇水溶液、20％醇水溶液、25％醇水溶液及30％醇水溶液进行洗脱。
本发明制备的天然花青素在促进视网膜细胞生成的应用。
本发明制备的天然花青素在皮肤美白中的应用。
实施例1
一种天然花青素的提取方法，该方法包括以下步骤：
s1、预处理：对新鲜的梅花叶进行洗净，避光吹干表面水分、磨碎，加入温度为20℃的水溶液，梅花叶与水的质量体积比为1：6，在密封避光条件下，搅拌10min，得到混合物；
s2、去除挥发性油状物和沉淀：将s1中所述混合物进行超声波提取，静置去除上层油状物后，沥去沉淀物，取溶液，重复3次；s2中超声波提取时，温度为20℃，时间为10min。s2中进行超声波提取的过程具体为：将s1中所述混合物，在20℃下经过超声法提取1次，每次提取时间为20min，合并三次提取液，得到提取液。
s3、粗提：加入醇水溶液浸提，调节ph＝5，得到粗提取液；s3中用柠檬酸溶液调节ph。所述醇水溶液为异丙醇溶液。
s4、超临界提取：使用超临界提取法提取所述粗提取液，得到花青素提取液；s4中超临界提取的条件为：使用40％的醇水溶液，超临界提取温度为30℃，超临界提取时间为10min，超临界提取压力为20mpa，co2流速为5l/min。s5中大孔树脂为改性大孔树脂，对所述滤液吸附的吸附时间为1小时。
s5、吸附和洗脱：使用大孔树脂对所述花青素提取液进行吸附，所述花青素提取液使用大孔树脂吸附后使用纯化水冲洗至无色，再依次使用醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含花青素的洗脱液；依次使用超滤膜和纳滤膜对所述花青素提取液进行过滤，并收集滤液；s5中所述梯度洗脱为依次使用15％醇水溶液、20％醇水溶液、25％醇水溶液及30％醇水溶液进行洗脱。
s6、浓缩冷冻干燥：将所述富含花青素的洗脱液减压浓缩至粘稠状，回收乙醇，得到花青素浓缩液，使用冷冻法对所述花青素浓缩液进行干燥，得到花青素粉末，置-15℃冷冻储藏。
实施例2
一种天然花青素的提取方法，该方法包括以下步骤：
s1、预处理：对新鲜的梅花叶进行洗净，避光吹干表面水分、磨碎，加入温度为35℃的水溶液，梅花叶与水的质量体积比为1：70，在密封避光条件下，搅拌30min，得到混合物；
s2、去除挥发性油状物和沉淀：将s1中所述混合物进行超声波提取，静置去除上层油状物后，沥去沉淀物，取溶液，重复5次；s2中超声波提取时，温度为40℃，时间为60min。s2中进行超声波提取的过程具体为：将s1中所述混合物，在40℃下经过超声法提取4次，每次提取时间为40min，合并三次提取液，得到提取液。
s3、粗提：加入醇水溶液浸提，调节ph＝6，得到粗提取液；s3中用柠檬酸溶液调节ph。所述醇水溶液为聚乙醇溶液。
s4、超临界提取：使用超临界提取法提取所述粗提取液，得到花青素提取液；s4中超临界提取的条件为：使用40％的醇水溶液，超临界提取温度为50℃，超临界提取时间为50min，超临界提取压力为50mpa，co2流速为12l/min。
s5、吸附和洗脱：使用大孔树脂对所述花青素提取液进行吸附，所述花青素提取液使用大孔树脂吸附后使用纯化水冲洗至无色，再依次使用醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含花青素的洗脱液；依次使用超滤膜和纳滤膜对所述花青素提取液进行过滤，并收集滤液；s5中大孔树脂为改性大孔树脂，对所述滤液吸附的吸附时间为3小时。s5中所述梯度洗脱为依次使用15％醇水溶液、20％醇水溶液、25％醇水溶液及30％醇水溶液进行洗脱。
s6、浓缩冷冻干燥：将所述富含花青素的洗脱液减压浓缩至粘稠状，回收乙醇，得到花青素浓缩液，使用冷冻法对所述花青素浓缩液进行干燥，得到花青素粉末，置-30℃冷冻储藏。
实施例3
一种天然花青素的提取方法，该方法包括以下步骤：
s1、预处理：对新鲜的梅花叶进行洗净，避光吹干表面水分、磨碎，加入温度为30℃的水溶液，梅花叶与水的质量体积比为1：15，在密封避光条件下，搅拌20min，得到混合物；
s2、去除挥发性油状物和沉淀：将s1中所述混合物进行超声波提取，静置去除上层油状物后，沥去沉淀物，取溶液，重复4次；s2中进行超声波提取的过程具体为：将s1中所述混合物，在30℃下经过超声法提取3次，每次提取时间为35min，合并三次提取液，得到提取液。
s3、粗提：加入醇水溶液浸提，调节ph＝5.5，得到粗提取液；所述醇水溶液为乙醇溶液。s3中用柠檬酸溶液调节ph。
s4、超临界提取：使用超临界提取法提取所述粗提取液，得到花青素提取液；s4中超临界提取的条件为：使用40％的醇水溶液，超临界提取温度为40℃，超临界提取时间为35min，超临界提取压力为38mpa，co2流速为8l/min。
s5、吸附和洗脱：使用大孔树脂对所述花青素提取液进行吸附，所述花青素提取液使用大孔树脂吸附后使用纯化水冲洗至无色，再依次使用醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含花青素的洗脱液；依次使用超滤膜和纳滤膜对所述花青素提取液进行过滤，并收集滤液；s5中大孔树脂为改性大孔树脂，对所述滤液吸附的吸附时间为2小时。s5中所述梯度洗脱为依次使用15％醇水溶液、20％醇水溶液、25％醇水溶液及30％醇水溶液进行洗脱。
s6、浓缩冷冻干燥：将所述富含花青素的洗脱液减压浓缩至粘稠状，回收乙醇，得到花青素浓缩液，使用冷冻法对所述花青素浓缩液进行干燥，得到花青素粉末，置-20℃冷冻储藏。
实施例4
本实施对梅花梅花进行处理提取花青素，其他同实施例3。
对比例1
本实施例s1预处理中：对新鲜的梅花叶进行洗净，避光吹干表面水分、磨碎，加入温度为40℃的乙醇溶液，其他同实施例3。
对比例2
本实施例s1预处理中：对新鲜的梅花叶进行洗净，避光吹干表面水分、磨碎，加入温度为10℃的水溶液。其他同实施例3。
对比例3
本实施例s1预处理中：对新鲜的梅花叶进行洗净，避光吹干表面水分、磨碎，加入温度为40℃的水溶液。其他同实施例3。
对比例4
本实施例s2去除挥发性油状物和沉淀：未对s1中所述混合物进行超声波提取，其他同实施例3。
对比例5
本实施例s2去除挥发性油状物和沉淀：将s1中所述混合物进行超声波提取，静置去除上层油状物后，沥去沉淀物，取溶液，重复3-5次；s2中进行超声波提取的过程具体为：将s1中所述混合物，在50℃下经过超声法提取3次，每次提取时间为5min，合并三次提取液，得到提取液。其他同实施例3。
花青素各质量指标检测及稳定性检测
花青素的纯度测定方法为：类黄酮化合物于碱性条件下可与氯化铝形成稳定的黄色错合物，并于波长415nm下有吸光，当颜色越深，其类黄酮含量越高。取96孔盘加入样品和不同浓度标准品20ml再依序加入60ml乙醇(95％)、4ml10％氯化铝(aluminumchloride)、4ml1m醋酸钾(potassiumacetate)及112ml去离子水，在室温下避光反应30分钟，由elisareader在波长415nm测其吸光值。依吸光值判定测试样品中类黄酮含量多寡，利用其吸光值代入先前制作的槲皮素(quercetin)标准曲线，做出相对于槲皮素的浓度表示。最后，换算出每克样品中含有多少毫克类黄酮含量。
花青素稳定性检测：已知市售的天然花青素干粉，在常温下放置保存，其花青素的保存率随时间的延长逐渐降低，当放置1年时间左右，总花青素的保留率就降到了50％以下。本发明的制得的天然花青素由于特殊的工艺，因此使得花青素纯度更高，各组分的之间稳定性大大提高，使得花青素具有更高的稳定性。将实施例1-3在常温下放置0，2，8，14个月，分别测定每间隔时间内实施例制剂中总花青素的含量，以了解随着保存时间的延长，总花青素的含量变化情况及保存率大小，以观察判断花青素在不同保存时间段的稳定性，确定该制剂的保质期。结果见表。
表1实施例1-3及对比例1-5中天然花青素的质量指标，稳定性检测指标。
注:1.提取率％＝提取物中类黄酮或花青素质量量/提取物粗品质量×100％；2.纯度以类黄酮含量计。
由表1的试验结果表明，在本发明制剂中实施例1-4，常温放置的14个月的时间内，由于花青素中各组分的和杂质具有良好的稳定性，花青素的保存率较高；由表1结果可知，实施例1-3与对比例1-5相比，其提取率和纯度明显提高，说明s1低温水提取和s2中超声波提取共同作用，提高了花青素的纯度和提取率。
天然花青素抑制黑色素细胞生成黑色素之活性评估
将黑色素细胞，以1×105/ml之密度接种于96孔板中培养24小时后，将实施例3中制得的天然花青素及对照组维生素c和l-抗坏血酸组分别混合于含有100nmα-msh之无酚红(phenolredfree)培养液，反应72小时后，取上清液100μl于96孔板中，于405nm波长测定吸光值(biotek,synergytm2,usa)。计算天然花青素和维生素c本身之吸光值，换算天然花青素及维生素c作用于细胞后抑制黑色素生成量能力。
表2、天然花青素及维生素c作用于细胞后抑制黑色素生成量能力。
由表2结果显示天然花青素在72小时的作用时间下，100ppm浓度下有抑制效果，在高浓度的剂量300ppm和500ppm可发现有显著的抑制b16细胞生成黑色素的功效，说明天然花青素可用于化妆品进行抑制黑色素生成，使皮肤白皙。
天然花青素抑制电损失视网膜细胞和促进视网膜细胞试验
选雄性小鼠体重均18-21g，70只随机分配为7组。6组小鼠均用电磁辐射喂养小鼠。用实施例1-4的天然花青素添加于饲料中喂养小鼠，在电磁辐射10天前开始添加天然花青素为实施例1-4组；对照组1添加等量的叶黄素于饲料中喂养小鼠用电磁辐射小鼠喂养；对照组2中饲料不添加任何物质，电磁辐射小鼠，直接用饲料喂养小鼠；对照组3中饲料不添加任何物质，也不使用电磁辐射小鼠，室内正常光线喂养，直接用饲料喂养小鼠喂养辐射60天后处死小鼠。取眼球剥离视网膜，用天平秤湿重，配成2％的湿重，匀浆后3200转/分钟离心15分钟，取上清液，比色法鉴定丙二醛nmol/ml、谷胱甘肽过氧化酶ug/ml的含量判断视网膜的损伤。
表3、测得的谷胱甘肽过氧化酶和丙二醛的含量。
由表3可知，实施例组中谷胱甘肽过氧化酶和丙二醛明显高于未添加天然花青素的对照组，与未进行电辐射的对照组含量近似；同时与叶黄素有相似作用，即实施例组中的天然花青素能抑制电辐射对视网膜细胞造成的损伤，并修复视网膜细胞，促进视网膜细胞再生。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。