一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及酶活性检测技术领域，尤其是一种细胞外abl1激酶活性检测试剂盒。

背景技术：

非受体酪氨酸激酶abl1广泛存在于哺乳动物各种组织细胞中，通过介导底物蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰，参与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、dna损伤修复、炎症反应、肿瘤发生形成等生命过程的调控。在正常生理条件下，abl1的激酶活性受到严谨调控，被多种细胞因子、氧化应激或dna损伤应激激活后的abl1激酶活性大大提高，通过定位于不同的细胞亚结构发挥不同的生理功能。bcr-abl融合蛋白在细胞信号转导以及转化过程中通过不断磷酸化和活化下游底物，促使各阶段粒细胞无限增殖和迁移，最终导致细胞生长失控，引发白血病。以它作为靶点来进行研究，使靶向治疗cml(慢性髓性白血病)显得非常有意义。

abl蛋白是由几个结构域共同组成的一个非受体型酪氨酸激酶，它包括n端结构域(ncap)、sh2结构域、sh3结构域、一段连接序列和c末端的激酶结构域(ptk)，正是其中这段激酶结构域使得abl蛋白具有酪氨酸激酶的活性。完整的abl1蛋白较大，表达较为困难。

患者体内abl1蛋白发生的一些突变使得cml的治疗变得有些困难。目前已开发出一些基于abl1蛋白的抑制剂，包括伊马替尼(imatinib)，尼洛替尼(nilotinib)，博舒替尼(bosutinib)等，均对abl1蛋白有很好的抑制作用，但由于蛋白一些位点的突变，使得部分患者产生耐受现象。另一方面，在体内的研究中往往周期长，而且体内生物环境的复杂性也为abl1抑制剂的研发设置了巨大的阻碍。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明提供了一种细胞外abl1激酶活性检测试剂盒，其可以用于高通量、大规模地筛选abl1激酶的活性抑制剂。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种细胞外abl1激酶活性检测试剂盒，包括以下试剂：atp、abl1底物多肽、反应缓冲液，以及abl1蛋白或abl1激酶结构域(ptk)对应的多肽片段。

作为上述方案的进一步优化，所述abl1底物多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。

作为上述方案的进一步优化，所述abl1激酶结构域对应的多肽片段为ptk的全部或部分。需要说明的是，abl蛋白是由几个结构域共同组成的一个非受体型酪氨酸激酶，它包括n端结构域(ncap)、sh2结构域、sh3结构域、一段连接序列和c末端的激酶结构域(ptk)，其中正是这段激酶结构域(ptk)使得abl蛋白具有酪氨酸激酶的活性，由于abl1整个蛋白较大，表达较为困难，因此，本发明的检测试剂盒可以选择ptk结构域相应的多肽，但是不限于ptk结构域相应的多肽，还可以选择包括ptk结构域以及其相邻的结构域的多肽片段，或者是整个abl1蛋白。

作为上述方案的进一步优化，所述abl1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如seqidno.2所示。需要说明的是，本发明经多次实验证实，采用如seqidno.2或3所示的多肽用于筛选abl1激酶的活性抑制剂都是有效的。

作为上述方案的进一步优化，所述abl1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如seqidno.3所示。需要说明的是，本发明的试剂盒可以选择seqidno.2所示的多肽，或seqidno.3所示的多肽，还可以同时选择seqidno.2和3所示的多肽。

作为上述方案的进一步优化，所述反应缓冲液包括hepes、mgcl2、dtt和bsa。

作为上述方案的进一步优化，所述hepes的浓度为50mmol/l，所述的浓度为10mmol/l，所述dtt的浓度为2mmol/l，所述bsa的浓度为0.1％(w/w)。

作为上述方案的进一步优化，所述hepes的ph为7.3。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供了上述试剂盒在筛选abl1的活性抑制剂中应用。

作为本发明的又一个方面，本发明还提供了一种abl1激酶的活性抑制剂，所述抑制剂为小檗碱。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明abl1激酶活性检测试剂盒操作简便、有效，可以在细胞外高通量地检测abl1激酶的活性，从而用于大规模地筛选abl1激酶活性的抑制剂。

附图说明

图1是abl1激酶反应原理示意图；

图2是本发明的abl1激酶活性检测试剂盒的检测原理示意图；

图3是sds-page实验结果图；

图4是小檗碱抑制abl1激酶活性的标准曲线；

图5是采用abl1蛋白片段序列1检测小檗碱抑制abl1激酶活性的结果图；

图6是采用abl1蛋白片段序列2检测小檗碱抑制abl1激酶活性的结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种体外的abl1激酶活性检测方法和试剂盒，其可以用于高通量，大规模的筛选abl1活性的抑制剂。

本发明的abl1激酶活性检测试剂盒涉及以下反应原理：

如图1所示，abl1能催化atp上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质酪氨酸残基上，使其残基磷酸化，从而激活底物，通过一系列反应影响细胞的生长、增殖和分化。激酶反应发生时，可以使atp转变为adp，这样就可以根据atp的减少量来定量abl1激酶的活性。如图2所示，luciferin和atp反应后，在氧气的催化下和底物(luciferase)反应，产生荧光，通过检测荧光就可以检测atp的含量。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度；如无特别说明，本发明中的试剂、材料、细胞等均可从市场上或其它公开渠道获得。

实施例1

本发明的细胞外abl1激酶活性检测试剂盒的一种实施例，包括以下组分：

(1)atp；

(2)abl1底物多肽，其氨基酸序列为：eaiyaapfakkk(seqidno.1)；

(3)abl1蛋白片段序列1，其氨基酸序列如下：

eyllssgingsflversesspgqrsislryegrvyhyrintasdgklvssesrfntlaelvhhhstvadglittlhypapkrnkptvygvspnydkwemertditmkhklgggqygevyegvwkkysltvavktlkedtmevddflkeaavmkeikhpnlvqllgvctreppfyiitefmtygnlldylrecnrqevnavvllymatqissameylekknfihrdlaarnclvgenhlvkvadfglsrmtgdtytahagakfpikwtapeslaynkfsiksdvwafgvllweiatygmspypgidlsqvyellekdyrmerrpegcpekvyelmracwqwnpsdrpsfaeihqafetmfqessisdevekelgkqgvrgavstllqapelptktrsrraaehrdttdvpemphsk(seqidno.2)；

(4)abl1蛋白片段序列2，其氨基酸序列如下：

mgsshhhhhhssglvprgshmgpsendpnlfvalydfvasgdntlsitkgeklrvlgynhngewceaqtkngqgwvpsnyitpvnslekhswyhgpvsrnaaeyllssgingsflvresesspgqrsislryegrvyhyrintasdgklyvssesrfntlaelvhhhstvadglittlhypapkrnertditmkhklgggqygevyegvwkkysltvavktlkedtmeveeflkeaavmkeikhpnlvqllgvctreppfyiitefmtygnlldylrecnrqevnavvllymatqissameylekknfihrdlaarnclvgenhlvkvadfglsrlmtgdtytahagakfpikwtapeslaynkfsiksdvwafgvllweiatygmspypgidlsqvyellekdyrmerpegcpekvyelmracwqwnpsdrpsfaeihqafetmfqess(seqidno.3)；

(5)反应buffer：50mmol/lhepes(ph7.3)，10mmol/lmgcl2，0.1％bsa，2mmol/ldtt。

实施例2实施例1中abl1蛋白片段序列1和2的制备

1)质粒的转化和摇瓶培养

1：将表达ptk结构域的pet-28a(+)，kan质粒1μg加入100μlarcticexpression(de3)感受态细菌中，置于冰上20min；

2：42℃热激90sec，迅速置冰中3min；加入600μllb培养液；

3：37℃，220rpm振摇培养1h，取200μl菌液涂布于含50μg/mlkan的lb平板，37℃倒置培养过夜；

4：次日早晨挑取平板上的单克隆接种于含50μg/mlkan的4mllb培养液的试管中，37℃220rpm振摇培养至下午1点左右，od约0.6；

5：按1：250比例，接种于100μg/mlkan的1llb培养液中，37℃220rpm振摇至菌体od600为0.5-0.6(约3h)；

6：1l发酵培养基中加入诱导剂iptg至终浓度为1mm，220rpm37℃培养3小时；

7：5000rpm，5min离心去上清收集发酵菌体，-20℃保存待破碎纯化。

2)菌体破碎和蛋白复性纯化

1.超声破碎菌体，试剂和条件如下：

破菌缓冲液：20mmtris，500mmnacl，ph8.0；

破碎条件：350w功率，破碎4s，间隔6s，共120循环；6000rpm，15min离心收集沉淀；

2.检测到蛋白表达后形成包涵体，因此需要进行包涵体(在蛋白纯化过程中产生)的洗涤，采用如下试剂和条件：

包涵体洗涤液：50mmtris，50mmnacl，5mmedta，1％triton-x-100，ph8.5；

洗涤条件：350w功率，破碎4s，间隔6s，共60循环；6000rpm，15min离心收集沉淀。

3.包涵体增容，采用如下试剂和条件：

包涵体增容液：0.1mtris，6mgua-hcl，25mmdtt，1mmedta，ph8.0(10ml)。室温温和搅拌2小时，然后用hcl调ph至3.0-4.0，然后12000rpm,20min离心收集上清；

4.将增容上清透析至6murea，10mmhclph3.0-4.0中，透析过夜；然后12000rpm，20min离心收集上清；

5.将离心收集到的上清按照体积比1:50逐滴加入复性液：20mm乙醇胺，1mmedta，1mm半胱氨酸，2mm胱氨酸，ph11.0中。每隔32小时再逐滴加入跟第一次一样体积的复性液，一共再加3次，复性液4℃放置；

6.将复性好的蛋白透析至20mmtris，0.3mnacl，ph8.0中，中途换液2次；

7.ni-imac纯化，采用如下试剂和条件：

透析好的蛋白进行镍柱纯化平衡液：20mmtris，500mmnacl，ph8.0，洗脱液：20mmtris，500mmnacl，500mmimidazole，ph8.0。按20mm/200mmimidazole的梯度进行洗脱，根据吸收峰值收集洗脱液。

对上述纯化所得蛋白进行sds-page实验，实验结果如图3所示，图3左边65kd大小的片段为实施例1中abl1蛋白片段序列1，图4右边52kd大小的片段为实施例1中abl1蛋白片段序列2，结果显示，abl1蛋白片段序列1和abl1蛋白片段序列2的纯度都很高，达到90％以上。

实施例3采用实施例1的试剂盒检测小檗碱抑制abl1激酶的效果

小檗碱抑制abl1激酶活性的检测方法，包括如下反应步骤：

1、药物处理组每孔中依次加入1μl小檗碱，小檗碱浓度依次为(0.2，4，8，10μmol/l，1ulabl1激酶底物多肽(30ngeaiyaapfakkk)以及5ulatp(2μmol/l),1ulabl蛋白片段(30ng，seqidno.2或seqidno.3相应的多肽)；

2、每组设3个复孔。30℃孵育20min后，每孔加入10μl荧光素酶及底物的混合物，在酶标仪上测化学发光数值。

根据检测得到的发光数值，绘制了相应的标准曲线，标准曲线如图4所示；采用abl1蛋白片段序列1检测得到的药物抑制活性结果如图5所示，采用abl1蛋白片段序列2检测得到的药物抑制活性结果如图6所示。

上述实验结果表明：小檗碱可以浓度依赖性的抑制abl1蛋白激酶的活性，abl1蛋白片段序列1和abl1蛋白片段序列2检测得到的结果相似，说明两个序列(seqidno.2或seqidno.3)的蛋白都可以有效地进行蛋白激酶的活性检测。本发明的abl1激酶活性检测试剂盒可以在细胞外高通量的检测abl1激酶的活性，abl1蛋白片段序列1和abl1蛋白片段序列2都具有很强的蛋白酪氨酸激酶活性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>广州安镝声生物医药科技有限公司

<120>一种细胞外abl1激酶活性检测试剂盒及其应用

<130>2020

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

glualailetyralaalaprophealalyslyslys

1510

<210>2

<211>415

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

glutyrleuleuserserglyileasnglyserpheleuvalgluarg

151015

sergluserserproglyglnargserileserleuargtyrglugly

202530

argvaltyrhistyrargileasnthralaseraspglylysleuval

354045

sersergluserargpheasnthrleualagluleuvalhishishis

505560

serthrvalalaaspglyleuilethrthrleuhistyrproalapro

65707580

lysargasnlysprothrvaltyrglyvalserproasntyrasplys

859095

trpglumetgluargthraspilethrmetlyshislysleuglygly

100105110

glyglntyrglygluvaltyrgluglyvaltrplyslystyrserleu

115120125

thrvalalavallysthrleulysgluaspthrmetgluvalaspasp

130135140

pheleulysglualaalavalmetlysgluilelyshisproasnleu

145150155160

valglnleuleuglyvalcysthrarggluproprophetyrileile

165170175

thrgluphemetthrtyrglyasnleuleuasptyrleuargglucys

180185190

asnargglngluvalasnalavalvalleuleutyrmetalathrgln

195200205

ileserseralametglutyrleuglulyslysasnpheilehisarg

210215220

aspleualaalaargasncysleuvalglygluasnhisleuvallys

225230235240

valalaasppheglyleuserargmetthrglyaspthrtyrthrala

245250255

hisalaglyalalyspheproilelystrpthralaprogluserleu

260265270

alatyrasnlyspheserilelysseraspvaltrpalapheglyval

275280285

leuleutrpgluilealathrtyrglymetserprotyrproglyile

290295300

aspleuserglnvaltyrgluleuleuglulysasptyrargmetglu

305310315320

argargprogluglycysproglulysvaltyrgluleumetargala

325330335

cystrpglntrpasnproseraspargproserphealagluilehis

340345350

glnalaphegluthrmetpheglngluserserileseraspgluval

355360365

glulysgluleuglylysglnglyvalargglyalavalserthrleu

370375380

leuglnalaprogluleuprothrlysthrargserargargalaala

385390395400

gluhisargaspthrthraspvalproglumetprohisserlys

405410415

<210>3

<211>450

<212>prt

<213>人工序列

<400>3

metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalpro

151015

argglyserhismetglyprosergluasnaspproasnleupheval

202530

alaleutyraspphevalalaserglyaspasnthrleuserilethr

354045

lysglyglulysleuargvalleuglytyrasnhisasnglyglutrp

505560

cysglualaglnthrlysasnglyglnglytrpvalproserasntyr

65707580

ilethrprovalasnserleuglulyshissertrptyrhisglypro

859095

valserargasnalaalaglutyrleuleuserserglyileasngly

100105110

serpheleuvalargglusergluserserproglyglnargserile

115120125

serleuargtyrgluglyargvaltyrhistyrargileasnthrala

130135140

seraspglylysleutyrvalsersergluserargpheasnthrleu

145150155160

alagluleuvalhishishisserthrvalalaaspglyleuilethr

165170175

thrleuhistyrproalaprolysargasngluargthraspilethr

180185190

metlyshislysleuglyglyglyglntyrglygluvaltyrglugly

195200205

valtrplyslystyrserleuthrvalalavallysthrleulysglu

210215220

aspthrmetgluvalgluglupheleulysglualaalavalmetlys

225230235240

gluilelyshisproasnleuvalglnleuleuglyvalcysthrarg

245250255

gluproprophetyrileilethrgluphemetthrtyrglyasnleu

260265270

leuasptyrleuargglucysasnargglngluvalasnalavalval

275280285

leuleutyrmetalathrglnileserseralametglutyrleuglu

290295300

lyslysasnpheilehisargaspleualaalaargasncysleuval

305310315320

glygluasnhisleuvallysvalalaasppheglyleuserargleu

325330335

metthrglyaspthrtyrthralahisalaglyalalyspheproile

340345350

lystrpthralaprogluserleualatyrasnlyspheserilelys

355360365

seraspvaltrpalapheglyvalleuleutrpgluilealathrtyr

370375380

glymetserprotyrproglyileaspleuserglnvaltyrgluleu

385390395400

leuglulysasptyrargmetgluargprogluglycysproglulys

405410415

valtyrgluleumetargalacystrpglntrpasnproserasparg

420425430

proserphealagluilehisglnalaphegluthrmetpheglnglu

435440445

serser

450