一种与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性SSR标记及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记及其应用。

背景技术：

烟草(nicotianatabacuml.)是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。尼古丁是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95％左右，而其在烟叶中的含量直接决定烟草品质和商业用途，受各国食品药品相关政府管理机构的政策性导向极强，故此，各大烟草公司及研究机构已开始积极培育低尼古丁含量的烟草品种，开发低尼古丁含量烟草制品。国内外烟草公司和研究机构正致力于鉴定尼古丁合成的主效调控基因nic1，希望通过利用该基因调节烟叶中的尼古丁含量，实现减少烟草制品中的尼古丁含量而达到降低对人体的危害性的目的。此外，国内外大量研究机构正在利用生物技术手段开展调节烟草烟碱含量进而实现提高烟草品质的研究，一方面积极应对新型烟草制品对高品质原料的商业迫切需求，另一方面也为有效降低电子烟等新型烟草产品的烟碱含量而达到减轻对人体健康的危害性。

通过对4份具有尼古丁合成主效调控基因突变的白肋烟近等基因系材料haburley21(nic1nic1nic2nic2)、hiburley21(nic1nic1nic2nic2)、liburley21(nic1nic1nic2nic2)和laburley21(nic1nic1nic2nic2)的遗传学研究发现，烟草中尼古丁的生物合成分别受到两个完全显性且独立遗传的基因(nic1和nic2)调控，其中nic1基因对尼古丁合成的调控能力是nic2基因的2.4倍，即，nic1是烟草尼古丁合成的主效调控基因(legg,p.d.,chaplin,j.f.,collins,g.b.,1969.inheritanceofpercenttotalalkaloidsinnicotianatabacuml.:populationsderivedfromcrossesoflowalkaloidlineswithburleyandflue-curedvarieties.j.hered.60,213-217；legg,p.d.,collins,g.b.,1971.inheritanceofpercenttotalalkaloidsinnicotianatabacuml.:ii.geneticeffectsoftwolociinburley21xlaburley21populations.can.j.genet.cytol.13,287-291.)。基于已公开的烟草基因组数据并结合生物信息学和生物技术实验证明，烟草中调控尼古丁合成的nic2基因是至少由7个erf(ethyleneresponsefactor)位点组成，如nterf189，nterf179等(shoji,t.,kajikawa,m.,hashimoto,t.,2010.clusteredtranscriptionfactorgenesregulatenicotinebiosynthesisintobacco.plantcell22,3390-3409；shoji,t.,hashimoto,t.,2012.dna-bindingandtranscriptionalactivationpropertiesoftobacconic2-locuserf189andrelatedtranscriptionfactors.plantbiotechnology29,35-42.)。burley21la品系中的nic2基因突变是由于nic2基因所在的染色体片段丢失所造成的(kajikawam.,sierron.,kawaguchih.,etal.,2017.genomicinsightsintotheevolutionofthenicotinebiosynthesispathwayintobacco,plantphysiology174,999-1011.)。近年来，随着基因组和测序技术的发展，erf类转录因子对烟碱合成调控的分子机理也逐渐清晰。根据相关报道，烟草erf转录因子家族中ix亚族中的erf(nic2)转录因子通过直接结合烟碱合成途径中关键代谢限速酶基因(如ntpmt、ntqpt)启动子中的gcc-box转录激活该基因的表达，进而增强烟碱的合成与积累(deboerk.,tillemans.,pauwelsl.,etal.,2011.apetala2/ethyleneresponsefactorandbasichelix-loop-helixtobaccotranscriptionfactorscooperativelymediatejasmonate-elicitednicotinebiosynthesis,plantj.66,1053-1065；shojit.,hashimotot.,2012.dna-bindingandtranscriptionalactivationpropertiesoftobacconic2-locuserf189andrelatedtranscriptionfactors,plantbiotechnology29,35-42；xub.,timkom.p.,2014.methyljasmonateinducedexpressionofthetobaccoputrescinen-methyltransferasegenesrequiresbothg-boxandgcc-motifelements,plantmol.biol.55,743-761.)。近期，国内外学者分别在烤烟(云烟87)和白肋烟(haburely21)基因组中发现了一个新的nic2-likeerf基因，其组成与nic2基因高度类似，但对烟草尼古丁调控的积累尚未报道(kajikawam.,sierron.,kawaguchih.,etal.,2017.genomicinsightsintotheevolutionofthenicotinebiosynthesispathwayintobacco,plantphysiology174,999-1011；suix.,zhangh.,songz.2019.ethyleneresponsefactornterf91positivelyregulatesalkaloidaccumulationsintobacco(nicotianatabacuml.),biochembiophysrescommun.517(1):164-171.)。此外，有研究进一步表明，上述nic2-like基因就是nic1基因位点，并开发出多个用于检测白肋烟nic1基因的snp(singlenucleotidepolymorphism)分子标记，且将检测的标记及方法申请了专利(pct/us2018/038679)。

因此，开展nic1基因对尼古丁合成的分子调控机理研究，对阐明nic1基因调控尼古丁生物合成的分子机制至关重要；同时，利用烟草尼古丁合成主效调控基因突变体品种开发与nic1基因紧密连锁的分子标记，对采用分子标记辅助选育低尼古丁含量的烟草品种具有重要意义。

迄今，针对烟草尼古丁合成基因的研究虽有报道，但现有报道的研究成果均是基于白肋烟为遗传背景开展的，且仅有的1份与nic1基因连锁的标记报道却是基于snp变异位点开发的dcaps标记，其在烟草育种实践及烟叶生产中存在着严重不足：1)存在严重的使用范围局限性，即已报道并申请专利的检测鉴定nic1基因的dcaps标记的使用范围较小，其仅适用于白肋烟类型；而栽培烟草中除了白肋烟类型外，还有烤烟、香料烟、雪茄烟、晾烟、晒烟等多种不同类型及黄花烟草种，上述众多烟草类型或种是dcaps标记所不能检测鉴定的。2)检测体系繁琐且耗时，dcaps标记在实际检测中涉及到pcr扩增、限制性内切酶或组合的选择、pcr扩增产物的酶切和电泳分离等过程。鉴于此，本发明利用高尼古丁含量的烟草材料mafc5(nic1nic1)和低尼古丁含量的烟草材料lafc53(nic1nic1)构建自交二代(f2)作图群体，采用分离群体分组分析(bulkedsegregationanalysis,bsa)法，筛选与烟草低尼古丁含量基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记并进行验证，加速分子标记辅助选择(markerassistantselection，mas)在低尼古丁含量烟草品种选育中的利用，从而实现方便、快捷、稳定、可靠的培育出具有低尼古丁含量且高品质的烟草品种。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记；第二目的在于提供所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tm22038、tm23004和tm22041，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seqidno.1和seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在nic1基因中的应用。

为了简便、高效选择具有低尼古丁含量的烟草品种，有针对性、特异性的选择含纯合基因型nic1nic1的后代材料，本发明提供一种用于检测与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的分子标记tm22038、tm23004和tm22041，该分子标记采用分离群体分组分析(bulkedsegregationanalysis,bsa)法，筛选获得与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记，可以用于低尼古丁含量烟草品种选育的辅助手段，以提高分子标记辅助选择的效率并加速低尼古丁含量烟草品种的选育进程。

本发明利用两份烟草育种材料-mafc5(高尼古丁含量；nic1nic1)和lafc53(低尼古丁含量；nic1nic1)为亲本，通过杂交、自交，构建自交二代(f2)分离作图群体；采用分离群体分组分析(bulkedsegregationanalysis,bsa)法，结合单株尼古丁含量水平挑选f2群体中尼古丁含量最低和最高单株各15株，提取基因组dna后构建两个极端dna池，筛选获得与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记，加速分子标记辅助选择(markerassistantselection，mas)在低尼古丁含量烟草品种选育中的应用进程。

本发明所述的共显性ssr标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为低尼古丁含量烟草品种培育中nic1基因分子标记辅助选择的应用。

附图说明

图1是与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记在5份材料中的pcr扩增产物凝胶电泳图；

其中，a，共显性ssr标记tm22038；b，共显性ssr标记tm23004；c，共显性ssr标记tm22041；la，低尼古丁含量亲本lafc53；hi，高尼古丁含量亲本mafc5；f1，两亲本间的杂交子一代(mafc5×lafc53)；bs_l，低尼古丁含量池；bs_h，高尼古丁含量池；m，500bpdnaladder，长度片段分别为：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp；

图2是共显性ssr标记tm22038在部分f2单株(36株具有高尼古丁含量的f2单株)中的pcr扩增产物凝胶电泳图；

其中，编号16(带*号标记)为单交换单株；编号1-36，36株具有高尼古丁含量的f2单株编号；

图3是共显性ssr标记tm23004在部分f2单株(36株具有高尼古丁含量的f2单株)中的pcr扩增产物凝胶电泳图；

其中，编号4(带*号标记)为单交换单株；编号1-36，36株具有高尼古丁含量的f2单株编号；

图4是共显性ssr标记tm22038、tm23004和tm22041分别与烟草nic1基因的连锁关系；

其中，左侧为标记(基因)名称；右侧为标记与nic1基因间的遗传距离(单位为：cm)。

图5是共显性ssr标记tm22038和tm23004在7份烟草品种(资源)中的pcr扩增产物凝胶电泳图；

其中，d,共显性ssr标记tm22038；e,共显性ssr标记tm23004；7份烟草材料：y1,高尼古丁含量烟草mafc5；y2,低尼古丁含量烟草lafc53；y3,f1(mafc5×lafc53)；y4,云烟87；y5,coker176；y6,k326；y7,红花大金元。

具体实施方式

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tm22038、tm23004和tm22041，其扩增产物核苷酸序列分别为seqidno.1和seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示。

编号为tm22038的引物，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seqidno.1(高尼古丁含量，nic1)和seqidno.2(低尼古丁含量nic1)；编号为tm23004的引物，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seqidno.3(高尼古丁含量，nic1)和seqidno.4(低尼古丁含量nic1)；编号为tm22041的引物，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seqidno.5(高尼古丁含量，nic1)和seqidno.6(低尼古丁含量nic1))

所述的分子标记所对应的3个位点的引物序列分别为：

tm22038序列为：

tm22038f：5’-caccatggtttggctttcat-3’(seqidno.7)，

tm22038r：5’-gcaaaatgcaaaaaggcaat-3’(seqidno.8)；

tm23004序列为：

tm23004f：5’-accaacatggccaaacctta-3’(seqidno.9)，

tm23004r：5’-gcgaggaaaagccagtaaaa-3’(seqidno.10)；

tm22041序列为：

tm22041f：5’-accaacatggccaaacctta-3’(seqidno.11)，

tm22041r：5’-gcaaaatgcaaaaaggcaat-3’(seqidno.12)；

本发明所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记的应用为所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在nic1基因而具有低尼古丁含量烟草品种的应用。

所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记的应用是分别以tm22038序列的引物、tm23004序列的引物和tm22041序列的引物分别扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物，如果pcr扩增产物中同时含有如seqidno.1、seqidno.3和seqidno.5所示的三条核苷酸序列，或同时含有如seqidno.1和seqidno.3所示的两条核苷酸序列，即为具有纯合基因型nic1nic1的高尼古丁含量植株；如果pcr扩增产物中同时含有如seqidno.2、seqidno.4和seqidno.6所示的三条核苷酸序列，或同时含有如seqidno.2和seqidno.4所示的两条核苷酸序列，即为具有纯合基因型nic1nic1的低尼古丁含量植株；如果pcr扩增产物中同时含有如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的四条核苷酸序列，即为具有杂合基因型nic1nic1的高尼古丁含量植株。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

利用分离群体分组分析(bulkedsegregationanalysis,bsa)法，筛选与烟草nic1基因紧密连锁的共显性ssr标记。

一、实验材料

以高尼古丁含量烟草材料mafc5(基因型nic1nic1)为母本，以低尼古丁含量烟草材料lafc53(基因型nic1nic1)为父本。2017年种植高、低尼古丁含量亲本材料，经杂交，获得f1。2018年冬季种植杂交一代(f1)，于2019年初获得nic1基因分离群体(f2代)。2019年种植两亲本、f1和f2世代材料。

二、亲本及f2分离群体尼古丁含量测定

试验材料成苗后移栽至大田，行株距为100cm×50cm；采用常规栽培和田间管理，f2群体整体现蕾后打顶，打顶2周后，对各单株鲜烟叶进行采烤。采烤后分别将每株叶片研磨并测定尼古丁含量。

对得到的亲本和f2群体各单株叶片的尼古丁含量数据进行分析，表型(单株尼古丁含量)数据分析的依据为：孟德尔遗传定律中的显性单基因控制的质量性状。

nic1nic1或nic1nic1：显性纯合或杂合个体，尼古丁含量大于1.0mg/g；

nic1nic1：隐性纯合体，尼古丁含量小于1.0mg/g。

三、ssr标记分析

打顶前，在田间采集双亲、f1及f2群体的各单株新鲜叶片，参试材料全基因组dna的提取，采用常规ctab法或植物组织dna提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。ssr-pcr的体系配制、产物扩增及扩增产物的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(6％-non-page)检测，参照童治军等(童治军等.普通烟草及其祖先种基因组ssr位点分析.中国农业科学,2015,48(11):2108-2117)提供的方法进行。ssr标记(引物)由13645对tm系列引物构成(tongzj,etal.large-scaledevelopmentofmicrosatellitemarkersinnicotianatabacumandconstructionofageneticmapofflue-curedtobacco.plantbreeding,2012,131:674-680；tongzj,etal.large-scaledevelopmentofssrmarkersintobaccoandconstructionofalinkagemapinflue-curedtobacco.breedingscience,2016,66:381-390)。

所述pcr反应体系为：30-50ng/μldna，正向和反向引物各1.0μmol/l，1.5mmol/ldntps，2μl10×pcrbuffer(mg²⁺plus)，0.75～1.0utaq聚合酶(rtaq，takaraltd.)，加双蒸水至20μl。

所述pcr扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec,30个循环后，72℃再延伸5min。

所述凝胶电泳检测指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，1×tbe电泳缓冲液，于500v恒压电泳1.5小时分离，最后银染显色。

四、高、低尼古丁含量基因组池的构建

采用分离群体分组分析法(bulkedsegregationanalysis,bsa)，选取f2分离群体中的尼古丁含量最高单株和尼古丁含量最低单株各15株，提取基因组dna，等量混合构建高、低尼古丁含量池，用于引物多态性筛选和标记连锁分析。

在苗期按实施例1所述方法，利用13645对ssr引物对中高尼古丁含量亲本mafc5、低尼古丁亲本lafc53、两亲本间杂交子一代(f1)、高尼古丁含量池和低尼古丁含量池共5份材料进行pcr扩增，筛选与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记。筛选的结果如图1所示：共显性ssr标记tm22038、tm23004和tm22041分别与烟草nic1基因连锁，即，标记tm22038、tm23004和tm22041在高尼古丁含量池与高尼古丁含量亲本中的带型完全一致，仅出现一条321bp(序列如seqidno.1)、280bp(序列如seqidno.3)和384bp(序列如seqidno.5)的特异性条带；在低尼古丁含量池与低尼古丁含量亲本中的带型完全一致，仅出现一条309bp(序列如seqidno.2)、272bp(序列如seqidno.4)和372bp(序列如seqidno.6)的特异性条带。其中，seqidno.1、seqidno.3和seqidno.5所示序列长度分别为321bp、280bp和384bp，分别是共显性ssr标记tm22038、tm23004和tm22041在含有nic1基因而具有高尼古丁含量烟草品种中的特异性pcr扩增核苷酸序列；seqidno.2、seqidno.4和seqidno.6所示序列长度分别为309bp、272bp和372bp，分别是共显性ssr标记tm22038、tm23004和tm22041在含有nic1基因而具有低尼古丁含量烟草品种中的特异性pcr扩增核苷酸序列。

以上结果表明，标记tm22038、tm23004和tm22041分别与烟草nic1基因连锁，且该标记为共显性标记。如果pcr扩增产物中同时含有如seqidno.1(321bp)、seqidno.3(280bp)和seqidno.5(384bp)所示的三条核苷酸序列，或同时含有如seqidno.1(321bp)和seqidno.3(280bp)所示的两条核苷酸序列，即为具有纯合基因型nic1nic1的高尼古丁含量植株；如果pcr扩增产物中同时含有如seqidno.2(309bp)、seqidno.4(272bp)和seqidno.6(372bp)所示的三条核苷酸序列，或同时含有如seqidno.2(309bp)和seqidno.4(272bp)所示的两条核苷酸序列，即为具有纯合基因型nic1nic1的低尼古丁含量植株；如果pcr扩增产物中同时含有如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的四条核苷酸序列，即为具有杂合基因型nic1nic1的高尼古丁含量植株。

实施例2

共显性连锁标记的图距及其在f2群体单株中的验证。

一、数据分析

首先，按实施例1所述方法进行烟草基因组dna提取、纯化，f2群体单株打顶后进行尼古丁含量测定和ssr标记分析。其次，利用通过bsa法筛选获得的与烟草nic1连锁的共显性ssr标记tm22038、tm23004和tm22041对f2群体中的176个单株进行基因型分析。最后，对各个单株的带型进行数据统计，即，与高尼古丁含量亲本带型一致的单株记作“a”；与子一代(f1)单株带型一致的合条带单株记作“h”，与低尼古丁含量亲本带型一致的单株条带标记作“b”，条带不清晰或者无扩增条带的记做“u”。

二、共显性连锁标记遗传距离的计算

利用joinmap4.0软件对共显性ssr标记在f2分离群体中的基因型数据并结合尼古丁含量表型数据，进行遗传连锁分析，计算出其连锁距离并绘制连锁图。

f2群体单株尼古丁含量的结果为：176个单株中，低尼古丁含量单株有46个，高尼古丁含量单株有130个。

以seqidno.7和seqidno.8所示的序列为引物，对176株f2单株基因组dna进行pcr扩增，其部分扩增结果如图2所示：图中展示的36个f2群体单株的表型均属于高尼古丁含量，故此，该36个样品的pcr扩增产物核苷酸序列应只有两种组合形式，即，仅含有长度为321bp的条带(纯合基因型nic1nic1)，其序列如seqidno.1所示；或同时含有长度为321bp和309bp两条条带(杂合基因型nic1nic1)，其序列如seqidno.1和seqidno.2所示。但图中从左到右的第16个泳道(标注*)却出现了仅含309bp条带(纯合基因型nic1nic1)，其序列如seqidno.2所示，其表型与高尼古丁含量不符，因此，该单株为单交换单株。

以seqidno.9和seqidno.10所示的序列为引物，对176株f2单株基因组dna进行pcr扩增，其部分扩增结果如图3所示：图中同样展示了36个f2群体单株的表型均属于高尼古丁含量，故此，该36个样品的pcr扩增产物核苷酸序列应只有两种组合形式，即，仅含有长度为280bp的条带(纯合基因型nic1nic1)，其序列如seqidno.3所示；或同时含有长度为280bp和272bp两条条带(杂合基因型nic1nic1)，其序列如seqidno.3和seqidno.4所示。但图中从左到右的第4个泳道(标注*)却出现了仅含272bp条带(纯合基因型nic1nic1)，其序列如seqidno.4所示，其表型与高尼古丁含量不符，因此，该单株为单交换单株。

由上述两个共显性连锁标记(tm22038和tm23004)对176个f2单株的基因型分析可知：两个标记中分别有13个和15个单株则呈现出单交换(此外，标记tm22041获得18个单交换单株)，即尼古丁含量表型鉴定的结果为高尼古丁单株，而基因型分析的结果却为低尼古丁单株(仅出现低尼古丁含量基因型的特异条带)。因此，利用joinmap4.0作图软件计算可知，上述三个共显性标记tm22038、tm23004和tm22041与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1连锁紧密且位于nic1基因的两侧，其各自与nic1基因间的遗传距离均约为3.796cm、4.490cm和5.365cm，如图4所示。

实施例3

利用与nic1基因紧密连锁的两侧标记检测烟草资源中的尼古丁含量。

一、实验材料

所用的标记为tm22038和tm23004两个与nic1基因连锁且位于其两侧的共显性ssr标记。植物材料为mafc5(高尼古丁含量烟草资源)、lafc53(低尼古丁含量烟草资源)、f1(mafc5×lafc53)、云烟87、coker176、k326和红花大金元共7份烟草资源。

二、数据处理

首先，按实施例1所述方法对上述7份烟草材料进行烟草基因组dna提取、纯化。其次，利用与烟草nic1基因两侧连锁的共显性ssr标记tm22038和tm23004对7个烟草单株进行基因型分析。最后，对各个单株的带型进行数据分析，即，pcr扩增产物中同时出现如seqidno.1和seqidno.3所示的核苷酸序列即为具有纯合基因型nic1nic1的高尼古丁含量烟草资源；若pcr扩增产物中同时出现如seqidno.1和seqidno.2及seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列即为具有杂合基因型nic1nic1的高尼古丁含量烟草资源；若pcr扩增产物中同时出现如seqidno.2和seqidno.4所示的核苷酸序列即为具有纯合基因型nic1nic1的低尼古丁含量烟草资源。由图5可知：7份待测的烟草材料中，f1(mafc5×lafc53)是具有杂合基因型nic1nic1的高尼古丁含量烟草资源；lafc53和红花大金元是具有纯合基因型nic1nic1的高尼古丁含量烟草资源；而剩余的mafc5、云烟87、coker176和k326则是具有纯合基因型nic1nic1的低尼古丁含量烟草资源。

结论：利用上述三个共显性标记既可简便、快捷、稳定地检测烟草nic1存在，又可清晰地鉴定出基因高尼古丁含量的纯合基因型nic1nic1和杂合基因型nic1nic1及低尼古丁含量的纯合基因型nic1nic1，也可有针对性、特异性的选择因含隐性纯合基因型nic1nic1而具有低尼古丁含量的烟草材料并极大提高具有低尼古丁含量烟草品种的选育效率。

sequencelisting

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120>一种与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性ssr标记及其应

用

<130>2020

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>321

<212>dna

<213>tm22038-01

<400>1

caccatggtttggctttcatcttttgcagtgctttagcagagcactaatagatgacaaag60

aaagttctacacgaataattactttacttgtatgttgtggtgagggttaagttaaagtag120

tagaagacagagtaagacagtgacacattgaaagagagagagagagagagagagagagag180

agagagagagagagagagagagagagagagagagtggaagtggaaggtgatgtctcacaa240

gataagagctgcctaactgacactgttacataggagaaacaaaaggaaaaacatcaacgc300

gattgcctttttgcattttgc321

<210>2

<211>309

<212>dna

<213>tm22038-02

<400>2

caccatggtttggctttcatcttttgcagtgctttagcagagcactaatagatgacaaag60

aaagttctacacgaataattactttacttgtatgttgtggtgagggttaagttaaagtag120

tagaagacagagtaagacagtgacacattgaaagagagagagagagagagagagagagag180

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