检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物、试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种检测树鼩nf-κb基因转录水平的引物、试剂盒及方法。

背景技术：

nf-κb（核因子κb）参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，是细胞内重要的转录因子。其水平的异常上调将导致多种疾病的发生，是炎症与免疫反应的重要影响因子。

急性肾损伤（aki）以肾功能突然恶化为特征，可通过血清肌酐（scr）或少尿的增加来诊断。aki与心血管疾病、慢性肾脏疾病（ckd）和终末期肾脏疾病（esrd）的风险增加以及死亡率增加相关。据报道，大约一半的脓毒症患者会发生aki，并将死亡率提高六到八倍。tlr4的激活使nf-κb通路敏感，这与启动促炎性细胞因子il-1β、il-6和tnf-α的表达有关。tlr4/nf-κb途径的激活已被确定为肾脏炎症的主要诱因。此外，已经证实抑制tlr4/nf-κb介导的炎症反应对lps诱导的aki具有肾脏保护作用。抑制tlr4/nf-κb途径的可能机制包括靶向核因子κb激酶抑制剂和抑制其他酶。高尿酸血症将会引起肾损伤，所以研究尿酸对nf-κb的影响具有意义。

文献报道中对nf-κb的研究主要集中在其结构、序列、功能上，对转录水平的检测方法的研究国内外未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测树鼩nf-κb基因转录水平的引物、试剂盒及方法，以在转录水平上对nf-κb基因进行定量检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

检测树鼩nf-κb基因转录水平的引物，包括树鼩nf-κb基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩gapdh基因的特异性上、下游引物；

其中，树鼩nf-κb基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：

nf-κbf：5＇-cagaaattgggcctggggat-3＇；

nf-κbr：5＇-ttcagtgtggcccatctgtc-3＇；

作为内参基因的树鼩gapdh基因的特异性上、下游引物序列如下：

gapdhf：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；

gapdhr：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。

本发明同时提供含有上述检测树鼩nf-κb基因转录水平的引物的试剂盒。

本发明还提供上述引物、试剂盒在非诊断目的检测树鼩nf-κb基因转录水平的应用。

本发明另外提供用于非诊断目的检测树鼩nf-κb基因转录水平的方法，包括如下步骤：

步骤（1），分别以健康和待测树鼩新鲜肾脏组织提取的总rna为模板，逆转录合成得树鼩肾脏组织cdna第一链；

步骤（2），建立树鼩gapdh基因及nf-κb基因标准曲线：以easydilution梯度稀释步骤（1）得到的健康树鼩肾脏组织cdna第一链，分别以未稀释cdna第一链及稀释后的cdna为模板，进行实时荧光定量检测，并分别以nf-κbf和nf-κbr、gapdhf和gapdhr为特异性引物，进行实时荧光定量pcr扩增，分别得到健康树鼩nf-κb基因、gapdh基因的溶解曲线和扩增曲线；

之后以起始模板量拷贝数log10的对数值为x轴，以ct值为y轴进行绘制，分别得到gapdh基因、nf-κb基因的标准曲线；

步骤（3），将步骤（1）得到的待测树鼩肾脏组织cdna第一链分别以nf-κbf和nf-κbr、gapdhf和gapdhr为特异性引物，进行实时荧光定量pcr扩增，扩增体系和扩增程序与步骤（2）相同，分别得到待测树鼩nf-κb基因、gapdh基因的溶解曲线和扩增曲线；

之后根据步骤（2）得到的标准曲线进行计算，得到树鼩nf-κb基因转录水平。

基于实时荧光定量检测的原理，即每个模板的cq值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：cq=-1/lg(1+ex)*lgx0+lgn/lg(1+ex)（n为扩增反应的循环次数，x0为初始模板量，ex为扩增效率，n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。）起始拷贝数越多，cq值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代cq值。因此，获得未知样品的cq值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。所以根据步骤（2）得到的标准曲线和每个样品的cq值，利用bio-radcfxmanager3.1软件中自带的基因表达计算功能就能得到树鼩nf-κb基因转录水平。

进一步，优选的是，以easydilution梯度稀释步骤（1）树鼩肾脏组织cdna第一链，梯度稀释倍数分别为5倍、25倍、125倍、625倍。

进一步，优选的是，实时荧光定量pcr扩增体系下：sybrpremixextaqii(2x)5μl，上、下游引物各0.4μl，cdna模板0.8μl，去离子水3.4μl，总计10μl，上、下游引物浓度均为10μm。

进一步，优选的是，实时荧光定量pcr扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s、60℃退火30s、40个循环。

在检测时，当溶解曲线上峰不唯一时，则说明实验中存在污染，需要重新进行检测。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明适用于实时荧光定量pcr检测。应用本发明所公开的引物序列可实现对树鼩gapdh基因及nf-κb基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本发明的引物可对树鼩nf-κb基因转录水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好。本发明为研究树鼩nf-κb基因的功能及影响因素提供了有效工具。

附图说明

图1树鼩gapdh基因的扩增曲线；

图2树鼩gapdh基因的标准曲线；

图3树鼩nf-κb基因的扩增曲线；

图4树鼩nf-κb基因的标准曲线；

图5树鼩gapdh基因的表达扩增曲线；

图6树鼩gapdh基因的表达熔解峰；

图7树鼩nf-κb基因的表达扩增曲线；

图8树鼩nf-κb基因的表达熔解峰；

图9树鼩nf-κb基因的表达相对表达；

图10树鼩nf-κb基因扩增产物胶图，m：maker；1~4为四只不同的树鼩扩增产物胶图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。

1、本实施例中所使用的实验动物：树鼩，雌性9只，雄性10只。

2、实验动物的分组及给药：将做过空白血清检测的19只树鼩取出1只雄性树鼩待取肾脏组织做标准曲线，剩余18只树鼩随机分成对照组、30天给药组，120天给药组，各6只。雌雄各半，雌性体重均在110g~135g，雄性体重均在120g~150g。对照组每日腹腔注射（ip）质量浓度为1％羧甲基纤维素钠溶液（cmc-na，1g羧甲基纤维素钠溶于100ml去离子水）40mg/kg，给药时间为120天，给药组以同样剂量ip注射氧嗪酸钾（oa），给药时间分别为30天和120天。

3、实验方法

3.1大鼠肾脏组织的采集

取肾脏组织置于rna助溶剂（tripure，roche公司）用于nf-κb基因转录水平的检测。

3.2肾脏总rna的提取

19只动物都取新鲜肾脏0.1g于匀浆器中，加入1mltripure在室温下充分匀浆，静置5min，再将其转移至1.5mlep管中静置5min，加入200μl-20℃预冷的氯仿，漩涡震荡充分，静置15min后4℃、12000r/min离心25min，吸取上清液450μl于另一只1.5mlep管中，等体积加入-20℃预冷的异丙醇，充分混匀静置10min，4℃、12000r/m离心10min，弃上清液，待管内壁稍干，加1ml-20℃预冷的体积百分浓度为75%乙醇洗涤沉淀，4℃、7500r/m离心5min，弃上清液，待管内壁稍干，加入30μldepc水溶解沉淀，65℃水浴10min，所提取的总rna样品取1μl经nanodrop-1000超微量核酸测定仪测定浓度及吸光度比值。测定浓度后加depc水稀释至1000ng/μl，放入-80℃冰箱备用。

3.3cdna的合成

按照逆转录试剂盒primescript™rtreagentkit说明操作，每30μl体系中依次加入5×primescriptbuffer6μl，primescriptrtenzymemix1.5μl，oligodtprimer1.5μl，random6mers1.5μl，总rna(浓度稀释为1000ng/μl)3μl，rnasefreedh2o16.5μl，逆转录条件为：37℃15min，85℃5s，4℃10min。

3.4目的基因引物的设计

根据ncbi基因库中树鼩的nf-κb和gapdh的基因序列，利用引物设计软件pimerexpress5.0分别进行引物设计，经上海生工公司合成，gapdh作为内参基因。

3.5本实施例树鼩nf-κb基因表达水平定量用引物序列及片段大小见表1.

表1

3.6目的基因荧光定量pcr反应体系的确定

按takara生物有限公司产品pcr试剂（sybrpremixextaqii），在实时荧光定量仪cfx96real-timesystem上进行扩增和数据分析，pcr扩增体系如下：sybrpremixextaqii(2x)5μl，上、下游引物各0.4μl，cdna模板0.8μl，去离子水3.4μl，总计10μl，上、下游引物浓度均为10μm；进行下列pcr扩增：95℃预变性30s，95℃变性10s、60℃退火30s、40个循环。

其中，所扩增的树鼩nf-κb基因片段的核苷酸序列如seqidno.5所示；所扩增的树鼩内参基因gapdh片段的核苷酸序列如seqidno.6所示。

3.7树鼩gapdh基因及nf-κb基因标准曲线的建立：以easydilution梯度稀释步骤3.3逆转录合成的未给药树鼩肾脏cdna第一链，分别依次对其5倍、25倍、125倍、625倍稀释，以原始cdna第一链及稀释后的cdna为模板，各做2个平行样进行实时荧光定量检测，按步骤3.6荧光定量pcr体系进行实时荧光定量pcr。实时荧光定量检测的原理，即每个模板的cq值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：ct=-1/lg(1+ex)*lgx0+lgn/lg(1+ex)（n为扩增反应的循环次数，x0为初始模板量，ex为扩增效率，n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。）起始拷贝数越多，cq值越小。基于以上原理，利用bio-radcfxmanager3.1软件可得到nf-κb基因和gapdh基因的溶解曲线和标准曲线。

3.8样品基因表达差异分析

根据步骤3.7得到的nf-κb基因和gapdh基因标准曲线和每个样品的cq值，利用bio-radcfxmanager3.1软件中自带的基因表达计算功能就能得到树鼩nf-κb基因转录水平。

4结果

4.1树鼩nf-κb基因荧光定量pcr反应的溶解曲线

由图8和图10可见，在nf-κb基因扩增过程中荧光定量pcr反应的溶解曲线仅见单独的峰，反应产物的电泳结果仅见一条特异性表达条带，表明扩增的目的片段特异性良好。

4.2树鼩nf-κb基因和gapdh基因的标准曲线

由图2和图4可见，树鼩nf-κb基因和gapdh基因的标准曲线r²均接近1，说明以此标准曲线进行相对定量较准确，由于荧光强度均较强，故能保证荧光强度的增加与pcr的扩增相对同步，能准确检测pcr的表达，以gapdh为内源控制物，得到mrna表达水平的变化。

4.3氧嗪酸钾所致的高尿酸血症树鼩肾脏组织nf-κbmrna表达水平的变化的定量检测

步骤2各组所获得的新鲜肾脏组织所提取的rna，反转录得cdna，经实时荧光定量pcr检测，可得各组nf-κbmrna表达水平差异，腹腔注射40mg/kg剂量的氧嗪酸钾，nf-κb在肾脏的mrna表达水平，对照组为1.1，30天给药组为1.0，较对照组下调。120天给药组为1.3，较对照组上调；见图9。

4.4氧嗪酸钾（oa)是尿酸酶抑制剂，能通过抑制尿酸酶活性，减少尿酸的分解与排泄，使尿酸值升高，可造成树鼩高尿酸血症，在灵长类动物造模中运用较多，用于上述实施例可使nf-κbmrna表达上调；说明本发明可用于nf-κbmrna表达水平的检测，为研究树鼩nf-κb基因的功能及影响因素提供了有效工具，为高尿酸血症等疾病的研究提供可靠手段。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

seqidno.1

cagaaattgggcctggggat20

seqidno.2

ttcagtgtggcccatctgtc20

seqidno.3

agccccatcaccatcttcc19

seqidno.4

aatgagccccagccttctc19

seqidno.5

cagaaattgggcctggggatacttaataatgccttccggcttagccctgccccttcaaaa60

acactgatggacaactacgaggtctccgggggaacagtcagagagctggtggaggccctg120

agacagatgggat133

seqidno.6

ggcacagtcaaggctgagaatgggaagctggtcatcaacgggaaacccatcaccatcttc60

caggagcgagatcccgctaacatcaaatggggtgatgctggtgctgagtatgtcgtggag120

tctactggcgtcttcaccaccat143

序列表

<110>中国医学科学院医学生物学研究所

<120>检测树鼩nf-κb基因转录水平的引物、试剂盒及方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

cagaaattgggcctggggat20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

ttcagtgtggcccatctgtc20

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<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

agccccatcaccatcttcc19

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<400>4

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<212>dna

<213>人工序列()

<400>5

cagaaattgggcctggggatacttaataatgccttccggcttagccctgccccttcaaaa60

acactgatggacaactacgaggtctccgggggaacagtcagagagctggtggaggccctg120

agacagatgggat133

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<213>人工序列()

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ggcacagtcaaggctgagaatgggaagctggtcatcaacgggaaacccatcaccatcttc60

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