幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉、制备方法及应用制剂与流程

本发明涉及幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉、制备方法及应用制剂。

背景技术：

我国幽门螺旋杆菌感染率超过50％，人数高达八亿以上，每年需要进行治疗者不少于9000万人。幽门螺旋杆菌感染是造成胃炎，胃溃疡，十二指肠溃疡和胃癌的主要原因。幽门螺旋杆菌被世界卫生组织确定为一类致癌物质，胃癌死亡的患者中有95％以上感染了幽门螺杆菌。我国是胃癌高发国家，全球每年新增胃癌患者和每年因胃癌死亡患者一半来自中国。预防治疗幽门螺旋杆菌感染是降低胃癌发生率的关键。

基于《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识》，幽门螺旋杆菌治疗仍然以四联化学药物疗法为主。从1999年的海南共识，一直到2016年第五次共识，五版共识推荐的hp治疗方案从三联变为四联，疗程从7d、10d增至14d。然而，由于耐药性的增加，即使在用药量和疗程都有所增加的情况下，hp根除率已从最初的97％下降到目前不足70％。

除了根除率的下降，目前化学药物疗法还存在着一定的局限性：针对化学药物反复治疗失败的人群、必须接受治疗的儿童感染者、肝肾功能障碍者、哺乳期妇女等特殊人群，目前在使用化学药物疗法时都必须极为慎重，或不建议治疗。无论是masstrichtv共识、多伦多共识及国内最新发表的共识，推荐的疗程最多为14d。这说明面对反复治疗失败的患者，通过增加化学药物的疗程和剂量都是很有限的。

卵黄抗体最早由德国莱比锡医生在1893年发现，是鸡血清igg转移到卵黄中形成的一种多克隆抗体，也是蛋黄存在的唯一一种免疫球蛋白。由于其分子结构和生物学上的优势使其成为制备抗体的热门研究领域。通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中获取相应的抗体，并可用于相应疾病的治疗和预防，这类制剂称为卵黄抗体。

hp-igy是用幽门螺杆菌为抗原对产蛋母鸡进行注射，从其蛋黄中获得幽门螺杆菌卵黄抗体。大量试验研究表明hp-igy能够针对性地清除幽门螺杆菌，并对胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等炎症反应具有明显的抗炎作用。例如：可通过淋巴细胞和中性粒细胞浸润的程度来降低幽门螺杆菌诱导的胃粘膜损伤，在沙鼠实验模型中可以成功治疗幽门螺杆菌相关性胃炎；幽门螺杆菌感染会导致胃绒毛变性和脱落，在yang等人的实验(2012)中证明hpigy可以显着改善小鼠胃中的绒毛病变，恢复正常特征，改善炎症等。

然而目前还没有由幽门螺杆菌卵黄抗体制备的幽门螺旋杆菌卵黄抗体冻干粉及其应用制剂。

技术实现要素：

针对上述存在的技术不足，本发明所要解决的技术问题是克服现有技术不足，提供幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉、制备方法及应用制剂，该方法针对引起胃炎、胃溃疡和胃癌的主要幽门螺杆菌进行深入分析研究而制成卵黄抗体，制备的抗幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉的应用制剂可直接识别幽门螺杆菌表面抗原，对完整的、有活性的幽门螺杆菌有靶向抑制和杀灭作用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

s1、制备抗原：取11637号幽门螺杆菌，分别以固体tycsb琼脂斜面传代，在37℃厌氧条件下培养48小时，经pcr鉴定得到所述幽门螺杆菌的纯种后，在液体tycsb培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为抗原；

s2、佐剂的选用和产卵母鸡的免疫及取卵：初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为初次免疫抗原，加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述抗原按照重量比为1∶1混合乳化后作为加强免疫抗原；选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述初次免疫抗原，此为初次免疫；隔2周后开始加强免疫，对初次免疫的母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述加强免疫抗原，以后每隔一周加强免疫一次，其初次免疫和加强免疫共三次，从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃条件下储存备用；

s3、卵黄抗体的提取、制备幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，用水相萃取法鸡卵中的卵黄抗体，冷冻干燥，即得幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉；

s4、包装、检验、出厂。

优选地，所述的卵黄抗体的提取采用水相萃取法:从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入1-10倍体积的去离子水后，振荡混匀30分钟至2小时，让蛋黄中的抗体充分的溶解在水相中，于4℃温度下放置10-60分钟后，8000转/分钟离心10分钟，取上清即得到卵黄抗体溶液。

本发明还提供由上述的制备方法制得的幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉。

本发明提供也由所述幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉制得的胶囊剂及复溶剂。

本发明的有益效果在于：幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉的应用制剂效果好、制造和使用方便、无毒副作用，可直接识别幽门螺杆菌表面抗原，对完整的、有活性的幽门螺杆菌有靶向抑制和杀灭作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉的制备方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

s1、制备抗原：取11637号幽门螺杆菌，分别以固体tycsb琼脂斜面传代，在37℃厌氧条件下培养48小时，经pcr鉴定得到所述幽门螺杆菌的纯种后，在液体tycsb培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为抗原；

s2、佐剂的选用和产卵母鸡的免疫及取卵：初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为初次免疫抗原，加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述抗原按照重量比为1∶1混合乳化后作为加强免疫抗原；选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述初次免疫抗原，此为初次免疫；隔2周后开始加强免疫，对初次免疫的母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述加强免疫抗原，以后每隔一周加强免疫一次，其初次免疫和加强免疫共三次，从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃条件下储存备用；

s3、卵黄抗体的提取、制备幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，用水相萃取法鸡卵中的卵黄抗体，冷冻干燥，即得到幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉；

s4、包装、检验、出厂。

优选地，所述的卵黄抗体的提取采用水相萃取法:从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入1-10倍体积的去离子水后，振荡混匀30分钟至2小时，让蛋黄中的抗体充分的溶解在水相中，于4℃温度下放置10-60分钟后，8000转/分钟离心10分钟，取上清即得到卵黄抗体溶液。

本发明还提供由上述的制备方法制得的幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉。

本发明提供也由所述幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉制得的胶囊剂及复溶剂。

本发明所采用的技术机理是：

1、杀菌作用：igy与细菌细胞壁相互作用

张茜的研究表明(2013):igy与菌体表面脂多糖发生类抗原抗体结合的反应，然后通过静电等作用，改变菌体疏水性，阻碍脂多糖发挥保护作用，从而逐渐造成菌体细胞壁松散和细胞膜的破裂，进而造成了菌体的死亡。

姚营(2015)的研究表明:igy与菌体结合后，卵黄抗体通过改变菌体表面电荷性质，从而使巨噬细胞更容易接近和吞噬细菌，增强了巨噬细胞的吞噬作用。

yamashitay(2010)的研究表明：vaca是由幽门螺杆菌分泌的毒素，被认为是重要的毒力因子之一。对幽门螺杆菌感染的沙鼠进行的实验表明，特异性igy导入使得vaca活性降低，并因此观察到动物活力增加。

在段宝健2009年的文献综述中提到weeks等人(2000)发现位于hp细胞膜表面存在一种专门负责调节胞质内尿酶产生的蛋白质-urel，urel起“质子通道”作用，可控制进入细胞的胃酸量。研究表明，含抗hp特异性igy的高免蛋黄可破坏urel，使菌体失去酶保护膜，无法在胃中强酸环境下存活，从而有效消灭hp。

2.抑菌作用

张茜的研究表明(2013):卵黄抗体可黏附于菌体的菌毛上，使之不能黏附于胃壁粘膜上皮细胞，从而降低菌体的致病性、抑制细菌的生长繁殖。

yang等人(2012)的实验中也观察到hpigy在体外可以完全抑制幽门螺杆菌的生长。

3.抗炎作用

hpigy可以有效抑制th2型免疫反应因子白介素四(il-4)和白介素五(il-5)的分泌。降低炎症反应，加速溃疡面的愈合，有利于缓解胃部不适症状。(陈昌平,等.2009)

hpigy可促进伽马干扰素(ifn-γ)分泌。ifn-γ是th1型免疫反应因子，能够增强人体对病原菌的免疫力，具有免疫调节功效，且可降低发炎反应的产生。因此，hpigy亦可用于常人的日常保健，或针对免疫功能不佳的虚弱个体的免疫功能改善。(余斌,2006,陈昌平,等.2009)

igy不能通过胃屏障，这为igy在消化系统中被动免疫病原病毒和细菌提供了可能性。口服igy可以用于被动免疫治疗或预防消化系统疾病。(müller,等2015)

可通过淋巴细胞和中性粒细胞浸润的程度来降低幽门螺杆菌诱导的胃粘膜损伤，在沙鼠实验模型中可以成功治疗幽门螺杆菌相关性胃炎。(祝捷,等.2013；吕丹杨,等.2009)

幽门螺杆菌感染会导致胃绒毛变性和脱落，在yang等人的实验(2012)中证明hpigy可以显着改善小鼠胃中的绒毛病变，恢复正常特征，改善炎症。

(yang,2012)

本发明参考的文件如下：

1.《中国胃癌流行病学现状》.2017

2.《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识》.2017

3.消化界|胡伏莲教授：幽门螺杆菌治疗瓶颈时期需要开拓“幽门螺杆菌治疗新路径”https://mp.weixin.qq.com/s？__biz＝mzaxmja1ndg4mq＝＝&mid＝2651580635&idx＝1&sn＝26a80a6666f4fc7e7aed28e76887a8e0&scene＝0#wechat_redirect

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6.张茜.腐败希瓦氏菌卵黄抗体抑菌作用方式的研究.2013

7.姚营.卵黄抗体对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠肠道免疫应答的调节作用.2015

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11.陈昌平,钟宜书.免疫调节组合物(专利)

12.余斌.抗猪γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量抗原捕获elisa检测方法的初步建立[d].华中农业大学,2006.

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14.祝捷，杨靖，周永君,等.特异性抗幽门螺杆菌卵黄抗体的制备及其抗菌作用研究.2013

15.吕丹杨,王双珠,陈军贤等.根除幽门螺杆菌对慢性萎缩性胃窦炎黏膜变化的观察.2009

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幽门螺旋杆菌卵黄抗体冻干粉应用制剂408例临床试验数据：

志愿者：分别在北京、上海、徐州、菏泽、大同、新疆等地多中心进行临床试验；

试验用品：本发明实施例制备的幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉胶囊、复溶剂，饭后立即服用1粒胶囊或者1袋复溶剂，连续服用10天；

检测方法：13c-尿素吹气试验；

表观效果：有效缓解嗳气、反胃、胀气、胃疼等症状；

实验组：将志愿者按有胃部不适症状、无胃部不适症状人群区分，结果见表1

有效率判断标准：胃部不适症状改善效果明显，13c-尿素吹气试验结果明显下降，13c-尿素吹气试验结果在4.0以下(阴性)；

表1志愿者的临床试验结果

试验表明：有胃部不适症状的患者，在服用幽门螺杆菌卵黄抗体冻干粉胶囊、复溶剂10天之后，胃部不适症状明显改善、c13dob值显著下降的患者达85％以上；服用10天后直接转阴者达到20％以上。复染后服用10天，再次转阴率高达86％。对于没有胃部不适症状的患者，有效率19.4％，因为抗幽门螺杆菌冻干粉胶囊、复溶剂是使用11637号幽门螺杆菌致病型菌种制备抗原给鸡免疫，所以该产品对于致病型幽门螺杆菌患者更加有效。我们分析，无症状的幽门螺杆菌阳性患者会有一部分感染的是ii型非致病性幽门螺杆菌。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。